蚯蚓在土壤污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

羅潔文+黃玫英+殷丹陽(yáng)+周垂帆+吳鵬飛

摘要：蚯蚓是陸地生態(tài)系統(tǒng)中生物量最大的無(wú)脊椎土壤動(dòng)物，是土壤中的重要生物，蚯蚓既能夠反映土壤的污染狀況，又能鑒定指示各種有害物質(zhì)的毒性，因此被視為土壤區(qū)系的代表類群而被應(yīng)用于指示、監(jiān)測(cè)土壤污染和質(zhì)量評(píng)價(jià)。隨著生態(tài)環(huán)境污染和土壤質(zhì)量的下降，蚯蚓生態(tài)毒理學(xué)研究得到國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者的重視，以蚯蚓作為土壤污染指示生物開(kāi)展了大量的研究工作。蚯蚓在外源污染物脅迫下，其種群以及個(gè)體生理生化水平都會(huì)發(fā)生明顯的變化。系統(tǒng)闡述蚯蚓在群落以及個(gè)體水平上的生態(tài)毒理學(xué)研究現(xiàn)狀，指出目前蚯蚓毒理學(xué)研究存在的薄弱環(huán)節(jié)，并對(duì)今后的研究趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：蚯蚓；土壤污染；生態(tài)毒理學(xué)；生物監(jiān)測(cè)

中圖分類號(hào)： S151.9+3；X174文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

近年來(lái)，隨著人口劇增以及經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，人類活動(dòng)導(dǎo)致的環(huán)境污染問(wèn)題正不斷加劇，并已成為嚴(yán)重影響人類可持續(xù)發(fā)展的突出問(wèn)題。我國(guó)環(huán)境保護(hù)部與國(guó)土資源部于2014年共同發(fā)布的《全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》顯示，全國(guó)土壤總點(diǎn)位超標(biāo)率為16.1%，其中無(wú)機(jī)污染物超標(biāo)點(diǎn)位占總超標(biāo)點(diǎn)位的82%，從污染情況來(lái)看，重金屬污染尤為嚴(yán)重[1]。土壤是污染物的“集散地”之一，土壤污染不僅導(dǎo)致土地質(zhì)量退化，影響農(nóng)產(chǎn)品安全，而且還可以通過(guò)淋溶作用污染地表水、地下水。土壤污染具有隱蔽性、累積性、滯后性等特點(diǎn)，一旦發(fā)生嚴(yán)重污染，往往造成不可逆轉(zhuǎn)的嚴(yán)重后果[2]。土壤已成為影響生態(tài)環(huán)境、耕地質(zhì)量、食品安全和人類健康的重要因素，是人類賴以生存的基礎(chǔ)，土壤環(huán)境質(zhì)量狀況與人類息息相關(guān)。因此，研究土壤污染物對(duì)生物體的毒性作用，由此對(duì)環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)早期診斷作出可靠的評(píng)估，以期為污染物的早期診斷、早期預(yù)防和控制提供基礎(chǔ)理論及技術(shù)支持。

土壤的污染程度可以通過(guò)環(huán)境調(diào)查和監(jiān)測(cè)進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)估和表征污染物生物效應(yīng)的一種常見(jiàn)方法是生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，此方法主要以動(dòng)物、植物和微生物作試驗(yàn)生物，蚯蚓便是其中的標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)試物種之一。蚯蚓作為土壤污染的指示生物愈來(lái)愈受到重視，目前已被廣泛應(yīng)用于土壤污染的監(jiān)測(cè)。有研究表明，蚯蚓組織中的農(nóng)藥和重金屬含量可作為監(jiān)測(cè)土壤污染的重要指標(biāo)[3]。蚯蚓是土壤中普遍存在的無(wú)脊椎生物，是土壤系統(tǒng)中重要的組成部分，占土壤動(dòng)物總量的60%～80%，長(zhǎng)期暴露在土壤中，是陸生生物與土壤生物之間的紐帶，是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中土壤物質(zhì)生物小循環(huán)中重要的一環(huán)[4]，被認(rèn)為是適合對(duì)土壤中化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行毒性測(cè)試的物種之一。蚯蚓既能夠反映土壤的污染狀況，又能鑒定指示各種有害物質(zhì)的毒性。目前，應(yīng)用于土壤生態(tài)毒理試驗(yàn)的蚯蚓有十多種，其中最常用的是生活于腐殖質(zhì)或富含有機(jī)質(zhì)環(huán)境中的赤子愛(ài)勝蚓（Eisenia foetida），該蚯蚓由于容易在實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于新化學(xué)品潛在毒性測(cè)試及污染土壤的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化聯(lián)合會(huì)（International Organization for Standardization，ISO）分別制定了相關(guān)的蚯蚓生態(tài)毒性測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)方法，并積累了大量毒性測(cè)試數(shù)據(jù)[5]。美國(guó)測(cè)試與材料學(xué)會(huì)已公布了關(guān)于實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展蚯蚓生物富集研究的標(biāo)準(zhǔn)草案。有關(guān)蚯蚓生態(tài)毒性研究的2次國(guó)際學(xué)術(shù)會(huì)議均在丹麥舉行，討論與交流蚯蚓生態(tài)毒理學(xué)的研究進(jìn)展與發(fā)展，并在相關(guān)雜志出版了專輯[6]。許多研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓受到污染脅迫時(shí)，蚯蚓種群和群落會(huì)發(fā)生明顯的變化，并且在蚯蚓微觀水平上，如細(xì)胞、分子和生理生化水平上都會(huì)發(fā)生明顯的變化。本研究在總結(jié)國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，從外來(lái)污染物對(duì)蚯蚓種群、生化特性和個(gè)體的影響3個(gè)方面進(jìn)行綜述，分析蚯蚓生態(tài)毒理試驗(yàn)在土壤污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)中的作用，以期為土壤污染監(jiān)測(cè)和土壤環(huán)境質(zhì)量評(píng)價(jià)的研究提供參考。

