雞源志賀菌IpaC基因表達(dá)載體的構(gòu)建及其在畢赤酵母中的表達(dá)

韓志霞+馬金玉+王雪云+蔣大偉+劉芳+許蘭菊+李克宇

摘要：為使IpaC基因表達(dá)產(chǎn)物保持天然的生物學(xué)活性，實(shí)現(xiàn)在酵母表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)，本研究在不改變IpaC蛋白氨基酸序列的情況下，根據(jù)酵母密碼子偏愛性優(yōu)化合成IpaC#基因，分別構(gòu)建真核表達(dá)載體pGAPZαA-IpaC和pGAPZαA-IpaC#，然后將線性化重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X-33中，對陽性轉(zhuǎn)化子用SDS-PAGE及Western blot檢測其表達(dá)產(chǎn)物。結(jié)果表明，經(jīng)SDS-PAGE及Western blot檢測，僅在pGAPZαA-IpaC#/X-33重組菌表達(dá)產(chǎn)物菌體沉淀中檢測到大小為70 ku的目的蛋白，實(shí)現(xiàn)了雞源志賀菌IpaC# 基因在畢赤酵母中的胞內(nèi)表達(dá)，從而驗(yàn)證畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)與外源基因序列的相關(guān)性，為進(jìn)一步提高雞源志賀菌IpaC基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)提供科學(xué)依據(jù)，對研究該病的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

關(guān)鍵詞：雞源志賀菌；IpaC基因；畢赤酵母；優(yōu)化密碼子；pGAPZαA；真核表達(dá)

中圖分類號：Q786；S852.61 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0039-04

志賀菌可以感染多種物種，不僅是人，志賀菌還可以引起豬、鼠、狐貍、兔、牛等多種動物痢疾，其中以幼年動物患病率最高，嚴(yán)重的會導(dǎo)致死亡[1]。在志賀菌侵襲腸道過程中，毒力大質(zhì)粒上Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌的IpaC蛋白通過介導(dǎo)細(xì)胞骨架重排而使志賀菌趁機(jī)侵入腸上皮細(xì)胞，而且只有重組純化的IpaC蛋白才能夠在一定程度上恢復(fù)志賀菌的侵襲能力[2]。在分子水平上，IpaC蛋白不同結(jié)構(gòu)域具有不同生物學(xué)功能[3-5]。志賀菌對人的侵襲感染機(jī)制的研究比較深入。雞源志賀菌擁有與人源菌株相同的IpaC蛋白分子[6-8]，但是至今尚不清楚雞腸上皮細(xì)胞是否存在與人腸上皮細(xì)胞相似的IpaC蛋白受體分子。目前，雞源志賀菌IpaC基因的克隆表達(dá)在原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)技術(shù)已經(jīng)比較成熟[9-11]，但目前國內(nèi)外在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中的研究較少。因此，為使IpaC基因表達(dá)產(chǎn)物保持天然的生物學(xué)活性，為研究雞腸上皮細(xì)胞上的IpaC蛋白受體分子提供研究基礎(chǔ)，本研究通過根據(jù)酵母表達(dá)系統(tǒng)對密碼子的偏愛性，對雞源志賀菌IpaC基因進(jìn)行優(yōu)化合成，分別構(gòu)建真核表達(dá)載體pGAPZαA-IpaC和pGAPZαA-IpaC#，使IpaC和IpaC#整合到酵母染色體中，從而驗(yàn)證畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)與外源基因序列的相關(guān)性，為進(jìn)一步提高雞源志賀菌IpaC基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)提供科學(xué)依據(jù)，對研究該病的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

1材料與方法

1.1菌株及載體

原核重組載體pET32a-IpaC/BL21為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；酵母真核載體pGAPZαA由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)尹清強(qiáng)教授惠贈；宿主菌大腸桿菌（Escherichia coli） TOP10購自上海北諾生物技術(shù)有限公司；畢赤酵母菌株X-33為河南科技大學(xué)張春杰教授惠贈。

