應(yīng)用高效液相色譜—二極管陣列檢測器優(yōu)化棉花體內(nèi)多胺的測定方法

張一名??+劉玲玲+謝韞澤??+孫艷香+馮雪??賈永紅

摘要：應(yīng)用高效液相色譜-二極管陣列檢測器法（HPLC-DAD）對棉花體內(nèi)多胺測定時的流動相比例及流速、多胺全光譜信息等進行分析，重點比較2種常用檢測波長230、254 nm下的測定參數(shù)。最終確定檢測波長為230 nm、流動相體積比V甲醇 ∶[KG-3]V水=80 ∶[KG-3]20、流速為0.6 mL/min為最佳色譜條件。該方法有較好的準(zhǔn)確度、靈敏度，腐胺、亞精胺、精胺的回收率分別為98.58%、96.98%、99.62%，且非常穩(wěn)定。以此色譜條件為基礎(chǔ)測定棉花幼苗不同組織中多胺水平發(fā)現(xiàn)，葉片中3種多胺的含量明顯高于根、莖組織；此外，不同組織內(nèi)亞精胺含量最高。

關(guān)鍵詞：棉花；幼苗組織；多胺含量；高效液相色譜；二極管陣列檢測器

中圖分類號： S562.01文獻標(biāo)志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0328-04

多胺（polyamines，PAs）是一類含有多個氨基的長鏈脂肪族化合物，廣泛存在于生物體內(nèi)。在植物代謝途徑中，目前比較清楚的多胺形式主要有腐胺（putrescine，Put）、亞精胺（spermidine，Spd）、精胺（spermine，Spm）[1-2]。研究表明，多胺在植物體內(nèi)是一類重要的生長調(diào)節(jié)因子，參與植物的細(xì)胞分裂[3-4]、性別分化[5]、果實成熟與衰老[6]、逆境適應(yīng)[7-10]等重要生理過程。在分子水平的研究中還發(fā)現(xiàn)，多胺參與DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、膜穩(wěn)定、RNA和蛋白質(zhì)的翻譯[11]、DNA凝聚及激素的調(diào)控[12]等過程。另外，在人體中也存在大量多胺類物質(zhì)，并與人類健康息息相關(guān)[13]。由于植物性食物是人體內(nèi)多胺的重要來源之一[14]，因此，如何準(zhǔn)確而快速地檢測植物組織中的多胺技術(shù)越來越受到人們的重視。

多胺的測定以前主要用氨基酸分析儀、紙電泳等方法[15-16]，這2種檢測方法樣品回收率低，檢測靈敏度也不高。目前多用衍生化的方法，即將多胺的一、二級氨基接在鹵素原子上，另外還有接在熒光基團或?qū)ψ贤庥形盏幕鶊F上，再通過氣相（GC）或液相（HPLC）方法進行分離檢測。其中，氣相色譜剛剛應(yīng)用在植物多胺的研究方向，雖然分析時間短，但是對試樣要求高，前處理過程比較復(fù)雜[17]，并且應(yīng)用質(zhì)譜檢測設(shè)備價格昂貴，且分離檢測效果沒有顯著提高。自從1979年Redmond等采用苯甲?；姆椒ㄒ詠?，隨著不斷改進，高效液相色譜法已經(jīng)成為較為成熟的檢測植物體內(nèi)多胺的方法[18-21]。目前主要應(yīng)用熒光檢測器（FLD）、紫外吸收檢測器（UV）。其中，F(xiàn)LD法檢測多胺的主要優(yōu)勢在于靈敏度高[22]，但要用到有毒流動相乙腈。另外，由于瑞利散射、拉曼散射的干擾，使熒光檢測方法的條件構(gòu)建和優(yōu)化過程較為復(fù)雜，沒有一定的專業(yè)基礎(chǔ)較難完成。而紫外吸收法雖然靈敏度并不突出，但是可以用于植物體內(nèi)多胺含量的測定，加上流動相中的甲醇毒性較低、儀器成本較低等優(yōu)點，使得紫外吸收法成為當(dāng)今國內(nèi)用于測定植物多胺最常用的一種方法。