1蚯蚓生態(tài)毒理學(xué)研究方法

蚯蚓生態(tài)毒理學(xué)是指利用蚯蚓作為目標(biāo)載體，對(duì)環(huán)境中造成土壤污染的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)試，根據(jù)這些化學(xué)物質(zhì)對(duì)蚯蚓的毒害程度來(lái)評(píng)價(jià)其可能對(duì)生態(tài)系統(tǒng)及其組分的危害程度[7]。蚯蚓生態(tài)毒理學(xué)研究常用的方法有實(shí)驗(yàn)室毒理試驗(yàn)法和田間試驗(yàn)法，根據(jù)試驗(yàn)研究過(guò)程的長(zhǎng)短或化學(xué)物質(zhì)劑量的大小，蚯蚓的毒性試驗(yàn)可分為急性毒性試驗(yàn)、慢性毒性試驗(yàn)。急性毒理試驗(yàn)是通過(guò)簡(jiǎn)單、快速的方法測(cè)試有毒物對(duì)蚯蚓的毒性，從而對(duì)該毒物的生態(tài)毒性作出初步的判斷。慢性毒理試驗(yàn)主要是研究有害化學(xué)殘留物質(zhì)對(duì)蚯蚓生殖、生理、代謝、染色體及基因等深層次的影響。該領(lǐng)域從分子、基因水平探討污染物對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的污染狀況，對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的早期快速診斷具有重要的意義。目前在低劑量污染物對(duì)蚯蚓長(zhǎng)期效應(yīng)的研究中，選用幼蚓作為指示生物來(lái)檢測(cè)污染物對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響效果最顯著。

1.1室內(nèi)模擬試驗(yàn)

在試驗(yàn)方法的選用中，實(shí)驗(yàn)室毒理試驗(yàn)法被廣泛采用，常用的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)方法主要有以下幾種。

1.1.1濾紙接觸法這種方法一般應(yīng)用于急性毒性試驗(yàn)，是通過(guò)將蚯蚓暴露在填充標(biāo)準(zhǔn)化濾紙的玻璃器皿中，與不同濃度的化學(xué)藥品接觸48 h后測(cè)定蚯蚓的死亡率，并可通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法得出半致死濃度（LC50）。濾紙接觸法快速、簡(jiǎn)單易行，但是此方法僅能提供蚯蚓通過(guò)皮膚接觸有害物質(zhì)所產(chǎn)生的毒性信息，因此難以評(píng)估化學(xué)物質(zhì)對(duì)環(huán)境的真實(shí)影響[8]。劉偉等采用濾紙接觸法和土壤培養(yǎng)法研究毒死蜱（chlorpyrifos）、馬拉硫磷（malathion）和氰戊菊酯（fenvalerate）對(duì)赤子愛(ài)勝蚓的急性毒性效應(yīng)，從試驗(yàn)結(jié)果看，通過(guò)濾紙接觸法測(cè)得這3種農(nóng)藥對(duì)蚯蚓的致死劑量小于土壤培養(yǎng)法，土壤培養(yǎng)法較接近自然狀況下蚯蚓接觸藥品的方式，故以土壤培養(yǎng)法測(cè)定的LC50作為劃分藥物毒性等級(jí)的依據(jù)比濾紙接觸法更為客觀準(zhǔn)確[9]。

1.1.2溶液法該方法一般用于急性毒性試驗(yàn)，主要是模擬土壤溶液中主要養(yǎng)分，即向溶液添加定量的鉀（K）、鈉（Na）、鈣（Ca）、鎂（Mg）等成分以及需要測(cè)定的污染物并把蚯蚓暴露于溶液中[10]。國(guó)內(nèi)外已有較多報(bào)道，該方法具有快速、簡(jiǎn)便、暴露直接等優(yōu)點(diǎn)，可用于毒物的初篩和毒性的快速鑒別。溶液法在重金屬如鎘（Cd）、銅（Cu）、鋅（Zn）以及納米TiO2、ZnO等毒物對(duì)蚯蚓的毒性效應(yīng)中都有相關(guān)的應(yīng)用[11-13]。