1.2酶與試劑

rTaq DNA聚合酶、DL2000、DL5000均購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XbaⅠ均購自Fermentas公司（美國）；T4連接酶購自于New England Biolabs（英國）公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒及質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR引物合成和重組質(zhì)粒的測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。蛋白胨、酵母膏、Agar power均購自O(shè)XIOD公司；瓊脂糖凝膠購自GENVIEW公司；ZeocinTM購自invitrogen公司；鼠源 6-His單克隆抗體（Anti-His Tag Mouse Monoclonal Antibody），購自美國Abbkine試劑公司；羊抗小鼠IgG-HRP，購自索萊寶公司；IpaC蛋白免疫血清及雞源志賀菌滅活疫苗免疫血清均由筆者實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.3IpaC#基因序列的合成

根據(jù)酵母密碼子偏愛性，在不改變氨基酸序列的情況下，對IpaC基因原序列進(jìn)行優(yōu)化，由北京英茂盛業(yè)生物科技有限公司合成，并將基因序列克隆到pUCE載體上，命名為pUCE-IpaC#。

1.4引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)雞源志賀菌IpaC基因與IpaC#基因全序列及畢赤酵母表達(dá)載體pGAPZαA多克隆位點(diǎn)序列分別設(shè)計(jì)1對引物P1、P2和P3、P4，上游引物加上EcoRⅠ、下游引物加上XbaⅠ這2個(gè)酶切位點(diǎn)（斜體加粗為酶切位點(diǎn)），并根據(jù)載體pGAPZαA序列設(shè)計(jì)檢測引物P5、P6，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，已經(jīng)進(jìn)行特異性檢測。序列如下：

1.5重組載體構(gòu)建

分別以pET32a-IpaC和pUCE-IpaC#為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并切下目的條帶，用普通瓊脂糖凝膠試劑盒回收目的片段?；厥债a(chǎn)物和質(zhì)粒pGAPZαA用EcoRⅠ和XbaⅠ限制性內(nèi)切酶同時(shí)進(jìn)行雙酶切并經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后，分別將IpaC和IpaC#基因雙酶切產(chǎn)物與載體pGAPZαA雙酶切產(chǎn)物在T4連接酶的作用下16 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌TOP10，在含ZeocinTM抗性平板上進(jìn)行篩選。挑取陽性單克隆，經(jīng)菌液PCR、質(zhì)粒雙酶切鑒定和序列分析。獲得的重組質(zhì)粒命名為pGAPZαA-IpaC、pGAPZαA-IpaC#。

1.6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母宿主菌X-33

大量提取質(zhì)粒pGAPZαA-IpaC和pGAPZαA-IpaC#，用限制性內(nèi)切酶AvrⅡ進(jìn)行單酶切線性化，電泳后用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收，分別電轉(zhuǎn)化至酵母菌X-33感受態(tài)細(xì)胞中，電轉(zhuǎn)條件為：1.6 kV，25 μF，400 Ω，電擊時(shí)間43 ms。電擊完畢后，馬上將1 mL冰預(yù)冷的1 mol/L山梨醇溶液加入菌體中，吹打混勻，轉(zhuǎn)至1.5 mL EP管中，30 ℃靜置培養(yǎng)1～2 h。取100 μL菌體懸液涂布于含有抗生素Zeocin濃度為100 μg/mL的YPD固體培養(yǎng)基上，待菌液完全吸收后，將平板置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3 d，直至單菌落出現(xiàn)，同時(shí)電轉(zhuǎn)空質(zhì)粒pGAPZαA作對照。

