金蓮花初代培養(yǎng)探索

鄭志新??+范翠麗??+孫洪生

摘要：為了探討不同因素對金蓮花初代培養(yǎng)的影響，最終篩選金蓮花初代培養(yǎng)的最適外植體、滅菌處理及誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基，為金蓮花離體快繁和規(guī)?；?、工廠化育苗提供理論依據(jù)。以金蓮花葉片、葉柄、根頸和根為外植體，以乙醇和HgCl2為滅菌劑，以MS為基本培養(yǎng)基，通過不同濃度的6-BA和NAA配比，進行金蓮花初代組織培養(yǎng)研究。結(jié)果顯示，葉柄是金蓮花再生初代培養(yǎng)的最佳外植體，其通過愈傷組織誘導(dǎo)途徑建立再生體系，最佳的滅菌組合是75%乙醇滅菌10 s+0.1% HgCl2 滅菌4min，最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 8.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L；其次是根頸，以不定芽分化途徑為主，最佳滅菌組合為75%乙醇滅菌20 s+0.1% HgCl2 滅菌6 min，最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

關(guān)鍵詞：金蓮花；初代培養(yǎng)；滅菌處理；葉柄；根頸不定芽；愈傷組織；誘導(dǎo)培養(yǎng)基；工廠化育苗

中圖分類號： S682.19文獻標(biāo)志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0066-03

金蓮花（Trollius chinensis Bunge）屬毛茛科（Ranunculaceae）金蓮花屬（Trollius），別稱“金芙蓉”“金梅草”“旱蓮花”等，是稀有野生藥用植物，喜濕喜涼，多生長在海拔1 800～2 700 m 的疏林或山地，集中分布在河北、山西、內(nèi)蒙和東北等地，其中以河北承德地區(qū)所產(chǎn)金蓮花藥材質(zhì)量最佳[1-5]。近年來，人們逐漸認識到金蓮花的藥用價值和觀賞價值，對其大量采摘，再加上旅游、開荒、放牧等行為，金蓮花野生資源及其生境遭到了極大的破壞，價格逐年上漲。因此，對金蓮花進行引種馴化和人工栽培具有非常重要的意義。目前，金蓮花的人工栽培方法常見種子直播法和幼苗移栽法[6]。楊玉芳等采取實生播種進行金蓮花幼苗培育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)金蓮花幼苗死亡率很高，且幼苗苗期栽培管理困難，難以達到迅速培育優(yōu)質(zhì)種苗的目的[7]，而組織培養(yǎng)技術(shù)可以在短時間內(nèi)培育大量優(yōu)質(zhì)種苗[8-9]。本試驗對金蓮花的初代培養(yǎng)進行詳細的探索，以期為金蓮花的工廠化育苗、次生代謝物生產(chǎn)等提供理論及技術(shù)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

隨機選取在溫室播種的金蓮花幼苗（苗期3個月），種子購自河北承德。

1.2試驗時間及地點

試驗于2015年1—5月在河北北方學(xué)院組織培養(yǎng)實驗室進行。

1.3試驗方法

1.3.1金蓮花初代培養(yǎng)外植體的篩選將金蓮花幼苗從溫室取回，用清水沖洗干凈根部基質(zhì)后置于流水中沖洗2 h，再用洗衣粉水浸泡30 min，接著用流水沖洗4 h，將金蓮花幼苗分成葉片、葉柄、根頸和根4個部分，先用75%乙醇表面消毒 10 s，再用0.1% HgCl2滅菌6 min，無菌水沖洗干凈，接種于MS+4.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA的培養(yǎng)基上。

1.3.2滅菌劑及處理時間對金蓮花葉柄和根頸初代培養(yǎng)的影響外植體篩選出來的葉柄和根頸經(jīng)過清洗處理后，分別置于無菌瓶中，用75%乙醇和0.1% HgCl2的不同組合進行外植體表面滅菌，篩選最佳的滅菌處理時間組合。

1.3.3培養(yǎng)基組成對金蓮花葉柄和根頸初代培養(yǎng)的影響以MS為基本培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上添加不同濃度的6-BA和NAA，篩選葉柄愈傷組織誘導(dǎo)和根頸分化的最適培養(yǎng)基。

1.3.4培養(yǎng)基的制備和培養(yǎng)條件基本培養(yǎng)基中添加蔗糖30 g/L、瓊脂3.5 g/L，于121 ℃高溫滅菌20 min，滅菌前pH值調(diào)至5.8，培養(yǎng)室溫度控制在（25±2） ℃，光照14 h/d。

1.4試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

接種1周后統(tǒng)計污染率，2周后統(tǒng)計死亡率、成活率、愈傷組織誘導(dǎo)率和不定芽分化率等，記錄數(shù)據(jù)的同時觀察外植體生長狀況并拍照。污染率=污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%；成活率=成活外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%；死亡率=死亡外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%；愈傷組織誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)愈傷組織外植體數(shù)/成活外植體數(shù)×100%；分化率=分化根頸數(shù)/成活根頸數(shù)×100%。