1.1.3回避試驗(yàn)回避試驗(yàn)是利用動(dòng)物趨利避害本能的一種實(shí)驗(yàn)室毒理試驗(yàn)法，通過(guò)測(cè)定一定濃度某化學(xué)物質(zhì)對(duì)蚯蚓個(gè)體行為的影響程度來(lái)判定其毒性[14]。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織早于2005年公布了利用蚯蚓回避行為反應(yīng)評(píng)價(jià)土壤環(huán)境質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)化試驗(yàn)方法，赤子愛(ài)勝蚓和安得愛(ài)勝蚓（E. andrei）是國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織指定的回避試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)蚯蚓品種[15]。蚯蚓的回避試驗(yàn)具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、靈敏度高和重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。目前，蚯蚓回避試驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)可適用于檢測(cè)土壤中的原油、礦物油、多環(huán)芳烴等石油類污染物，功夫菊酯、代森錳鋅、本菌靈、多菌靈等農(nóng)藥，錳、鋅、銅或其他重金屬的混合物等多種污染物，其敏感性高于急性毒性試驗(yàn)，也高于或至少等同于亞急性毒性試驗(yàn)中的生殖毒性試驗(yàn)[16]，因此，回避試驗(yàn)在污染土壤生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

1.1.4人工土壤試驗(yàn)通過(guò)將成熟的赤子愛(ài)勝蚓或安得愛(ài)勝蚓（E. andrei）置于含有不同濃度供試化學(xué)品的人工土壤中培養(yǎng)14 d，觀察其行為和存活狀況。通常情況下，人工土壤由10%苔蘚泥炭細(xì)土（pH值=6）、20%高嶺黏土（高嶺土比例大于50%）、69%工業(yè)石英砂（含50%以上0.05～0.20 mm的細(xì)小顆粒）和1% CaCO3（化學(xué)純）組成[17]。利用這種復(fù)雜的人工土壤進(jìn)行試驗(yàn)的主要目的是盡可能模擬蚯蚓生活的真實(shí)環(huán)境，從而使試驗(yàn)結(jié)果盡可能真實(shí)地反映污染物在自然界中的實(shí)際影響，這也是此方案最明顯的優(yōu)點(diǎn)。Zhou等利用人工土壤法進(jìn)行鎘與草甘膦復(fù)合對(duì)蚯蚓的亞性毒性試驗(yàn)，探討草甘膦存在的條件下鎘對(duì)蚯蚓的存活、生長(zhǎng)、繁殖、生化指標(biāo)等影響規(guī)律[18]。

1.1.5人造土壤試驗(yàn)這是用一種無(wú)定形水和改性的二氧化硅粉，并在其中加入直徑為1.5～2.0 cm的玻璃球以代替人工土壤的試驗(yàn)方法，是根據(jù)上述人工土壤試驗(yàn)方法改進(jìn)而得。此方法的優(yōu)點(diǎn)是使用確切定義的物質(zhì)作為基質(zhì)，操作簡(jiǎn)便，其結(jié)果也更具有可比性，并且由于這種物質(zhì)的化學(xué)惰性，基本上可以確定不會(huì)與試驗(yàn)容器及被測(cè)物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。所加入玻璃球一方面能創(chuàng)造一個(gè)類似土壤結(jié)構(gòu)的環(huán)境，另一方面能增加被測(cè)物質(zhì)的接觸面積。從試驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看，與人工土壤試驗(yàn)一樣也能較好反映污染物的真正影響。有研究者認(rèn)為，相較于人工土壤試驗(yàn)，人造土壤試驗(yàn)方法更簡(jiǎn)便易行，更易于標(biāo)準(zhǔn)化[19]。如肖能文等就把人造土壤法應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因棉中Bt毒蛋白Cry1Ac對(duì)蚯蚓生理水平的影響[20]。

1.2田間毒理試驗(yàn)

嚴(yán)格意義上說(shuō)，實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)方法并不是真正意義上的生態(tài)毒理學(xué)試驗(yàn)，但因其實(shí)用價(jià)值而得到重視和發(fā)展。實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)方法主要應(yīng)用在蚯蚓個(gè)體水平及模擬環(huán)境中，而田間試驗(yàn)法在種群、群落調(diào)查及土壤系統(tǒng)的實(shí)地考察等方面都有所應(yīng)用。目前，越來(lái)越多的蚯蚓毒理試驗(yàn)將微觀的試驗(yàn)方法和宏觀的調(diào)查分析結(jié)合在一起，在研究生化指標(biāo)的同時(shí)，探討污染物對(duì)蚯蚓種群或群落及整個(gè)土壤系統(tǒng)的生態(tài)效應(yīng)，使試驗(yàn)結(jié)果對(duì)土壤的生態(tài)評(píng)價(jià)更具有指導(dǎo)性。