1.7高抗篩選

挑取在ZeocinTM濃度為100 μg/mL平板上的單菌落，分別刺種在ZeocinTM濃度為500、1 000、2 000 μg/mL的YPD平板上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，直至有單菌落出現(xiàn)。將高抗性陽性克隆接種于Zeocin濃度為100 μg/mL的YPD平板上培養(yǎng)2～3 d，直至有單菌落出現(xiàn)。將高抗陽性轉(zhuǎn)化子按照酵母基因組DNA小量提取試劑盒說明書操作提取酵母基因組DNA，利用檢測引物P5、P6進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.8重組畢赤酵母表達(dá)產(chǎn)物檢測

挑取鑒定正確的重組酵母單菌落接種于液體YPD培養(yǎng)基中，于30 ℃、250 r/min下振蕩培養(yǎng)過夜。次日，取0.2 mL過夜培養(yǎng)物接種于100 mL液體YPD培養(yǎng)基中，于30 ℃、250 r/min 下振蕩培養(yǎng)。分別在0、24、32、48、60、72、84、96、108、120、144 h的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集上清和細(xì)胞樣品10 mL，用于SDS-PAGE及Western blot分析，同時(shí)設(shè)立pGAPZαA/X-33表達(dá)為對照組。將各個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)收集的菌液在4 ℃離心機(jī)中，于5 000 r/min下離心5 min，分別取菌體沉淀和上清。沉淀轉(zhuǎn)移至無菌的EP管中。將收集的培養(yǎng)基上清用超濾法濃縮后進(jìn)行SDS及Western blot檢測。Western blot分別用His單抗、IpaC蛋白免疫血清及雞源志賀菌滅活疫苗免疫血清進(jìn)行特異性檢測。

2結(jié)果與分析

2.2重組載體的鑒定結(jié)果

挑取轉(zhuǎn)化后平板上的單菌落過夜培養(yǎng)，各取1 μL作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，電泳出現(xiàn)1條約1 107 bp的特異性條帶，與目的基因片段大小一致（圖1-A）。提取的質(zhì)粒pGAPZαA-IpaC#和pGAPZαA-IpaC經(jīng)EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切電泳出現(xiàn)2條帶，其中1條條帶為載體質(zhì)粒，約3 084 bp，另1條條帶片段長約1 097 bp，酶切結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相一致（圖1-B）。對重組質(zhì)粒測序結(jié)果分析，結(jié)果表明IpaC基因及IpaC#基因均位于pGAPZαA質(zhì)粒α因子信號肽序列下游，具有正確的閱讀框。

2.3高抗性陽性轉(zhuǎn)化子的鑒定

以轉(zhuǎn)化有線性化的重組質(zhì)粒pGAPZαA-IpaC和pGAPZαA-IpaC#的酵母基因組為模板，以α-Factor sequencing primer和3′ AOX1 sequencing primer為引物進(jìn)行PCR，若線性化的含目的基因的重組質(zhì)粒與酵母成功重組則應(yīng)擴(kuò)增出[FL）]

長度為1 333 bp的片段，線性化的質(zhì)粒pGAPZαA與酵母成功重組則應(yīng)擴(kuò)增出長度為299 bp的小片段，pGAPZαA-IpaC為陽性對照。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測，結(jié)果（圖2）與預(yù)期一致，PCR產(chǎn)物經(jīng)測序，線性化的重組質(zhì)粒已經(jīng)成功整合到酵母基因組中。

2.4重組酵母表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳結(jié)果

分別挑取pGAPZαA-IpaC/X-33和pGAPZαA-IpaC#/X-33陽性酵母菌培養(yǎng)表達(dá)，不同時(shí)間取的樣品中上清和菌體沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍(lán)染色，與空載體對照菌比較X-33菌體沉淀樣品用帶His單抗作Western blot檢測，結(jié)果如圖4-A所示，菌體沉淀中蛋白大小位置與預(yù)期一致，在108 h時(shí)表達(dá)量最高。將84、96、108、120、144 h取得的樣品用IpaC蛋白免疫后血清抗體作Western blot檢測，結(jié)果如圖4-B所示，蛋白大小位置與預(yù)期一致。將84、96、108、120、144 h取得的樣品用志賀菌全菌體疫苗菌免疫的血清抗體作Western blot檢測，結(jié)果如圖4-C所示，蛋白大小位置與預(yù)期一致。