目前對于紫外吸收法檢測波長的選擇主要是苯甲酰氨基特征峰230 nm處、苯基特征峰254 nm處[15-16，18，23]。以上2種選擇對于多胺的檢測雖然都有一定的根據(jù)，但是對于檢測效果尚缺乏科學(xué)的比較。本研究應(yīng)用高效液相色譜-二極管陣列檢測器（HPLC-DAD）廣譜記錄光譜信息，同時針對棉花幼苗組織樣本特點比較230、254 nm 2種檢測波長的操作性、可靠性，最終優(yōu)化建立了可應(yīng)用于UV檢測器的棉花幼苗組織樣本中3種多胺的檢測方法，并依據(jù)該方法比較棉花幼苗根、莖、葉組織內(nèi)多胺含量的差異。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試棉花種子由廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院遺傳與育種研究所提供，為農(nóng)大棉7號。

1.2試驗方法

1.2.1棉花幼苗組織中多胺的提取取1.0～2.0 g棉花3葉期幼苗的不同新鮮組織，液氮研磨后加入4 mL預(yù)冷的5%高氯酸溶液，冰浴浸提1 h后離心（12 000 r/min，30 min，4 ℃）；取上清液為樣液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2樣品的苯甲酰化取500 μL樣液，加入10 mL離心管中，先后加入14 μL苯甲酰氯、1 mL 2 mol/L氫氧化鈉溶液，振蕩混勻后于37 ℃水浴反應(yīng)20 min；加入2 mL飽和氯化鈉溶液，混勻后用2 mL乙醚萃取，離心（1 500 r/min，5 ℃，5 min）后取1 mL乙醚相真空干燥，用100 μL甲醇溶解后，用0.22 μm孔徑有機相濾膜過濾，即可進樣[21]。

1.2.3色譜條件的優(yōu)化色譜儀：Agilent 1260 Infinity；色譜柱：[JP3]Agilent ZORBAX SB-C18 Stable Bond Analytical 4.6 mm×150 mm。

流動相與流速：綜合華永有等方法[22，24]，以甲醇、水混合物為流動相，測試甲醇體積分?jǐn)?shù)為50%～90%時不同流動相的色譜性能，每變化10%進樣測定1次，確定最佳流動相比例。通過比較流動相流速為0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL/min的檢測效果，確定最佳流速。

檢測波長：以二極管陣列檢測器收集190～900 nm區(qū)間內(nèi)的吸光度數(shù)據(jù)，重點比較多胺在230、254 nm下標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量、回收率、標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，%）、峰型，再結(jié)合3種多胺的光譜信息確定適合的檢測波長。

柱溫：30 ℃[21]。

時間：不限制。根據(jù)分析中雜質(zhì)的具體洗脫情況，設(shè)定合理的分析時間。

1.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作精確配制0.2 μmol/mL多胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，苯甲?；苌螅瑢?biāo)準(zhǔn)液稀釋為0.3、0.6、1.2、2.5、5.0、7.5、10.0 nmol/mL，取10 μL進樣；用安捷倫化學(xué)工作站（Agilent ChemStation）對230、254 nm信號數(shù)據(jù)進行分析，分別建立校正曲線。

1.2.5棉花葉片多胺回收率的測定取棉花葉片，抽提得到測定樣液，苯甲酰化衍生后取10 μL進樣測定，在230、254 nm 2個檢測波長和標(biāo)準(zhǔn)曲線下各自得到樣品中3種多胺的含量數(shù)據(jù)。再分別將3種不同濃度苯甲?；蟮亩喟窐?biāo)準(zhǔn)樣品加入到已知濃度的樣品多胺提取液中，并測定回收值[23]。根據(jù)樣品含量、加標(biāo)量和所測得回收值分別計算回收率及其標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.6棉花幼苗不同組織中多胺含量測定按照“1.2.1”“1.2.2”節(jié)中的相應(yīng)方法得到棉花幼苗根、莖、葉組織樣液，并進行衍生化。按照試驗最終確定的檢測條件，對棉花幼苗不同組織內(nèi)的3種多胺含量進行檢測，重復(fù)3次。

