松針提取物α—蒎烯對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞miR—221及其下游靶基因表達(dá)的影響

楊杰波+李明+謝菁菁+楊夢(mèng)蝶+盧昕爍+王芳+陳偉強(qiáng)

[摘要]為探討松針提取物α-蒎烯的抗肝癌作用及機(jī)制，該實(shí)驗(yàn)首先使用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)α-蒎烯對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響，然后選取與G₂/M期調(diào)控相關(guān)的miR-221，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)α-蒎烯干預(yù)對(duì)其表達(dá)的影響，同時(shí)通過(guò)TargetScan等在線生物信息學(xué)軟件分析miR-221的靶基因，最后對(duì)相關(guān)靶基因的表達(dá)用定量PCR進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，α-蒎烯呈劑量依賴性抑制HepG2細(xì)胞增殖，可阻滯細(xì)胞于G₂/M期（P<0.05），顯著下調(diào)HepG2細(xì)胞內(nèi)miR-221的表達(dá)（P<0.05），生物信息學(xué)分析顯示CDKN1B/P27和CDKN1C/P57可能是miR-221的下游靶基因，熒光定量PCR顯示α-蒎烯處理后二者的表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.001，P<0.05）。上述結(jié)果表明，α-蒎烯可能通過(guò)阻滯細(xì)胞周期于G₂/M期從而發(fā)揮抗肝癌作用，其對(duì)G₂/M期的調(diào)控可能與下調(diào)miR-221表達(dá)和上調(diào)其靶基因CDKN1B/P27和CDKN1C/P57的表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]α-蒎烯； G₂/M期； miR-221

[Abstract]To investigate the anti-hepatoma mechanism ofα-pinene， HepG2 cell was treated withα-pinene and the change of cell cycle was examined by flow cytometry. The expression of miR-221， which was related the regulation of G₂/M phase， was detected by quantitative Real-time PCR. Meanwhile， TargetScan and other online bioinformatics methods were used to analyze and predict the target genes of miR-221， then the expression level of related target genes were detected by quantitative Real-time PCR. The results showed thatα-pinene inhibited the proliferation of HepG2 cells in dose-dependent manner. It was also proved that HepG2 cells were arrested at G₂/M phase byα-pinene （P<0.05）. The expression of miR-221 was down-regulated inα-pinene treated HepG2 cell. The bioinformatics analysis showed that CDKN1B/P27 and CDKN1C/P57 may be the protential targets of miR-221 and both of them were significantly up-regulated（P<0.001，P<0.05）byα-pinene treatment. According to these results， it was believed thatα-pinene may inhibit the proliferation of hepatocellular carcinoma cells through arrest the cell at G₂/M phase， which may be associated with the down-regulate of the miR-221 expression and up-regulate of the CDKN1B/P27 and CDKN1C/P57 expression.

[Key words]α-pinene； G₂/M phase； miR-221

doi：10.4268/cjcmm20162118

肝癌是影響人類健康的重大疾病，其治療一直是研究關(guān)注的焦點(diǎn)和難點(diǎn)。中醫(yī)認(rèn)為腫瘤本質(zhì)是惡毒，常用具有活血、解毒功效的藥物防治腫瘤^[1]。松針（pine needle）為松科松屬植物的葉，在《本草綱目》中記載其“無(wú)毒，入肝、腎諸經(jīng)，治各臟腫毒，強(qiáng)健肝、腎”，筆者據(jù)此推測(cè)其可能對(duì)肝癌具有治療作用，并在前期實(shí)驗(yàn)中證實(shí)該假說(shuō)^[2]。本課題組進(jìn)一步從松針中分離得到了松針主要成分α-蒎烯，并證實(shí)α-蒎烯在體內(nèi)具有一定的抗肝癌作用，可能是松針抗肝癌的主要活性成分^[3]。α-蒎烯屬于雙環(huán)單萜類化合物，具有碳碳雙鍵和碳環(huán)結(jié)構(gòu)，豐富的化學(xué)結(jié)構(gòu)使α-蒎烯能發(fā)生異構(gòu)化、氧化、氫化、加成、酯化、聚合等一系列化學(xué)反應(yīng)，深入研究α-蒎烯抗肝癌的作用機(jī)制是其開發(fā)利用的關(guān)鍵，因此本實(shí)驗(yàn)采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察α-蒎烯對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞細(xì)胞周期的影響，并根據(jù)結(jié)果利用定量PCR和生物信息學(xué)等方法，從分子水平進(jìn)一步研究了α-蒎烯對(duì)G₂/M期相關(guān)miR-221及其下游靶基因表達(dá)的影響，為進(jìn)一步闡明α-蒎烯抗肝癌機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