所得數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 17.0進行統(tǒng)計、方差分析和多重比較（Duncans法）。

2結(jié)果與分析

2.1不同外植體的初代培養(yǎng)情況

將處理過的金蓮花幼苗分成葉片、葉柄、根頸和根4個部分，分別接種在MS+4.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA上，觀察其各自的變化情況。1周后，葉片有13.33%被污染，5000%死亡，只有16.67%有愈傷組織形成，且愈傷組織相對較多（圖1），其余的20%無生長表現(xiàn)，死亡葉片最初表現(xiàn)為顏色逐漸變黑，而后死亡；葉柄的污染率和死亡率與葉片相比相對較低，分別只有7.00%、24.00%，葉柄的愈傷組織誘導(dǎo)率較高，達到了52.00%，愈傷組織顏色發(fā)白，緊實度相對較差，稍顯疏松，但是愈傷組織相對很多（圖2）；葉片和葉柄均沒有不定芽分化。將根頸接入相同培養(yǎng)基，2周后只有435%出現(xiàn)污染，其余全部有新的不定芽萌發(fā)，但是沒有愈傷組織形成（圖3），可能因為根頸是作為完整植物存在的緣故。根系因為生長在基質(zhì)當(dāng)中，所含的雜菌較多，所以在相同的滅菌條件下，污染率較高，達到57.78%，但是死亡率也高，達到38.89%，其余的3.4%沒有任何生長表現(xiàn)（表1）。由此可知，葉柄是金蓮花初代培養(yǎng)的最佳外植體選擇，其次是根頸，葉片也可以考慮，而根系則不能使用。

2.2滅菌時間對金蓮花初代培養(yǎng)的影響

2.2.1滅菌劑及處理時間對金蓮花葉柄初代培養(yǎng)的影響通常情況下，75%乙醇和0.1% HgCl2結(jié)合是常用的外植體滅菌組合，不同的外植體因為其幼嫩程度和所攜帶雜菌的量不同而對具體的滅菌時間會有差別。由表2可知，在75%乙醇滅菌時間相同時，隨著0.1% HgCl2滅菌時間延長，污染率下降，死亡率增加。用75%乙醇滅菌10 s時，HgCl2滅菌 4 min 和 6 min 之間的差別不大，HgCl2滅菌4 min時成活率達到7800%，只比6 min多6.00百分點；而當(dāng)HgCl2滅菌時間達到8 min時，污染率為0，而死亡率達到了92.00%，說明HgCl2對幼嫩的葉柄有較強的毒害作用。同樣，當(dāng)HgCl2滅菌時間一致時，隨著75%乙醇表面滅菌時間的增加，葉柄污染率逐漸下降，滅菌死亡率逐漸增大，葉柄組織成活率逐漸下降，HgCl2滅菌時間為8 min，只有75%乙醇滅菌10 s的葉柄組織有成活，可知在75%乙醇和0.1% HgCl2的共同作用下，HgCl2的作用占主導(dǎo)地位。針對葉柄的組織培養(yǎng)，最佳的外植體處理組合為75%乙醇滅菌10 s+0.1% HgCl2滅菌 4 min，此時葉柄的污染率雖達到18.00%，但是死亡率最低，只有4.00%，成活率也最高，達到78.00%。

2.2.2滅菌劑及處理時間對金蓮花根頸初代培養(yǎng)的影響以根頸為外植體進行組織培養(yǎng)時，在75%乙醇處于相同處理時，隨著HgCl2滅菌時間的增加，根頸的污染率下降，死亡率增加，這與葉柄的表面滅菌效果是一致的；當(dāng)HgCl2滅菌時間一致時，隨著75%乙醇表明處理時間的延長，根頸同樣表現(xiàn)出與葉柄相同的變化趨勢（表3），可能是因為根頸底部有少量根系的存在使得其所攜帶的雜菌相對于葉柄偏多，所以根頸的最佳表面滅菌處理組合為75%乙醇20 s+0.1% HgCl2 6 min，此時的成活率達到了90.00%。

2.3培養(yǎng)基組成對金蓮花初代培養(yǎng)的影響

2.3.1培養(yǎng)基組成對金蓮花葉柄愈傷組織誘導(dǎo)的影響表4表明，將葉柄接種在以MS為基本培養(yǎng)基附加不同濃度 6-BA（4.0、8.0 mg/L）和NAA（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）培養(yǎng)基上，約1周后有白色愈傷組織形成，呈絮狀疏松態(tài)，10 d 左右愈傷組織逐漸增多，2周以后愈傷組織開始變黑。具體的愈傷組織誘導(dǎo)情況和葉柄傷口的規(guī)格有著非常重要的關(guān)系，葉柄粗壯，愈傷組織出現(xiàn)得早且多，葉柄細弱，愈傷組織不出現(xiàn)或是出現(xiàn)得相對晚，這可能和葉柄內(nèi)部所含營養(yǎng)物質(zhì)的量有關(guān)，而葉柄的長短對于愈傷組織誘導(dǎo)的影響不大。從表4可知，不同濃度的NAA對葉柄的初代培養(yǎng)有一定的影響，但與6-BA的結(jié)合效果則呈現(xiàn)出不一致的變化規(guī)律。當(dāng)6-BA 使用濃度為4.0 mg/L時，葉柄的愈傷組織誘導(dǎo)率在NAA為1.0 mg/L時達到最大，隨著NAA濃度的增大，愈傷組織誘導(dǎo)率開始下降，在NAA為2.0 mg/L時，愈傷組織誘導(dǎo)率只有25.00%，只有NAA1.0 mg/L的一半不到；當(dāng)6-BA的使用濃度為8 mg/L時，隨著NAA使用濃度的增大，愈傷組織誘導(dǎo)率也一直增加，在NAA為2.0 mg/L時，愈傷組織誘導(dǎo)率為85.00%，此時6-BA/NAA的值是一樣的，說明細胞分裂素和生長素的比例及使用濃度對于愈傷組織的誘導(dǎo)都具有重要的影響，因此MS+8.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA是葉柄愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基。