2結(jié)果與分析

2.1流動相條件的優(yōu)化

通過比較不同比例的流動相以及不同流速下多胺的檢測效果，發(fā)現(xiàn)流動相體積比V甲醇 ∶[KG-3]V水=80 ∶[KG-3]20、流速為 0.6 mL/min 時，多胺的分離度、信號峰型較好，且棉花葉片樣品中目標(biāo)峰信號與其他雜峰無明顯疊加；在此條件下，Put、Spd、Spm的保留時間分別約為5.09、9.30、17.75 min；并且，檢測樣液中存在的殘留苯甲酰氯峰（7 min左右）對檢測整體無影響（圖1）。

2.2檢測波長的確定

2.2.12種檢測波長下標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立與比較標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作在流動相體積比V甲醇 ∶[KG-3]V水=80 ∶[KG-3]20，流速為 0.6 mL/min，檢測波長分別為230、254 nm的色譜條件下進行。數(shù)據(jù)由安捷倫化學(xué)工作站（Agilent ChemStation）處理并分別建立校正表，回歸方程見表1。從試驗結(jié)果可知，230、254 nm檢測波長下多胺Put、Spd、Spm回歸方程的決定系數(shù)（r2）[CM（231]均大于[KG5]0.99，說明2種波長均能夠應(yīng)用于棉花幼苗組織[CM）]

內(nèi)多胺含量的測定；但是通過比較可以看出，波長為 230 nm 時回歸方程的r2均高于波長為254 nm下的r2。因此本研究表明，從標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)的角度考量，檢測波長為230 nm 要優(yōu)于254 nm。

2.2.22種檢測波長下回收率標(biāo)準(zhǔn)偏差的測定由表2可以看出，在230 nm檢測波長下，Put、Spd、Spm的平均回收率均在95%以上，分別為98.58%、96.98%、99.62%，RSD分別為1.56%、0.78%、0.95%。當(dāng)檢測波長為254 nm時，回收率均超過100.00%，且該檢測波長下RSD較高，分別為540%、9.49%、2.93%。說明當(dāng)檢測波長為254 nm時，盡管有較高的回收率，但是檢測數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性下降，檢測誤差增大。因此，從回收率RSD的角度評價可知：230 nm較254 nm更適合作為檢測波長測定棉花樣品中的多胺含量。

2.2.32種檢測波長下的峰型比較如圖2所示，比較230、254 nm下棉花幼葉等量程色譜圖可以發(fā)現(xiàn)：檢測波長為 230 nm 時，3種多胺的響應(yīng)值較大，雖然同時也增大了部分雜質(zhì)及副反應(yīng)的響應(yīng)峰值，但是目標(biāo)峰仍然明顯；254 nm作為檢測波長時，雖然雜質(zhì)響應(yīng)較小，但是3種多胺的信號響應(yīng)值同樣較低。

2.2.43種多胺的吸收光譜信息用二極管陣列檢測器（DAD）分別收集3種多胺信號峰在波長190～900 nm的光譜信息。由圖3可見，3種多胺在200 nm處有最高吸收峰，230 nm 左右均有明顯的第2吸收峰。由于多種物質(zhì)在 200 nm 處均存在光譜吸收峰，可使基線漂移嚴(yán)重，而在 230 nm 的第2吸收峰附近雜質(zhì)相應(yīng)明顯減少（圖4）。因此根據(jù)3種多胺各自的光譜信息分析可知：選擇檢測波長在230 nm左右的第2吸收峰要優(yōu)于其他波長。

[CM（24]綜上所述，棉花幼苗組織內(nèi)3種多胺含量的色譜檢測應(yīng)[CM）]

