重慶巫溪煙區(qū)煙草赤星病病原鑒定

夏茜??+唐梅??陳益銀??

摘要：為明確重慶市巫溪煙區(qū)煙草赤星病病原菌的種類，從重慶市巫溪縣通城煙站不同田塊采集煙草赤星病典型病斑，分離病原菌并進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，分離到1株優(yōu)勢致病菌株Tb-wx-1，被證明是煙草赤星病病原菌，經(jīng)對致病菌株的rDNA-ITS 區(qū)序列進(jìn)行測序，確定為細(xì)極鏈格孢（Alternaria tenuissima），這是首次在重慶煙區(qū)發(fā)現(xiàn)細(xì)極鏈格孢引起煙草赤星病。

關(guān)鍵詞：重慶市；巫溪煙區(qū)；煙草赤星病；rDNA-ITS；細(xì)極鏈格孢

中圖分類號： S435.72文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0181-03

煙草屬于收獲葉片的作物，在我國經(jīng)濟(jì)中占有比較重要的地位。煙草病害發(fā)生后對煙葉產(chǎn)量與質(zhì)量影響很大，嚴(yán)重時會造成毀滅性的損失。目前，煙草赤星病是嚴(yán)重制約我國煙葉生產(chǎn)的一類真菌病害，該病具有潛育期短、暴發(fā)快的特點(diǎn)，在溫濕度適宜的條件下，短時間內(nèi)即可大面積流行，給煙葉生產(chǎn)造成巨大損失[1]。

煙草赤星病的病原屬半知菌亞門鏈格孢屬，其寄主范圍較廣，煙草、棉花、花生、大豆等均可被其侵染并產(chǎn)生病斑[2]。早在1892年就有研究人員將該病害病原命名為 Macrosporium longipes Ell. & Ev.。1928年Mason將其修改為Alternaria longipes （Ell. & Ev.） Mason[3]。1971年Lucas 提出Alternaria longipes 與 Alternaria alternata （Fr.） Keissler在形態(tài)上相同[4]。直到1998年張?zhí)煊畹戎鲝垖煵莩嘈遣【鷮W(xué)名確定為Alternaria alternata （Fr.） Keissler，并認(rèn)為鑒于其對煙草有明確的致病性，建議將其定名為鏈格孢煙草?；蚚Alternaria. alternata （Fr.） Keissler f. sp. nicotianae][5]。2004年彭希文等對云南地區(qū)的12株煙草赤星病菌菌株進(jìn)行鑒定，通過培養(yǎng)性狀及形態(tài)特征確定屬于長柄鏈格孢菌（A. longipes）和鏈格孢菌（A. alternata）[6]。2007年關(guān)博元對重慶多個煙區(qū)采集到的55株煙草赤星病菌菌株進(jìn)行鑒定，確定均為鏈格孢菌（A. alternata）[7]。2012年胡中會等對云南地區(qū)28份煙草赤星病菌菌株的rDNA-ITS序列進(jìn)行分析，經(jīng)鑒定確定屬于小孢子種[8]。2013年祖艷青等對河南煙區(qū)的赤星病病菌進(jìn)行鑒定，從形態(tài)學(xué)上鑒定為鏈格孢（A. alternata）、長柄鏈格孢（A. longipes）和鴨梨鏈格孢（A. yaliinficiens），其中首次報(bào)道了鴨梨鏈格孢（A. yaliinficiens）可以引起煙草赤星病[9]。

近幾年來，重慶巫溪煙區(qū)赤星病病害較為嚴(yán)重，烘烤期大量葉片發(fā)病，造成煙葉烘烤后不可用，減產(chǎn)嚴(yán)重。為確定巫溪煙區(qū)赤星病病原的種類，筆者采集田間發(fā)病病葉，對赤星病致病菌進(jìn)行室內(nèi)分離并進(jìn)行初步鑒定，為研究赤星病的發(fā)生規(guī)律、提出有效防治方法奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