蚯蚓的田間生態(tài)毒理試驗(yàn)是指在實(shí)際的生態(tài)系統(tǒng)中直接測(cè)試某種化學(xué)物質(zhì)對(duì)蚯蚓種群生態(tài)毒性的試驗(yàn)。由于試驗(yàn)直接在現(xiàn)實(shí)的土壤環(huán)境中進(jìn)行，因而其結(jié)果也更直接地反映被測(cè)物質(zhì)對(duì)環(huán)境的實(shí)際影響。與實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)方法相比，田間生態(tài)毒理試驗(yàn)有諸多的優(yōu)點(diǎn)[19]，但是由于試驗(yàn)條件的復(fù)雜性，其試驗(yàn)結(jié)果常常不具有可比性；同時(shí)，試驗(yàn)方法和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)多樣化，可用的數(shù)據(jù)是有限的。因此，盡管蚯蚓田間生態(tài)毒理試驗(yàn)在評(píng)價(jià)化學(xué)藥品的生態(tài)毒性上很有價(jià)值，但仍需要更多研究者在試驗(yàn)方法的標(biāo)準(zhǔn)化和制定相關(guān)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)方面進(jìn)行更深入的探討。

2蚯蚓種群對(duì)土壤污染物的響應(yīng)

蚯蚓種群的生物多樣性是伴隨著蚯蚓對(duì)各種生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)而產(chǎn)生的[3]。許多有毒有害的物質(zhì)通過(guò)各種途徑進(jìn)入土壤生態(tài)系統(tǒng)后，可導(dǎo)致蚯蚓及其他土壤動(dòng)物種群的顯著變化。在外源污染物脅迫下，耐污染強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)種可能會(huì)表現(xiàn)出更高的優(yōu)勢(shì)度，一些對(duì)污染敏感的蚯蚓種群不能繼續(xù)生存和繁衍，能夠耐受污染物的種群保留下來(lái)，從而導(dǎo)致蚯蚓在密度和群落結(jié)構(gòu)上發(fā)生明顯的變化[21]。因此，在大多數(shù)情況下，蚯蚓種群密度、種類豐度和數(shù)量等參數(shù)，都是評(píng)價(jià)污染物對(duì)環(huán)境危害程度的重要工具。目前，關(guān)于土壤動(dòng)物——蚯蚓的研究并未引起國(guó)內(nèi)研究者的關(guān)注，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究并不多。王振中等對(duì)湖南株洲清水塘金屬冶煉工業(yè)區(qū)附近土壤中的蚯蚓種群種類和密度進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)隨著鎘、砷、鋅、鉛、汞等重金屬污染程度的增加，蚯蚓的種類明顯減少，優(yōu)勢(shì)種以3種巨蚓科種為主[22]。換而言之，重金屬元素能在土壤動(dòng)物體內(nèi)積累，重金屬在蚯蚓體內(nèi)積累到一定的濃度后，對(duì)污染敏感的種類便不能繼續(xù)繁殖和生存。Lukkari等在芬蘭選取不同重金屬污染以及不同土壤特性的冶金工業(yè)區(qū)土壤中的蚯蚓進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，距離污染源越近，蚯蚓的密度、數(shù)量和生物量都明顯地下降[23]。Klok等對(duì)荷蘭和比利時(shí)洪水頻發(fā)的河漫灘平原地區(qū)的工業(yè)污染區(qū)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，蚯蚓的密度和生物量都與Cd、Cu、Zn呈對(duì)數(shù)變換關(guān)系，隨著重金屬濃度的增加而降低，在高Zn、高Cd含量的污染區(qū)僅有粉正蚓（Lambricus rubellus）能夠存活[24]。另外，有研究表明，蚯蚓對(duì)農(nóng)藥十分敏感，低劑量的農(nóng)藥即可引起蚯蚓數(shù)量的減少[5]。張友梅等對(duì)農(nóng)藥和重金屬污染區(qū)的蚯蚓調(diào)查結(jié)果表明，蚯蚓的種類和數(shù)量隨著土壤污染程度的增加而減少，重污染區(qū)蚯蚓的種類單一，均勻性降低，而清潔區(qū)則種類豐富，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，均勻性增加[25]。Céline對(duì)農(nóng)藥和蚯蚓之間的關(guān)系進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)藥能破壞蚯蚓體內(nèi)的酶活性，使其死亡率上升，繁殖力下降，進(jìn)而對(duì)蚯蚓種群產(chǎn)生影響[26]。Santadino等在研究除草劑草甘膦對(duì)蚯蚓種群的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，草甘膦劑量的增加明顯地降低了蚯蚓的繁殖能力，慢性的毒性使得蚯蚓種群數(shù)量下降，甚至造成區(qū)域性的滅絕[27]。有研究還發(fā)現(xiàn)，污染物對(duì)蚯蚓的影響不僅存在于不同蚯蚓種類之間，還存在于同一蚯蚓的種內(nèi)間[28]。以上研究所得出的結(jié)論能在一定程度上說(shuō)明，蚯蚓種群密度、數(shù)量、空間分布等可以用于土壤生態(tài)系統(tǒng)污染的程度分析。然而實(shí)地調(diào)查污染土壤中的蚯蚓種群數(shù)量及種群結(jié)構(gòu)不僅需要較多的人力物力，而且耗資、費(fèi)時(shí)，想要獲得更深入的、定量化的信息來(lái)描述土壤生態(tài)系統(tǒng)受污染的動(dòng)態(tài)變化仍然需要更多的研究。

