基因芯片技術(shù)及其在畜牧獸醫(yī)業(yè)中的應(yīng)用概述

陸 曼 李博巖 王旭平 柳誠(chéng)剛 譚 斌 楊汝才

(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 貴陽 550025)

1 基因芯片技術(shù)的發(fā)展歷史

基因芯片(gene chip)亦稱DNA芯片，主要是指通過平面微細(xì)加工技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微流體分析單元和系統(tǒng)，用以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)及其他生物組分的快速、準(zhǔn)確、大信息量檢測(cè)。隨著人類基因組計(jì)劃(HGP)的實(shí)施，基因芯片應(yīng)運(yùn)而生，該技術(shù)是繼大規(guī)模集成電路之后的又一次具有深遠(yuǎn)意義的科學(xué)技術(shù)創(chuàng)新。

基因芯片的原型是在20世紀(jì)80年代中期出現(xiàn)的，它依據(jù)計(jì)算機(jī)半導(dǎo)體芯片制作技術(shù)中晶體管集成在芯片上這一原理，將寡核苷酸分子集成在芯片上而制成[1～2]。Bains等[3]運(yùn)用雜交的方法將短的DNA片斷固定在支持物上，并借助雜交原理對(duì)其序列進(jìn)行了測(cè)定?；蛐酒嬲龔膶?shí)驗(yàn)室走向工業(yè)化得益于照相平板印刷技術(shù)與探針固相原位合成技術(shù)的結(jié)合以及激光共聚焦顯微技術(shù)。這些技術(shù)的引入使數(shù)以萬計(jì)的高密度探針分子的合成與固定成為可能，而激光共聚焦顯微掃描技術(shù)也有可能讓雜交信號(hào)的準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)、靈敏的檢測(cè)和分析成為現(xiàn)實(shí)。1990年，美國(guó)Affmetrix公司的Fodor等通過實(shí)驗(yàn)把一種光敏材料涂布在硅芯片表面，通過光蝕刻技術(shù)原位合成了多肽鏈。在此基礎(chǔ)上，F(xiàn)odor等進(jìn)行了技術(shù)改進(jìn)，最終率先合成了DNA陣列。1997年，斯坦福大學(xué)Brown實(shí)驗(yàn)室研制出了世界上第一張全基因組芯片。此芯片是酵母全基因組芯片，具有6166個(gè)基因，它的研制成功開創(chuàng)了基因芯片技術(shù)應(yīng)用的先河。

1970年以后，隨著基因組學(xué)、生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)等新興學(xué)科的迅猛發(fā)展及人們消費(fèi)觀念的改變，動(dòng)物育種目標(biāo)由單一的常規(guī)育種向分子與常規(guī)聯(lián)合育種轉(zhuǎn)變，肉用性能相關(guān)基因的篩選成為研究熱點(diǎn)?；蛐酒盁晒舛縋CR技術(shù)的出現(xiàn)為肉牛肉質(zhì)性狀的系統(tǒng)研究提供了強(qiáng)有力的手段[1]。

2 基因芯片簡(jiǎn)介

2.1 基因芯片的原理 基因芯片是建立在雜交測(cè)序技術(shù)和基因探針上的一種高效快速的核酸序列分析工具。雜交測(cè)序是基因芯片的測(cè)序原理。此方法是將大量的基因探針高密度地、有序地排列在一塊1～2 cm2大小的載體上, 隨后用標(biāo)記的待測(cè)樣品與之雜交, 通過分析檢測(cè)雜交信號(hào)的分布及強(qiáng)度便可以獲得樣品中待測(cè)DNA的各種數(shù)據(jù)。

2.2 基因芯片的類型 基因芯片可以分為三種類型：①用聚合物基片(硝酸纖維膜或尼龍膜等)制成的芯片。這種芯片的核酸探針或cDNA片段被固定在聚合物基片表面上，檢測(cè)時(shí)同位素標(biāo)記的靶基因與其雜交，之后采用放射顯影技術(shù)進(jìn)行分析檢測(cè)。此方法的優(yōu)點(diǎn)是可以方便地使用目前分子生物學(xué)常用的放射顯影技術(shù)及其所需檢測(cè)設(shè)備，檢測(cè)技術(shù)比較成熟；缺點(diǎn)是芯片上的探針密度不高，要使用大量的試劑和樣品，不完全適合于定量檢測(cè)。②用玻璃板作為探針的載體制成的芯片。這種芯片的DNA探針陣列是用點(diǎn)樣法固定在玻璃板上的，檢測(cè)時(shí)將熒光標(biāo)記的靶基因與玻璃板上探針進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)雜交分子的熒光數(shù)據(jù)，便可獲得靶基因的相關(guān)資料。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是大大提高了探針的密度，有利于獲得比較高的檢測(cè)精度；缺點(diǎn)是批量化和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)方面仍有較多困難。③用玻璃或其他硬質(zhì)材料薄片作為探針的載體制成的芯片。這種基因芯片的寡核苷酸探針陣列可在載體表面上直接合成，檢測(cè)時(shí)將熒光標(biāo)記的靶基因與寡核苷酸探針雜交，并進(jìn)行后續(xù)的熒光檢測(cè)，便能獲得靶基因的各種數(shù)據(jù)。此方法是把DNA化學(xué)合成技術(shù)與微電子光刻技術(shù)相結(jié)合，優(yōu)點(diǎn)是大大提高了基因芯片探針的密度，可以進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)，有很大的發(fā)展空間。