3結(jié)論與討論

真核表達(dá)系統(tǒng)克服了原核表達(dá)系統(tǒng)持續(xù)表達(dá)可能會對宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，過量表達(dá)可能導(dǎo)致非生理反應(yīng)，目的蛋白常以包涵體形式表達(dá)，導(dǎo)致產(chǎn)物純化困難的缺點(diǎn)，而真核表達(dá)系統(tǒng)能誘導(dǎo)基因的高效表達(dá)，可達(dá)105倍，為其他系統(tǒng)所不及，可以嚴(yán)格調(diào)控基因表達(dá)，人為地調(diào)控基因表達(dá)量。因此，利用真核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)目的蛋白越來越受到重視。目前，基因工程研究中常用的真核表達(dá)系統(tǒng)有酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。[FL）]

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)可使外源對蛋白進(jìn)行加工修飾，使得表達(dá)的外源蛋白具有類似天然蛋白質(zhì)的構(gòu)象[12]。而本研究選擇的真核表達(dá)載體pGAPZαA以GAP為啟動子，在表達(dá)過程中不須要添加甲醇，操作更為簡單，其含有α信號因子，利用該信號因子可將目的蛋白分泌到培養(yǎng)基中獲得純度較高的蛋白[13-14]。

影響外源基因在畢赤酵母中表達(dá)量的因素很多，其中外源基因自身的特點(diǎn)是影響表達(dá)量的重要因素，包括密碼子使用情況、GC含量等。國內(nèi)外很多研究通過將外源基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，使外源基因的密碼子使用頻率符合畢赤酵母的密碼子偏好性的要求，取得很好的效果[15-18]。本研究通過對IpaC基因的分析發(fā)現(xiàn)，該基因中含有畢赤酵母的稀有密碼子，基于這種情況，本研究根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏好性，對雞源志賀氏菌來源的IpaC基因進(jìn)行優(yōu)化改造，在不改變其氨基酸序列的基礎(chǔ)上，選擇畢赤酵母偏愛型的密碼子，并調(diào)整基因的GC含量，使其更加符合畢赤酵母的要求。優(yōu)化后的IpaC#基因與原始IpaC基因序列相比，共改變了269個(gè)堿基，涉及207個(gè)氨基酸，GC含量由原來的38.83%變?yōu)?40.02%，而在畢赤酵母中GC含量一般為40%～42%，優(yōu)化合成的目的基因GC含量與畢赤酵母相符。

本研究分別構(gòu)建了真核表達(dá)載體pGAPZαA-IpaC和pGAPZαA-IpaC#，重組菌的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE及Western blot檢測，在pGAPZαA-IpaC重組菌菌體沉淀和表達(dá)上清中均沒有檢測到目的蛋白，而在pGAPZαA-IpaC#重組菌菌體沉淀中檢測到目的蛋白大小約為70 ku，這進(jìn)一步驗(yàn)證了畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)與外源基因本身有關(guān)[19-20]。而在pGAPZαA-IpaC#重組菌表達(dá)培養(yǎng)基上清中并未檢測到目的蛋白，有可能是因?yàn)镮paC蛋白本身具有膜結(jié)合區(qū)，在分泌過程中與酵母細(xì)胞發(fā)生結(jié)合，也有可能是α信號肽與IpaC基因在一定程度上不匹配，為后期進(jìn)一步研究IpaC蛋白在畢赤酵母中的高效表達(dá)奠定基礎(chǔ)。在后續(xù)試驗(yàn)中，更換信號肽序列或者優(yōu)化信號肽序列密碼子可能使IpaC蛋白高效分泌表達(dá)。

參考文獻(xiàn)：[HJ1.4mm]

[1]許蘭菊，王川慶，胡攻政，等. 雞志賀氏菌在我國的發(fā)現(xiàn)及其病原特性研究[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，26（4）：281-286.