3蚯蚓個(gè)體對(duì)土壤污染物的響應(yīng)

3.1蚯蚓個(gè)體對(duì)土壤污染物的富集作用

蚯蚓位于陸地生態(tài)食物鏈金字塔的底端，土壤中的污染物在蚯蚓體內(nèi)富集后，可以在食物鏈中傳遞和生物放大，從而必將導(dǎo)致食物鏈的逐級(jí)富集，最終威脅人類的健康。蚯蚓主要通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散作用和攝食作用這2種途徑富集土壤中的污染物，前者是污染物從土壤溶液透過(guò)體表進(jìn)入蚯蚓體內(nèi)；而后者則是土壤中的污染物通過(guò)蚯蚓的吞食作用進(jìn)入到其體內(nèi)，并在內(nèi)臟器官內(nèi)完成吸收。有研究通過(guò)測(cè)定重金屬污染土壤中不同鉛濃度梯度下蚯蚓在培養(yǎng)期內(nèi)對(duì)鉛的富集量表明，蚯蚓對(duì)鉛有較強(qiáng)的富集作用，且隨鉛濃度的增加，蚯蚓體內(nèi)的富集量也增加[29]。Langdon等研究發(fā)現(xiàn)，3種蚯蚓（L. rubellus、E. Andrei、A. caliginosa）對(duì)鉛都有明顯的吸收富集能力[30]。另外，蚯蚓對(duì)重金屬的富集作用是具有一定選擇性的，有學(xué)者在研究蚯蚓對(duì)重金屬的最大富集量中發(fā)現(xiàn)，蚯蚓對(duì)Zn、Cu、Pb、Hg 4種重金屬的吸收量由大到小為Zn>Cu>Pb>Hg[31]。

3.2蚯蚓的存活及行為對(duì)土壤污染物的響應(yīng)

當(dāng)蚯蚓與高劑量農(nóng)藥或其他污染物接觸時(shí)，會(huì)產(chǎn)生逃逸現(xiàn)象，最終會(huì)在短時(shí)間出現(xiàn)中毒癥狀，甚至死亡；長(zhǎng)時(shí)間的低劑量作用則可能引起夏眠、糞便排放量減少等現(xiàn)象的發(fā)生。Reinecke等研究發(fā)現(xiàn)，果園噴灑農(nóng)藥后，土壤中的蚯蚓種群密度明顯降低[32]。有研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓暴露在不同濃度的Cu2+溶液中，部分表現(xiàn)出行為異常。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，赤子愛(ài)勝蚓身體變?nèi)彳?，環(huán)節(jié)腫脹，身體后段萎縮糜爛，甚至斷裂，并失去逃逸能力，直至死亡[33]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，暴露在吡蟲(chóng)啉等殺蟲(chóng)劑中的蚯蚓糞便排出量顯著減少，蚯蚓排便量因其測(cè)定簡(jiǎn)便、快速，已成為評(píng)估生物毒性的良好指標(biāo)[26]。

3.3蚯蚓生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖對(duì)土壤污染物的響應(yīng)

土壤中的外源污染物會(huì)對(duì)蚯蚓的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖產(chǎn)生一定的負(fù)面效應(yīng)。其中，生殖系統(tǒng)是動(dòng)物體內(nèi)對(duì)外源污染物反應(yīng)最敏感、最容易受到不良環(huán)境因素影響的系統(tǒng)。重金屬、農(nóng)藥等污染物進(jìn)入蚯蚓體內(nèi)會(huì)破壞蚯蚓的細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)從而影響蚯蚓的產(chǎn)卵能力和精子的形成過(guò)程。郭永燦等研究表明，在受農(nóng)藥污染土壤生活的蚯蚓因精子發(fā)生畸變、受精能力喪失，而導(dǎo)致不育，敏感種類在農(nóng)藥污染區(qū)甚至無(wú)法繁衍[34]。另外，土壤中高濃度的鎘、銅、鉛、鋅等能夠影響蚯蚓種群密度、生存能力、體質(zhì)量變化、性發(fā)育、產(chǎn)卵率、孵化率等重要指標(biāo)。相關(guān)研究表明，赤子愛(ài)勝蚓暴露在2 mg/kg呋喃丹污染的土壤中，蚯蚓個(gè)體不能發(fā)育出環(huán)帶和產(chǎn)卵[35]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，污水處理廠中的銀納米粒子和硝酸銀均會(huì)對(duì)蚯蚓的繁殖產(chǎn)生影響，抑制其繁殖和生長(zhǎng)[36]。