1 材料

AvantiTM J25 低速離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）；MCO-175 CO₂孵箱（日本SANYO公司）； MS 800顯微鏡（日本Olympus公司）；MJ Mini PCR 儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；CFX96TM實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；ELx800酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；BD Accuri C6流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基，胰酶（美國(guó)Hyclone公司）；碘化丙啶（美國(guó)Amresco公司）；焦碳酸二乙酯（DEPC，美國(guó)Sigma 公司）；Trizol試劑（美國(guó)Life Technologies公司）；Prime ScriptTM RT reagent kit 試劑盒，SYBR Premix ExTaqTM Ⅱ（日本TaKaRa公司）；蛋白核酸檢測(cè)儀 NanoDrop 2000 （美國(guó)Thermo公司）；（+）-α-蒎烯（純度98%，美國(guó)Sigma公司）；miR-221 引物Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Primer Set，U6 內(nèi)參引物U6 snRNA qRT-PCR Primer Set（廣州市銳博生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞購(gòu)自武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物冷藏中心，用含10%胎牛血清、1%青鏈雙抗的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃，5% CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于試驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞周期分析

HepG2細(xì)胞3×105個(gè)/孔接種到6孔板中，待細(xì)胞貼壁后更換新鮮培養(yǎng)液，設(shè)置對(duì)照組和不同濃度α-蒎烯處理組（使α-蒎烯終濃度分別為16，32，64 μmol·L^-1），24 h后收獲細(xì)胞采用碘化丙啶染色法進(jìn)行細(xì)胞周期分析，主要步驟如下：收集細(xì)胞用70%乙醇4 ℃固定過(guò)夜后重懸于50 mg·L^-1碘化丙啶0.5 mL中，避光室溫保存30 min，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞DNA含量，分析G1，S，G₂/M期細(xì)胞百分率。

2.3 RNA提取

HepG2細(xì)胞同上方法處理，設(shè)置對(duì)照組和α-蒎烯處理組（終濃度為64 μmol·L^-1），細(xì)胞干預(yù)24 h后提取總RNA。主要步驟如下：吸掉培養(yǎng)基，PBS洗2次，加入1 mL Trizol，室溫靜置5 min后轉(zhuǎn)移到EP管中。每管中加入0.2 mL氯仿，劇烈振搖15 s，室溫靜置3 min后于4 ℃，12 000×g離心15 min。吸取上清轉(zhuǎn)移到新的EP管中，加入等體積異丙醇，室溫靜置10 min后4 ℃，12 000×g 離心10 min。棄上清，加入75%乙醇1 mL，輕柔混勻后于4 ℃，7 500×g 離心5 min。棄上清室溫干燥后加入20 μL無(wú)RNA酶雙蒸水，混勻后取1 μL于核酸蛋白儀上檢測(cè)RNA濃度和純度。樣品保存于-80 ℃?zhèn)溆?，用于后繼定量PCR試驗(yàn)。

2.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-221表達(dá)變化

2.4.1 cDNA的合成 先在EP管中加入RNA 2 μg和500 nmol·L^-1RT引物工作液，70 ℃孵育10 min，4 ℃孵育2 min，再加入5×PrimeScript Buffer 4 μL， PrimeScript RT Enzyme Mix 2 μL和RNase Free dH₂O，使終體積為20 μL， 42 ℃孵育60 min，70 ℃孵育10 min，得到cDNA。