2.3 基因芯片的優(yōu)點(diǎn) 基因芯片有以下優(yōu)點(diǎn)[4]: ①使在同一條件和時(shí)間下需要多次處理的遺傳分析能快速完成，有很強(qiáng)的類比性；②細(xì)胞、組織、血液等的基因表達(dá)信號(hào)的定量、定性分析可以在同一張芯片上獲得, 并還可以實(shí)現(xiàn)時(shí)間與空間上、全局檢測(cè)靜態(tài)到動(dòng)態(tài)的差異及遺傳信息的檢測(cè)，有很大的信息產(chǎn)出率；③有較強(qiáng)專一性和高度的敏感性，可以精準(zhǔn)和可靠測(cè)定10 pg/μL 的DNA 樣品；④尼龍膜制作的微陣列, 可重復(fù)進(jìn)行多達(dá)20 次雜交實(shí)驗(yàn)，有很好的重復(fù)使用性；⑤已有的芯片面積最小的僅有1 cm2, 最大的也不超過525 cm2，所以每個(gè)陣列中DNA樣品的用量較少，反應(yīng)體積和試劑用量也相應(yīng)地大大減小, 但反應(yīng)效率卻提高了百倍，有利于實(shí)現(xiàn)測(cè)量的自動(dòng)化和微型化；⑥基因芯片技術(shù)容易與其他技術(shù)相互交叉使用。

2.4 基因芯片技術(shù)的操作流程 生物芯片技術(shù)操作流程主要包括四個(gè)步驟：①芯片方陣的構(gòu)建：將玻璃片或硅片作表面處理，并將蛋白質(zhì)分子或DNA片段按順序排列在芯片上；②樣品的制備：獲取生物樣品中的DNA、蛋白質(zhì)或RNA并對(duì)其做標(biāo)記，可以大大提高檢測(cè)的靈敏度(一般情況下，待測(cè)材料不能直接與芯片反應(yīng)，只有少數(shù)的特殊樣品除外)；③生物分子反應(yīng)：芯片檢測(cè)的關(guān)鍵是芯片上的生物分子之間的反應(yīng)，應(yīng)當(dāng)選擇最合適的反應(yīng)條件，使生物分子間反應(yīng)條件處于最佳狀況，從而使生物分子之間的錯(cuò)配比率大大降低；④芯片信號(hào)的檢測(cè)：將芯片置入芯片掃描儀中是常用的芯片信號(hào)檢測(cè)方法，掃描后便可獲得有關(guān)生物信息。

3 基因芯片在畜牧獸醫(yī)業(yè)中的應(yīng)用

3.1 牲畜基因表達(dá)水平的檢測(cè) 對(duì)于基因的保守片段設(shè)計(jì)了多對(duì)完全與之匹配的寡核苷酸探針(PM)以及相應(yīng)的中心單堿基錯(cuò)配的寡核苷酸探針(MM)，將它們固定在芯片的相鄰位置上，便可用來對(duì)標(biāo)記的樣品靶序列進(jìn)行雜交探測(cè)。陽性情況下(正常完全匹配)，PM的雜交信號(hào)明顯強(qiáng)于MM的雜交信號(hào)；而假陽性時(shí)(錯(cuò)配)，兩者的雜交信號(hào)差異不明顯。所以，PM / MM(PM與MM的信號(hào)比值)可作為衡量陽性的指標(biāo)，當(dāng)某一基因三條以上探針呈陽性時(shí)，可定性判斷閑逛基因的表達(dá)。而通過比對(duì)異常和正常樣品雜交信號(hào)，則可檢測(cè)不同樣品中基因表達(dá)水平的變動(dòng)趨勢(shì)。