4蚯蚓重要生物標(biāo)志物在污染物中期診斷中的作用

近年來(lái)，細(xì)胞或分子水平上的生物標(biāo)志物作為污染物暴露和毒性效應(yīng)的早期預(yù)警指標(biāo)受到廣泛關(guān)注，并成為國(guó)內(nèi)外生態(tài)毒理學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[2]。而污染物對(duì)蚯蚓生化指標(biāo)以及微觀指標(biāo)的影響也是目前蚯蚓生態(tài)毒理學(xué)的研究熱點(diǎn)。隨著土壤性質(zhì)的變化，污染物的生物有效性（即產(chǎn)生毒性的能力）是不斷變化的，而生物暴露于污染物后產(chǎn)生的生理、生化方面的反應(yīng)是相對(duì)穩(wěn)定的[21]。因此，利用蚯蚓的分子、生物化學(xué)和生理反應(yīng)即生物標(biāo)志物可以在指示半致死效應(yīng)變得明顯前，研究污染物對(duì)蚯蚓在個(gè)體水平上所產(chǎn)生的影響，對(duì)此進(jìn)行的研究可完善土壤污染的早期預(yù)警系統(tǒng)并對(duì)土壤污染進(jìn)行監(jiān)測(cè)。目前被廣受關(guān)注的蚯蚓微觀指標(biāo)主要包括：溶酶體膜的穩(wěn)定性、DNA的損傷作用、抗氧化防御系統(tǒng)、金屬硫蛋白和免疫行為等。

4.1蚯蚓溶酶體膜穩(wěn)定性

溶酶體又稱溶體、溶小體，是單層膜的囊狀胞器，內(nèi)部含有數(shù)十種從高爾基體送來(lái)的水解酶，這些酶主要負(fù)責(zé)消化過(guò)程，也是有毒物質(zhì)在亞細(xì)胞水平的特殊靶標(biāo)。溶酶體可通過(guò)吞噬方式消化、溶解部分由于損傷而喪失功能的細(xì)胞器和其他細(xì)胞質(zhì)顆粒或經(jīng)細(xì)胞攝入的外源物質(zhì)[16]。中性紅染料能在蚯蚓體腔細(xì)胞內(nèi)的溶酶體中很快地積累，當(dāng)蚯蚓受到環(huán)境脅迫時(shí)，其溶酶體膜受到損傷，滲透性發(fā)生變化，隨之失去穩(wěn)定性，染料就逐步泄漏到細(xì)胞質(zhì)中，因而可以利用中性紅保留時(shí)間（neutral red retention time，NRRT） 來(lái)表征溶酶體膜的穩(wěn)定性，溶酶體膜的穩(wěn)定性與污染物劑量具有良好的線性關(guān)系，并可以對(duì)土壤的污染情況起到早期預(yù)警作用。目前該方法已經(jīng)應(yīng)用到重金屬、農(nóng)藥、石油烴、多環(huán)芳烴等土壤污染源的監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)中。Gupta利用NRRT指標(biāo)診斷土壤Cd污染，對(duì)照土壤中蚯蚓溶酶體的NRRT為119 min，隨著土壤Cd處理濃度升高，NRRT呈直線下降[37]。在有機(jī)污染物和農(nóng)藥方面，張偉等的研究表明，將蚯蚓暴露于苯并[a]芘（B[a]P）污染的土壤，溶酶體膜的滲透性增加并失去穩(wěn)定性，NRRT呈現(xiàn)出隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加的趨勢(shì)[38]。Booth等研究有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑對(duì)Aporrectodea caliginosa的毒害作用表明，無(wú)論在實(shí)驗(yàn)室或田間條件下，NRRT均具有明顯的污染指示作用[39]。目前來(lái)說(shuō)，同其他指標(biāo)相比，NRR指標(biāo)對(duì)污染物更為敏感，因此被作為污染物的早期預(yù)警生物標(biāo)志物。

4.2蚯蚓DNA的損傷作用

DNA是生物體內(nèi)重要的大分子，也是生物體內(nèi)重要的遺傳物質(zhì)，DNA若發(fā)生超過(guò)其本身修復(fù)能力的損傷，則會(huì)影響DNA的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致細(xì)胞死亡或細(xì)胞突變。目前，毒物對(duì)蚯蚓DNA的損傷是蚯蚓分子生態(tài)毒理學(xué)研究的重要內(nèi)容之一。當(dāng)前對(duì)蚯蚓DNA的損傷作用主要通過(guò)單細(xì)胞凝膠電泳（彗星實(shí)驗(yàn)）和DNA加合物進(jìn)行分析[39-41]，由于這2種方法均可靈敏地表征農(nóng)藥、重金屬、多環(huán)芳烴等污染物潛在的遺傳毒性和早期暴露效應(yīng)。因此，蚯蚓DNA損傷是用于檢測(cè)污染物致癌、致畸、致突變效應(yīng)的理想生物標(biāo)志物[42]。曹佳等利用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，異[XCZ1.tif]草酮對(duì)土壤動(dòng)物蚯蚓具有毒性作用，不同濃度異[XCZ1.tif]草酮的暴露均能引起蚯蚓體腔細(xì)胞DNA的損傷，表明DNA的損傷與異[XCZ1.tif]草酮呈現(xiàn)出很好的劑量-效應(yīng)關(guān)系[43]。Espinosa-Reyes等對(duì)墨西哥重要工業(yè)城市韋拉克魯斯州某工業(yè)區(qū)附近持久性有機(jī)污染物（POPs）污染土壤中的蚯蚓進(jìn)行彗星實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)蚯蚓DNA損傷顯著高于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的蚯蚓，認(rèn)為蚯蚓的DNA損傷能夠很好地指示有機(jī)污染物對(duì)環(huán)境的影響[35]。