2.4.2 實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增 于8連管中依次加入SYBR Green Mix 10 μL，RT產(chǎn)物2 μL，Bulge-Loopulge-LoopTM miRNA Forward Primer（5 μmol·L^-1） 和Reverse Primer（5 μmol·L^-1）各 0.5 μL，RNase-free H₂O 7 μL，混勻于Bio-Rad CFX96 實(shí)時(shí)定量PCR儀上擴(kuò)增，程序?yàn)?5 ℃10 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)。運(yùn)用Bio-Rad CFX Manager軟件分析結(jié)果，目的基因表達(dá)量采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

2.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)CDKN1B/P27和CDKN1C/P57表達(dá)變化

2.5.1 cDNA的合成 取無(wú)菌無(wú)酶200 μL EP管放在冰上，按TaKaRa公司Prime ScriptTM RT reagent kit 試劑盒說(shuō)明書依次加入RNA 1 μg，5×PrimeScript Buffer 4 μL， PrimeScript RT Enzyme Mix 1 μL和50 μmol·L^-1 Oligo dT Primer 1 μL，最后加入RNase Free dH₂O至20 μL?；靹蚝笾肞CR儀上37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

2.5.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Genebank上相關(guān)mRNA序列，采用Primer Express 310 軟件設(shè)計(jì)引物，并用BLAST檢測(cè)其同源性。引物由北京六合華大基因科技有限公式合成。引物序列見表1。

2.5.3 實(shí)時(shí)定量PCR 擴(kuò)增程序 按照SYBRPremix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒說(shuō)明書加入樣品，混勻后同上方法進(jìn)行擴(kuò)增和數(shù)據(jù)分析，目的基因的表達(dá)量采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

2.6 統(tǒng)計(jì)方法

采用GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行分析，以單因素方差分析比較組間差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。

3 結(jié)果

3.1α-蒎烯對(duì)HepG2細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

不同濃度α-蒎烯處理HepG2細(xì)胞24 h 后，使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布，可見各實(shí)驗(yàn)組G₂/M期細(xì)胞數(shù)量明顯增加，與空白組對(duì)比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2，說(shuō)明α-蒎烯可以抑制HepG2細(xì)胞的增值，使其阻滯于G₂/M期。

3.2α-蒎烯對(duì)HepG2細(xì)胞miR-221表達(dá)的影響

由于α-蒎烯干預(yù)后細(xì)胞主要阻滯于G₂/M期，且隨濃度增高而增高，因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步以64 μmol·L^-1的α-蒎烯干預(yù)HepG2細(xì)胞，觀察G₂/M期相關(guān)miR-221的表達(dá)變化。結(jié)果顯示64 μmol·L^-1α-蒎烯處理HepG2 24 h后，給藥組 miR-221的表達(dá)水平（0.53±0.12）遠(yuǎn)低于空白組（1.00±0.08），二者差異顯著（P<0.05），說(shuō)明α-蒎烯阻滯HepG2細(xì)胞于G₂/M期與調(diào)控miR-221的表達(dá)相關(guān)。

3.3 miR-221下游靶基因的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

miRNAs通過(guò)調(diào)節(jié)下游靶基因來(lái)發(fā)揮其調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)采用miRbase和TargetScan在線生物信息學(xué)軟件對(duì)miR-221的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示細(xì)胞G₂/M期調(diào)節(jié)蛋白CDKN1B/P27，CDKN1C/P57的非編碼區(qū)可與miR-221結(jié)合，提示二者可能作為miR-221的下游靶基因受其調(diào)節(jié)，見圖1。

3.4α-蒎烯對(duì)CDKN1B/P27和CDKN1C/P57表達(dá)的影響

64 μmol·L^-1α-蒎烯處理HepG2細(xì)胞 24 h后，CDKN1B/P27及CDKN1C/P57表達(dá)均明顯增高，與空白組比較有顯著性差異（P<0.05，P<0.001），見表3。