2014年9月自重慶市巫溪縣通城煙站不同的田塊采集帶有煙草赤星病菌典型病斑的病葉，帶回實(shí)驗(yàn)室，并在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分離致病菌株。供試培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，瓊脂20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水定容至1 000 mL）。

1.2方法

1.2.1致病菌株分離樣品首先采用組織分離法[10]。選取帶有典型赤星病病斑的葉片，清水沖洗干凈后，在病健交界處切下0.2 cm×0.2 cm大小的組織塊，在75%乙醇中消毒 10 s，無菌水連續(xù)漂洗3次，再用滅菌濾紙除去多余水分，置于固體PDA培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)，待長出菌絲后作菌種純化用。

1.2.2致病菌株純化采用稀釋純化法[10]，取初分離的培養(yǎng)菌絲置于加入無菌水的離心管中振蕩，分離菌絲上的孢子，取1 μL進(jìn)行鏡檢，并調(diào)整其濃度，在PDA平板上加入20 μL已配制好的孢子懸浮液，涂板后于25 ℃恒溫培養(yǎng)。當(dāng)平板上形成單個菌落，挑取菌落轉(zhuǎn)接到新的PDA平板上培養(yǎng)以獲得分離物的純培養(yǎng)，純化的菌種于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3致病性測定采用離體組織接種法。將病原菌在PDA平板上于25 ℃恒溫培養(yǎng)后，用滅菌槍頭在菌落的邊緣打取菌餅。取K326煙草新鮮健康煙葉，用75%乙醇棉球?qū)θ~片表面消毒，無菌水沖洗3次。將菌絲塊貼于煙葉葉片背面，接種后的煙葉置于消過毒的保鮮盤內(nèi)，葉片處于保濕狀態(tài)，置于25 ℃室溫培養(yǎng)箱內(nèi)保濕培養(yǎng)12 d，觀察煙葉葉片發(fā)病情況。

1.2.4致病菌的形態(tài)學(xué)鑒定觀察致病菌在PDA平板上的菌落特征，顯微鏡下觀察菌絲體、分生孢子等的形態(tài)特征，對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.5致病菌的分子生物學(xué)鑒定采用CTAB法提取致病菌基因組DNA[11]。以基因組DNA 為模板，用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2結(jié)果與分析

2.1致病菌株的分離純化

于重慶市巫溪縣通城煙站不同的田塊采集帶有煙草赤星病菌典型病斑的病葉20份，帶回實(shí)驗(yàn)室，采用常規(guī)方法進(jìn)行病原菌分離，在25 ℃下培養(yǎng)至長出菌絲，經(jīng)純化后觀察培養(yǎng)性狀并鏡檢，篩選得到1株優(yōu)勢致病菌株，命名為Tb-wx-1，結(jié)果見圖1。經(jīng)平板培養(yǎng)，菌株菌落呈圓形，前期生長為白色菌落，后期顏色逐漸加深呈現(xiàn)黑褐色甚至黑色（圖1-A）；其分生孢子在顯微鏡下觀察結(jié)果見圖1-B，參照《中國真菌志》第十六卷描述[12]，確定分離得到的菌株屬于鏈格孢屬（Alternaria）。

2.2致病性測定

經(jīng)室內(nèi)接種K326的離體葉片，從接種點(diǎn)處逐漸擴(kuò)展，邊緣有黃色暈圈，葉片發(fā)病部分變黃（圖2），且從發(fā)病病斑再次分離到同一種菌株。