4.3蚯蚓的抗氧化防御系統(tǒng)

抗氧化防御系統(tǒng)作為活性氧的清道夫，在活性氧的清除以及機(jī)體的保護(hù)性防御中發(fā)揮著巨大的作用，該系統(tǒng)包括酶和非酶系統(tǒng)兩大類[2]。污染物可以引起蚯蚓體內(nèi)酶活性發(fā)生變化，有許多研究者提出可將蚯蚓體內(nèi)酶活性作為生物標(biāo)志物指示土壤污染，目前所研究的酶主要包括[36]：超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、乙酰膽堿酯酶（AChE）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）等。而非酶系統(tǒng)是指除抗氧化酶外，在機(jī)體保護(hù)防御過(guò)程中也發(fā)揮著不可替代作用的小分子抗氧化物質(zhì)，這類物質(zhì)包括谷胱甘肽（GSH）、抗壞血酸（維生素C）、α-生育酚（維生素E）等，特別是GSH，這是有機(jī)體抵抗污染脅迫的第1道防線，在降低外源污染的生物毒性和清除活性氧中發(fā)揮著重要的作用。王輝等的研究表明，土壤中Cd、Cu、Pb復(fù)合污染對(duì)蚯蚓體內(nèi)SOD、GST和堿性磷酸酶（AP）活性產(chǎn)生顯著的誘導(dǎo)效應(yīng)，酶活性與重金屬含量及其持續(xù)時(shí)間密切相關(guān)[44]。Zhou等研究也發(fā)現(xiàn)，單一Cu脅迫使蚯蚓體內(nèi)SOD、GSH、AChE活性提高，并且明顯高于毒性較低的草甘膦和空白對(duì)照[18]。李淑梅等研究廢電池在土壤中對(duì)蚯蚓的可溶性蛋白和SOD活性的影響，結(jié)果表明蚯蚓SOD活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，隨時(shí)間變化呈拋物線形[45]。雖然很多證據(jù)都表明蚯蚓對(duì)金屬具有耐性，但是其中的耐性機(jī)理并不清楚，對(duì)這方面的研究也不多。目前在重金屬污染方面存在著一種共識(shí)，即生物體暴露于重金屬后，可能會(huì)受到氧化脅迫的威脅，為了避免受到傷害，生物體內(nèi)某些與抗氧化相關(guān)的酶活性就會(huì)升高，緩解活性氧對(duì)生物體造成的危害[46]。由此可以看出酶與重金屬之間存在著密切關(guān)系，酶活性的研究在蚯蚓對(duì)重金屬耐性機(jī)制領(lǐng)域有重要作用。關(guān)于污染物對(duì)蚯蚓酶活性的影響方面的研究有很多，但是對(duì)酶活性的影響機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4.4金屬硫蛋白

金屬硫蛋白是一種低分子量、富含半胱氨酸的金屬結(jié)合蛋白，廣泛存在于生物體內(nèi)，并具有參與生物體內(nèi)微量元素儲(chǔ)存、運(yùn)輸和代謝、拮抗電離輻射、清除羥基自由基和重金屬解毒等多種生物學(xué)作用。金屬硫蛋白可在實(shí)驗(yàn)室或野外條件下由各種營(yíng)養(yǎng)必需和非必需的有毒金屬誘導(dǎo)合成[37]，它們被認(rèn)為是可檢測(cè)金屬污染的生物標(biāo)志物，具有很強(qiáng)的特異性。目前，蚯蚓的金屬硫蛋白已成功應(yīng)用于對(duì)鎘、銅、鋅等重金屬暴露的評(píng)價(jià)。Gruber等研究表明，在實(shí)驗(yàn)室條件下，暴露在重金屬Cd中使得蚯蚓體內(nèi)金屬硫蛋白含量大幅度增加，并結(jié)合了高達(dá)65%進(jìn)入體內(nèi)組織的Cd[47]。Mustonen等把不同種群的蚯蚓暴露在不同濃度的銅、鋅污染中，比較發(fā)現(xiàn)，污染物濃度越高的環(huán)境下，蚯蚓體內(nèi)金屬硫蛋白含量越高[48]。在國(guó)內(nèi)研究方面，陳春等通過(guò)土壤染毒培養(yǎng)試驗(yàn)，利用重金屬Cd對(duì)蚯蚓（E. foetida）進(jìn)行染毒，發(fā)現(xiàn)Cd可誘導(dǎo)蚯蚓體內(nèi)的MT mRNA表達(dá)，其表達(dá)水平與Cd污染暴露呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系[49]。另外有研究表明，金屬硫蛋白對(duì)不同重金屬敏感程度不一，相較于Cu，對(duì)Cd脅迫的響應(yīng)更為敏感；此外，金屬硫蛋白對(duì)重金屬的敏感度高于對(duì)農(nóng)藥的敏感度[36]。以上分析表明，可以利用蚯蚓的金屬硫蛋白作為潛在分子標(biāo)志物，診斷環(huán)境中的污染物及其暴露水平。