這方面的研究已有不少報(bào)道。朱正茂等[2]以杜洛克豬胎兒骨骼肌5個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的背最長(zhǎng)肌作樣本研究其基因表達(dá)譜，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行聚類分析，獲得了骨骼肌發(fā)育的變動(dòng)信息。Lin等[5]運(yùn)用由9182個(gè)cDNA探針構(gòu)成的基因表達(dá)譜芯片對(duì)杜洛克和桃園豬骨骼肌表達(dá)譜進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)杜洛克豬中與轉(zhuǎn)率調(diào)控蛋白、肌原纖維蛋白、能量代謝酶相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，解釋了杜洛克在出生后比桃園豬具有更高的肌肉增長(zhǎng)率的作用機(jī)制。Ushizawa等[6]根據(jù)牛肝臟cDNA序列制備了代表2059個(gè)?；虻男酒z測(cè)了妊娠?；蜣D(zhuǎn)錄差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在懷孕第27～28 d時(shí)大多肝臟基因被誘導(dǎo)表達(dá)。Yao等[7]用卵母細(xì)胞cDNA文庫建立了基因芯片，為卵泡發(fā)育和早期胚胎發(fā)育機(jī)理的研究提供了有力的工具。張國(guó)梁[8]等利用基因芯片技術(shù)構(gòu)建了中國(guó)草原紅牛公牛與閹牛差異基因表達(dá)譜。

3.2 獸藥篩選和新獸藥的開發(fā) 基因芯片技術(shù)可以用來鑒定和分離藥物的有效成分，解決了目前獸藥產(chǎn)業(yè)開發(fā)遇到的重要困難。很多獸藥是直接或者間接地通過改變、修飾動(dòng)物基因的表達(dá)或基因表達(dá)產(chǎn)物的功能而生效。所以，可通過基因芯片技術(shù)分析動(dòng)物機(jī)體用藥前后的不同器官、組織基因表達(dá)的差異，從眾多藥物成分中篩選出真正起作用的組分物質(zhì)?；蛐酒夹g(shù)在藥物篩選方面有著巨大的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樵摷夹g(shù)具有大規(guī)模、高通量、平行性地分析基因表達(dá)的能力。利用基因芯片技術(shù)作大規(guī)模的篩選研究可以縮短藥物篩選所用時(shí)間，節(jié)約大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，降低風(fēng)險(xiǎn)和費(fèi)用，大大提高效率。

3.3 畜禽疾病的診斷 伴隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，動(dòng)物傳染病的流行變得更加復(fù)雜，畜禽疾病的診斷和防治也隨之更加困難。傳統(tǒng)的診斷方法雖然可靠，但是每次只能檢測(cè)一種病原; 而生物芯片能一次檢測(cè)多種病原，而且具有需要樣品量少、特異、靈敏、快速和費(fèi)用低廉的優(yōu)勢(shì)。

基因芯片在該領(lǐng)域的應(yīng)用研究的報(bào)道很多。美國(guó)科羅拉多大學(xué)與疾病控制和預(yù)防中心研發(fā)的“M 基因芯片”，采用流感病毒基因模版，可快速檢測(cè)各種流感病毒，其中包括H5N1 型高致病性禽流感病毒，可輕易將H5N1 型禽流感病毒與普通感冒病毒相區(qū)分。陳鳳梅等[9]應(yīng)用RT- PCR或PCR方法分別獲得雞禽流感、新城疫、雞傳染性支氣管炎等14 種家禽疾病的病原核酸特異性片斷，并以這些片斷為探針，采用接觸式電樣技術(shù)制成低密度的DNA 陣列芯片，同時(shí)成功檢測(cè)了這14 種禽類傳染病，驗(yàn)證了該新穎DNA 陣列芯片的良好檢測(cè)效果。

3.4 園林觀賞動(dòng)物的DNA 測(cè)序 HGP計(jì)劃的實(shí)施促進(jìn)了高效的自動(dòng)化測(cè)序方法的發(fā)展，基因芯片利用固定探針與樣品之間分子雜交產(chǎn)生的雜交譜而排列出待測(cè)樣品的序列，此測(cè)序法比傳統(tǒng)的Sanger雙脫氧鏈終止法快速且前景誘人。

例如，美國(guó)Affymetrix 公司于1998 年生產(chǎn)的帶有13.5萬個(gè)基因探針的芯片，使人類DNA 的解碼速度比原來提高了25 倍。Mark chee 等[10]用帶有13.5萬個(gè)寡核苷酸探針陣列測(cè)定了全長(zhǎng)為16.6 kb 的人線粒體基因組，其準(zhǔn)確率高達(dá)99%。Hacia等[11]也曾用含4.8 萬個(gè)寡核苷酸的高密度微陣列分析了人與黑猩猩BRCA1 基因序列的不同，發(fā)現(xiàn)在該基因外顯子中的部分核酸序列同源性為 83.5%～98.2%之高 ，揭示了兩者在進(jìn)化上的高度一致性。