2.3致病菌株的分子生物學(xué)鑒定

2.3.1致病菌株rDNA-ITS序列多重比對采用CTAB法提取致病菌Tb-wx-1的基因組DNA，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行測序。將得到的測序結(jié)果在NCBI上采用Blast比對分析，結(jié)果如圖3所示，可見Tb-wx-1的序列與已報(bào)道的細(xì)極鏈格孢（Alternaria tenuissima）序列同源性最高，相似性達(dá)100%。在GenBank中下載已發(fā)表的部分鏈格孢rDNA-ITS 區(qū)序列Alternaria tenuissima（HQ647307.1）、Alternaria alternata（FJ717729.1）、Alternaria longipes（AY751457.1）、Alternaria yaliinficiens（HQ238276.1），使用ClustalX軟件將Tb-wx-1的序列與其進(jìn)行多重序列比對，然后將得到的比對結(jié)果采用Boxshade格式化。圖4結(jié)果顯示，這幾種rDNA-ITS 區(qū)序列相似度非常高，僅有幾個核苷酸不同，Tb-wx-1與細(xì)極鏈格孢（A. tenuissima）序列一致。結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，將該病原菌鑒定為細(xì)極鏈格孢（A. tenuissima）。這是首次在重慶煙區(qū)鑒定到細(xì)極鏈格孢（A. tenuissima）可以引起煙草赤星病。

[FL（2K2]2.3.2系統(tǒng)進(jìn)化分析在對以上序列進(jìn)行多重比對的基礎(chǔ)上，使用MEGA5.10軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖5所示，菌株Tb-wx-1與細(xì)極鏈格孢（A. tenuissima）同處系統(tǒng)發(fā)育樹的1個分支，遺傳距離最近；雖然與其他鏈格孢菌菌株的遺傳關(guān)系也較近，但并不與A. alternata、A. longipes聚為1支。

3討論與結(jié)論

赤星病作為煙葉生長后期重要的葉部真菌性病害，一旦暴發(fā)，對煙葉產(chǎn)業(yè)造成的損失巨大。因此，對其病原的種類進(jìn)行分析有助于煙區(qū)制定有針對性的防治措施。根據(jù)以前的報(bào)道，重慶市多個煙區(qū)采集到的煙草赤星病菌菌株均為鏈格孢菌（A. alternata）[7]，本研究通過對重慶市巫溪煙區(qū)赤星病致病菌的rDNA-ITS序列進(jìn)行測定和分析，最終鑒定為細(xì)極鏈格孢（A. tenuissima），在重慶地區(qū)屬于首次報(bào)道，為巫溪煙區(qū)開展該病害的防治提供了科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]高亭亭，蔣彩虹，羅成剛，等. Beinhart1000-1 抗赤星病基因的QTL 定位[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2014，20（2）：104-107.

[2]李巖，童治軍，焦芳嬋，等. 基于SSR標(biāo)記對33份煙草材料的聚類分析[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2013，33（10）：1972-1980.

[3]Mason E W. Annotated account of fungi received at the Imperial Bureau of Mycology，List Ⅱ （Fascicle Ⅰ）[M].London：CAB International，1928.

[4]Lucas G B. Alternaria alternata （Fries） Keissler，the correct name for A. tenuis and A. longipes[J]. Tobacco Science，1971，15（1）：37-42.

[5]張?zhí)煊?，陳偉? 關(guān)于煙草赤星病病原名稱的再思考[M]. 中國植物病理學(xué)會第六屆代表大會暨學(xué)術(shù)年會，1998：83-85.

[6]彭希文，劉光珍，楊永柱，等. 云南省煙草赤星病（Tobacco brown spot）病原研究及其防治藥劑的篩選[J]. 重慶：西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，22（2）：153-156.

[7]關(guān)博元. 重慶煙草赤星病菌種級地位及致病力分化研究[D]. 重慶：西南大學(xué)，2007：23-27.

[8]胡中會，趙立華，嚴(yán)恩平，等. 云南煙草赤星病菌及近似種 rDNA-ITS 序列分析[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，5（5）：670-676.

[9]祖艷青，蔣士君，王海濤，等. 河南省煙草赤星病病原鑒定[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2013，4（4）：73-77.[ZK）]

[10]方中達(dá). 植病研究方法[M]. 3版. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：122-140.

[11]陳鋒菊，李百元，楊冰，等. 一種經(jīng)濟(jì)快速提取絲狀真菌基因組DNA的方法[J]. 生命科學(xué)研究，2010，14（2）：122-124.

[12]張?zhí)煊? 中國真菌志：第十六卷——鏈格孢屬[M]. 北京：科學(xué)出版社，2003：1-18.