2.3.2培養(yǎng)基組成對金蓮花根頸初代培養(yǎng)的影響生長素和細胞分裂素的配合使用，對芽的誘導(dǎo)效果好于細胞分裂素的單獨作用，也好于生長素的單獨作用，即在一定濃度的細胞分裂素（或生長素）的基礎(chǔ)上，添加一定濃度的生長素（或細胞分裂素），對于不定芽的誘導(dǎo)，即根頸的分化有一定的促進作用，因為生長素可促進腋芽的生長，細胞分裂素可以促進細胞分裂和器官分化[10]。當(dāng)NAA濃度為0.1 mg/L時，隨著 6-BA 濃度的增加，根頸分化率逐漸下降，可見低濃度的6-BA對于根頸的分化具有促進作用；而當(dāng)NAA濃度為 0.5 mg/L，隨著6-BA濃度的增加，根頸分化率增加，這與NAA 濃度為0.1 mg/L時的結(jié)果正好相反（表5），可見6-BA/NAA的值對于根頸的分化比各自的使用濃度作用更關(guān)鍵，因此根頸分化的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+01 mg/L NAA。

3結(jié)論與討論

3.1結(jié)論

在植物的離體快繁過程中，初代培養(yǎng)的建立是快繁的第1步。在金蓮花的初代培養(yǎng)過程中，葉柄是最佳的外植體，其次是根頸；因葉柄和根頸的組織幼嫩程度及所攜帶雜菌的差異[CM（25]，各自的滅菌處理組合表現(xiàn)不同，其中葉柄以75%乙醇滅[CM）]

2滅菌6 min效果最佳；同時二者的分化途徑也有明顯的差異，葉柄以愈傷組織誘導(dǎo)途徑為主，最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 8.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L，而根頸以不定芽分化途徑為主，最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

3.2討論

3.2.1外植體的選擇及滅菌對試驗效果的影響選擇葉片、葉柄、根頸和根系分別作為外植體進行初代培養(yǎng)，在對其進行滅菌時，發(fā)現(xiàn)影響污染率的主要原因在于：如果滅菌時間短，只能鈍化部分細菌；如果滅菌時間長，雖大部分細菌可被滅死，同時植物組織也會被殺死，因此在滅菌這一環(huán)節(jié)，污染是最大的障礙[11]，克服這一矛盾也是控制污染率的有效途徑。在選定的4種外植體中，葉柄表面光滑，克服這一矛盾相對容易，具有較好的愈傷組織誘導(dǎo)效果，是最佳的外植體選擇，其次是根頸，雖滅菌較葉柄難度增加，但是作為1株完整的植株存在，有不定芽的分化且具有很高的成活率，可以作為外植體的補充存在。

3.2.2激素對愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化的影響一般認為，誘導(dǎo)愈傷組織或進行不定芽分化的關(guān)鍵條件在于培養(yǎng)條件，而培養(yǎng)條件中的激素是最為重要的，外源激素是植物愈傷組織誘導(dǎo)或不定芽分化中不可缺少的組成部分。通常情況下，生長素和細胞分裂素對保持愈傷組織的形成或不定芽的分化是非常必要的，尤其是二者有效結(jié)合時，對愈傷組織形成或不定芽誘導(dǎo)具有強烈的刺激作用[12]。本試驗以葉柄為外植體時，在6-BA濃度為4.0 mg/L時，NAA濃度為1.0 mg/L表現(xiàn)最好；在6-BA濃度為8.0 mg/L時，NAA濃度為 2.0 mg/L 表現(xiàn)最好，雖6-BA和NAA的濃度差異很大，在其愈傷組織誘導(dǎo)率上表現(xiàn)出不同的變化趨勢，但因其6-BA/NAA的濃度比值均為20，因此表現(xiàn)出最佳的愈傷組織誘導(dǎo)率。以根頸為外植體時，因其具有不同的器官分化途徑，對于6-BA和NAA的濃度也表現(xiàn)出不同的適應(yīng)性，以MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L為最佳的不定芽分化培養(yǎng)基，高濃度的細胞分裂素對其起抑制作用。

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