2.3分析時間的確定

在棉花幼葉樣品的不限時檢測中，保留時間在30～32 min 仍有不規(guī)則雜峰（圖2、圖4），而32 min后信號基本回歸基線。因此，為洗脫雜質(zhì)的同時保留完整數(shù)據(jù)，設(shè)定單針樣品的分析時間為35 min，且無后運行為宜。

2.4棉花幼苗不同組織的多胺含量比較

依據(jù)前期試驗結(jié)果得出：流動相體積比為V甲醇 ∶[KG-3]V水=80 ∶[KG-3]20、流速為0.6 mL/min、檢測波長為230 nm為最適合的色譜條件。對棉花根、莖、葉組織進行3種多胺含量的測定，結(jié)果表明，多胺在棉花幼苗組織中含量普遍偏少，響應(yīng)值較低，均在nmol/g水平。如表3所示，所測組織中Spd含量最高，在不同組織內(nèi)的含量均高于Put、Spm含量；另外，棉花幼苗葉片組織中的3種多胺總含量為（41.90±1.56） nmol/g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于根的（18.18±2.61） nmol/g、莖的（12.97±2.52） nmol/g。

3結(jié)論與討論

3.1色譜條件的優(yōu)化

以往研究表明，多胺的次級胺基與柱子硅羥基的相互作用，可引起在不同的流動相條件下，保留時間會產(chǎn)生較大變化[23]。本研究選擇流動相體積比V甲醇 ∶[KG-3]V水=80 ∶[KG-3]20，可以減少洗脫時間、降低分析時間。采用流速為0.6 mL/min，即可將樣品中各個組分比較清晰地分離開來。以上結(jié)果優(yōu)化了之前報道的相關(guān)方法[15，22，24]，得出了專門針對棉花幼苗組織內(nèi)多胺含量檢測的可靠色譜條件。

有報道顯示，衍生化過程中的苯甲酰氯殘留會對多胺色譜分析產(chǎn)生一定影響[24]。本試驗表明，Put、Spd、Spm的保留時間分別為5.09、9.61、17.75 min，苯甲酰氯的保留時間約為7.21 min，避免了苯甲酰氯、腐胺的峰重疊現(xiàn)象，并且3種多胺信號與組織樣品中其他雜峰信號互不干擾。

3.2檢測波長的比較

對于目前檢測多胺含量常用的2種檢測波長230、254 nm，筆者所在實驗室以二極管陣列檢測器收集190～900 nm 區(qū)間內(nèi)吸光度數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)：3種多胺檢測波長約為 230 nm 時，均為第2高吸收峰，且苯甲酰氨基的顯色受多胺脂肪鏈及其他副反應(yīng)雜質(zhì)的影響不大；而以254 nm作為檢測波長時，雖然雜質(zhì)響應(yīng)較小，但3種主要多胺的信號響應(yīng)值同樣較小，使標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)性等降低。因此，在多胺本底水平比較低的棉花幼苗上不適用254 nm波長，選擇 230 nm 波長為宜。

3.3優(yōu)化的方法以及所得檢測結(jié)果分析

如前文所述，最終確定最佳色譜條件：檢測波長為 230 nm，流動相體積比為V甲醇 ∶[KG-3]V水=80 ∶[KG-3]20，流速為 0.6 mL/min。

按照以上方法，棉花幼苗組織多胺含量檢測結(jié)果顯示，幼苗期棉花組織內(nèi)Spd含量在3種多胺中最高。該結(jié)果可能表明，在植株的快速生長期，Spd起一些重要的作用[25-26]。在棉花組培苗組織內(nèi)多胺的研究中，Spd在球形胚形成期含量顯著升高，明顯高于Put、Spm，報道中對這些現(xiàn)象的解釋是高水平Spd可能有助于細(xì)胞分化[27-28]，但是具體的代謝以及調(diào)控方式正在進一步研究中。

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[FK（H02642/3。54ZQ]

〖HTH〗更正：《江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)》2016年第44卷第6期338-340頁所刊論文《不同組合尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚的繁育比較》，第一作者應(yīng)該為黃培鈴，特此更正。