3.5 尋找牲畜新基因 研究表明，在序列信息缺乏的條件下，可采用基因芯片技術(shù)尋找新基因。Chitko-McKown等[12]研究了牛巨噬細(xì)胞基因用脂蛋白(LPS)處理過后表達(dá)的變化情況。他們將人的基因芯片與反轉(zhuǎn)錄的牛巨噬細(xì)胞基因的cDNA進(jìn)行雜交，發(fā)現(xiàn)有44個(gè)基因的表達(dá)存在差異，其中有18個(gè)基因是牛的巨噬細(xì)胞新基因。Dvorak等[13]在研究豬腸黏膜的派伊爾氏淋巴集結(jié)功能的分子機(jī)制時(shí)采用了基因芯片技術(shù)。研究表明在3687個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)中出現(xiàn)了2414個(gè)特異核苷酸序列，其中至少有371個(gè)基因是新基因。Schena等[14]將熱休克作用和佛波酯處理的T 細(xì)胞的cDNA與包含1056 個(gè)cDNA的芯片雜交, 得到了4個(gè)新基因。

3.6 畜禽高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗性等基因的篩選及優(yōu)良雜種后代選育 畜禽的基因型決定不同性狀的表型，是由單一或眾多基因相互協(xié)同作用的結(jié)果。畜禽高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等性狀可能是質(zhì)量性狀也可能是數(shù)量性狀。通過分子生物學(xué)方法，已經(jīng)找到了很多由單一基因控制的性狀，但其對(duì)于鑒定由多基因控制的多態(tài)性變化與畜禽表型的關(guān)系，以及發(fā)現(xiàn)更多的有用基因則顯得無能為力。通過采用基因芯片技術(shù)使快速發(fā)現(xiàn)具有重要應(yīng)用價(jià)值的新基因以及研究基因表達(dá)的多態(tài)性成為可能，為傳統(tǒng)分子生物學(xué)研究提供了新的工具和思路。通過制作全基因組芯片，可以在多樣本大群體中快速識(shí)別與相關(guān)性狀和功能有關(guān)的特殊功能基因，從而為物種改良、新品種選育、加快育種進(jìn)程提供理論基礎(chǔ)。

在育種過程中選擇優(yōu)良雜種后代，最困難的一步是從大量的雜交組合群體中篩選具有目的基因的優(yōu)良雜合體或者純合體，從而選育出具有優(yōu)良性狀或者符合育種目的的目標(biāo)個(gè)體。利用基因芯片技術(shù)，可簡(jiǎn)化傳統(tǒng)的育種程序，通過制作帶有篩選目的基因的芯片，采集分離出來的畜禽基因，不再需要通過繁雜的辛勤的育種工作和長(zhǎng)時(shí)間的選擇，就可以實(shí)現(xiàn)從雜種后代中篩選出優(yōu)良個(gè)體，并育成新品種的過程。因此，通過基因芯片技術(shù)，可以改變傳統(tǒng)育種工作模式，使畜禽遺傳育種工作變得簡(jiǎn)單、高效、快速、精確。

李艷華等[15]采用基因芯片技術(shù)以及其他相關(guān)技術(shù)，篩選出了與豬群的鮮肉產(chǎn)品的感觀質(zhì)量及其加工性狀、胴體組成、脂肪的質(zhì)量性狀(包括脂肪含量、嫩度、肉色、肌纖維直徑、大理石紋等)等肉質(zhì)性狀相關(guān)的遺傳效應(yīng)和主基因關(guān)聯(lián)十分明顯的遺傳標(biāo)記。

4 展望

基因芯片技術(shù)多學(xué)科及相關(guān)技術(shù)融合的結(jié)果，已經(jīng)廣泛用于基因表達(dá)研究、基因診斷、發(fā)現(xiàn)新基因、基因組研究及各種病原體的診斷等領(lǐng)域。當(dāng)前，應(yīng)用該技術(shù)成本還比較高，因此推廣應(yīng)用受到一定的局限。但隨著計(jì)算機(jī)處理軟件的進(jìn)一步開發(fā)利用，基因芯片技術(shù)的不斷發(fā)展，基因芯片的成本會(huì)越來越低，基因芯片一定會(huì)得到越來越多的應(yīng)用。相信在不久的將來，基因芯片技術(shù)一定會(huì)成為畜牧業(yè)研究的常規(guī)手段，為畜牧業(yè)發(fā)展助力。