4 討論

近年來(lái)肝癌在全球尤其是我國(guó)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，統(tǒng)計(jì)顯示我國(guó)肝癌發(fā)病率和死亡人數(shù)均居世界首位。雖然肝癌的外科治療已經(jīng)取得長(zhǎng)足的進(jìn)步，但是化療仍然是中晚期肝癌患者的主要治療手段之一，開發(fā)高效低毒的抗肝癌藥物具有很重要的應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)意義。中藥具有療效獨(dú)特、毒副作用小等特點(diǎn)，因此從中藥中尋找具有抗肝癌作用的化合物，成為抗肝癌藥物開發(fā)和研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)松針“入肝經(jīng)”、“治腫毒、腫皰”等中醫(yī)理論，認(rèn)為松針有可能具有抗肝癌作用。前期的研究發(fā)現(xiàn)松針油在體外能顯著抑制肝癌細(xì)胞增殖，初步證實(shí)了筆者的科研假說(shuō)。本課題組還發(fā)現(xiàn)α-蒎烯是松針油的主要藥效成分，其在體內(nèi)也能明顯的抑制腫瘤的生長(zhǎng)。因此，深入探討并闡明其作用機(jī)制成為松針油及α-蒎烯進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。

細(xì)胞周期調(diào)控異常導(dǎo)致的細(xì)胞過(guò)度增殖是腫瘤發(fā)生的重要原因之一，阻滯或調(diào)控細(xì)胞分裂從而抑制癌細(xì)胞增殖是抗癌藥物的主要作用機(jī)制之一。本研究發(fā)現(xiàn)α-蒎烯作用后肝癌HepG2細(xì)胞被阻滯在G₂/M期，與本課題組前期在肝癌7402細(xì)胞株上得到的結(jié)果是一致的^[3]，說(shuō)明阻礙肝癌細(xì)胞G₂/M期分裂可能是α-蒎烯作用的關(guān)鍵所在，也是深入研究其作用機(jī)制的突破點(diǎn)。

miRNAs是一類具有調(diào)控基因表達(dá)功能的非編碼RNA，其通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)的方式導(dǎo)致靶mRNA降解或者阻遏靶mRNA翻譯，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄后沉默，從而影響細(xì)胞功能。miRNAs可以通過(guò)調(diào)控癌基因或抑癌基因的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的分裂、增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移，因此對(duì)miRNAs的影響成為探索抗癌藥物作用機(jī)制的新方法和重要途徑^[4-5]。細(xì)胞周期調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，目前已知有多個(gè)miRNAs和基因參與其中，其中miR-221是最關(guān)鍵的調(diào)節(jié)miRNAs之一^[6]。已有報(bào)道表明癌旁組織與良性肝組織相比，miR-221在肝癌組織中的表達(dá)升高^[7]，抑制miR-221的表達(dá)后，癌細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制，而增加miR-221的表達(dá)后則加速細(xì)胞的生長(zhǎng)。在肝癌中高表達(dá)的miR-221也有可能是通過(guò)抑制細(xì)胞周期蛋白CDKN1B/P27，CDKN1C/P57的表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌繁殖^[8]，因此通過(guò)抑制miR-221的表達(dá)有可能是抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的有效途徑之一。

CDKN1B/P27 基因作為一種細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子，CDKN1B/P27表達(dá)減少，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期失調(diào)，DNA合成增強(qiáng)，細(xì)胞過(guò)度增殖。CDKN1C/P57也是細(xì)胞內(nèi)一種十分重要的細(xì)胞周期調(diào)控因子，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)CDKN1C/P57表達(dá)減少時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖^[9]。由此可見，促進(jìn)CDKN1B/P27，CDKN1C/P57表達(dá)可以有效抑制癌細(xì)胞的增殖。

本實(shí)驗(yàn)證明，α-蒎烯可下調(diào)miR-221在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)以及上調(diào)CDKN1B/P27和CDKN1C/P57的表達(dá)，達(dá)到抑制癌細(xì)胞增殖的效果。至于CDKN1B/P27和CDKN1C/P57是否為miR-221的直接靶標(biāo)，尚需更深入的研究進(jìn)行確證。

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[責(zé)任編輯 陳玲]