[2]Terry C M，Picking W L，Birket S E，et al. The C-terminus of IpaC is required for effector activities related to Shigella invasion of host cells[J]. Microbial Pathogenesis，2008，45（4）：282-289.

[3]Shaikh N，Terajima J，Watanabe H. IpaC of Shigella binds to the C-terminal domain of β-catenin[J]. Microbial Pathogenesis，2003，35（3）：107-117.

[4] Brzu S，Benjelloun-Touimi Z，Phalipon A，et al. Functional analysis of the Shigella flexneri IpaC invasin by insertional mutagenesis[J]. Infection and immunity，1997，65（5）：1599-1605.

[5] Kim S，Kim J，Seo G. Iron oxide nanoparticle-impregnated powder-activated carbon （IpaC） for NOM removal in MF membrane water treatment system[J]. Desalination and Water Treatment，2013，51（31/32/33）：6392-6400.

[6]劉紅英. 人志賀菌對雛雞的致病性及人、雞志賀菌某些重要基因的比較研究[D]. 鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[7]楊霞，陳陸，許蘭菊，等. 雞源鮑氏志賀菌hn03株的分子鑒定與演化分析[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，40（3）：402-408.

[8]楊霞. 利用分子遺傳標(biāo)記技術(shù)對雞鮑氏志賀菌的鑒定和菌株起源研究[D]. 鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[9]苗銀萍，蔣大偉，許蘭菊，等. 雞源志賀菌IpaC基因的克隆及原核表達(dá)[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，33（9）：1352-1357.[ZK）]

[10]陳志寶，宋博翠. 弗氏志賀菌侵襲性基因IpaC誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建及其自激活作用[J]. 中國生物制品學(xué)雜志，2010，23 （6）：590-593.

[11]孫素霞，王紅，王勇，等. 福氏志賀氏菌毒力基因IpaC在大腸桿菌中表達(dá)的初步研究[J]. 中國人獸共患病雜志，2003，19（6）：29-31.

[12]Ahmad M，Hirz M，Pichler H，et al. Protein expression in Pichia pastoris：recent achievements and perspectives for heterologous protein production[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2014，98（12）：5301-5317.

[13]Borgheresi R A M B，Palma M S，Ducancel F，et al. Expression and processing of recombinant sarafotoxins precursor in Pichia pastoris[J]. Toxicon，2001，39（8）：1211-1218.

[14]Li J W，Liu Y，Li K，et al. Cloning of a fusion gene containing hGM-CSF gene and gene encoding L protein of HBV and expression in Pichia pastoris[J]. Hepato-Gastroenterology，2009，57（99/100）：578-582.

[15]Scorer C A，Buckholz R G，Clare J J，et al. The intracellular production and secretion of HIV-1 envelope protein in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J]. Gene，1993，136（1/2）：111-119.[HJ1.6mm]

[16]姚斌，張春義，王建華. 高效表達(dá)具有生物活性植酸酶的畢赤酵母[J]. 中國科學(xué)C輯，1998，28（3）：237-243.

[17]陳惠，趙海霞，王紅寧，等. 植酸酶基因中稀有密碼子的改造提高其在畢赤酵母中的表達(dá)量[J]. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2005，21（2）：171-175.

[18]Chang S W，Shieh C J，Lee G C，et al. Multiple mutagenesis of the Candida rugosa [WTBX][STBX]LIP1[WTBZ][STBZ] gene and optimum production of recombinant LIP1 expressed in Pichia pastoris[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2005，67（2）：215-224.

[19]陳熙，陳毓，齊小雨，等. 人溶菌酶定點(diǎn)突變基因在畢赤酵母中的表達(dá)及活性分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，30（6）：1396-1401.

[20]董亞青，朱文斗，王琳琳，等. 雞α-干擾素在畢赤酵母中的表達(dá)及其表達(dá)條件優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（11）：275-277.