4.5免疫功能

為了適應(yīng)不利的生存環(huán)境，蚯蚓體內(nèi)進(jìn)化產(chǎn)生了獨(dú)特的抗菌與免疫系統(tǒng)，逐漸形成了防御病原細(xì)菌侵襲的有效機(jī)制。蚯蚓的免疫系統(tǒng)主要由體腔細(xì)胞組成，外源污染物進(jìn)入蚯蚓體內(nèi)可使蚯蚓體腔細(xì)胞的存活率及體腔細(xì)胞的噬菌細(xì)胞活性降低，因而體腔細(xì)胞可被用于指示土壤環(huán)境的污染狀況。Hooper等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)蚯蚓暴露在鋅污染環(huán)境時(shí)，其免疫功能會(huì)受到抑制，并下降20%[50]。李帥章等通過(guò)人工土壤法對(duì)赤子愛(ài)勝蚓進(jìn)行銅與砷染毒，發(fā)現(xiàn)黏附細(xì)胞吞噬活性與細(xì)胞吞飲作用受重金屬的影響而減弱，這說(shuō)明重金屬對(duì)蚯蚓中與免疫相關(guān)的體腔細(xì)胞影響較大[51]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于蚯蚓免疫功能的研究尚不多，將蚯蚓的免疫系統(tǒng)作為污染土壤風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的指標(biāo)還有待研究。

5展望

在土壤生態(tài)毒理研究中，合適的生物標(biāo)志物可作為環(huán)境評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)，為土壤污染物和毒理效應(yīng)之間建立發(fā)生機(jī)制，而蚯蚓作為食物鏈底端的生物量最大的土壤動(dòng)物類群，目前被認(rèn)為是土壤污染的理想指示生物[52-54]。綜上所述，蚯蚓應(yīng)用于土壤污染的監(jiān)測(cè)具有一定的前景。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外運(yùn)用蚯蚓監(jiān)測(cè)土壤污染已有長(zhǎng)足的發(fā)展，但是研究的深度和廣度并不足。首先，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室和田間試驗(yàn)可以較為準(zhǔn)確地得出外源污染物對(duì)蚯蚓生理、生化以及個(gè)體和種群的影響程度，但是仍然需要不斷篩選出敏感的生物標(biāo)志物，由此建立生物標(biāo)志物的響應(yīng)情況與土壤污染下蚯蚓個(gè)體、種群變化之間的關(guān)系，從而對(duì)土壤生態(tài)污染程度進(jìn)行研究、預(yù)警和治理。其次，除了有大量新型污染物進(jìn)入土壤生態(tài)系統(tǒng)之外，土壤中存在著多種現(xiàn)實(shí)問(wèn)題，如復(fù)合污染不斷增加、污染物累積的動(dòng)態(tài)過(guò)程，污染物的遷移等。目前的研究中，關(guān)注熱點(diǎn)有從單一污染物轉(zhuǎn)向復(fù)合污染物，靜態(tài)轉(zhuǎn)向動(dòng)態(tài)研究的趨勢(shì)，使蚯蚓生態(tài)毒理研究不斷得到完善。此外，在復(fù)雜的土壤生態(tài)系統(tǒng)中，有許多與污染無(wú)關(guān)的變量能夠?qū)Σ煌拿赶到y(tǒng)產(chǎn)生影響從而干擾生物標(biāo)記物的反應(yīng)，而最有效的生態(tài)毒理學(xué)指標(biāo)也難以定量土壤環(huán)境中可能存在的復(fù)雜干擾因子[55]，目前還缺乏統(tǒng)一的、可比較的試驗(yàn)方法。同時(shí)，蚯蚓對(duì)污染物在生化上的響應(yīng)復(fù)雜，具體機(jī)制尚未明確。因此，對(duì)生物標(biāo)記物中不確定的混淆因子之間的交互作用進(jìn)行估算，并逐步轉(zhuǎn)向定量分析，完善機(jī)制的解釋等方面也是蚯蚓生態(tài)毒理學(xué)研究的重要環(huán)節(jié)。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)迅速發(fā)展，推動(dòng)了分子水平上的蚯蚓生態(tài)毒理學(xué)的研究。如DNA損傷的檢測(cè)手段主要是通過(guò)彗星實(shí)驗(yàn)和DNA-加合物分析，這些試驗(yàn)方法都存在費(fèi)時(shí)和成本高的缺點(diǎn)，因此今后應(yīng)進(jìn)一步采用生理生態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、分子生態(tài)學(xué)、生物地理學(xué)等方法，注重學(xué)科交叉，并依靠高效節(jié)約的新技術(shù)更深入地分析污染物對(duì)蚯蚓的作用，增加蚯蚓作為污染指示生物的可靠性。

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