草魚cadm2b基因的克隆及在成體組織中的表達分析

梁健嘉張瓊宇李 恒鄭建波羅 琛

(1. 浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 杭州 310058; 2. 永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部, 永州 425100)

草魚cadm2b基因的克隆及在成體組織中的表達分析

梁健嘉1張瓊宇2李 恒1鄭建波1羅 琛1

(1. 浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 杭州 310058; 2. 永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部, 永州 425100)

為研究CADMs(Cell adhesion molecules)在草魚構(gòu)建抵御病害感染的第一道防線中發(fā)揮的作用, 用RTPCR和RACE方法結(jié)合測序分析, 在草魚腦組織中檢測到了該基因家族成員cadm2b基因的4條不同的cDNA全長序列。序列比對結(jié)果表明這4條全長cDNA在5′端的序列完全相同, 在3′端的3個局部區(qū)域有不同片段的缺失。因此, 可以確定這4條不同的mRNA是cadm2b 的不同剪接體。這4條不同的剪接體被分別命名為cadm2b、cadm2bX2、cadm2bX3和cadm2bX6。cadm2b的cDNA序列全長1669 bp, 開放閱讀框(ORF)1203 bp,編碼400個氨基酸。cadm2bX2的cDNA序列全長2783 bp, 開放閱讀框長1323 bp, 編碼440個氨基酸; cadm2bX3的cDNA序列全長2755 bp, 開放閱讀框1296 bp, 編碼431個氨基酸; cadm2bX6基因的cDNA序列全長2649 bp, 開放閱讀框1161 bp, 編碼386個氨基酸。根據(jù)堿基序列所進行的氨基酸序列和蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示這4個CADM2b蛋白亞型都具有CADM家族保守的4個功能區(qū), 但其C端的蛋白結(jié)合位點存在差異。CADM2b具有近膜4.1蛋白結(jié)合位點和Ⅱ型PDZ蛋白結(jié)合位點, CADM2bX2、X3缺失了PDZ蛋白結(jié)合位點, 而CADM2bX6則同時缺失4.1蛋白和PDZ蛋白的結(jié)合位點。實時定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示cadm2b剪接突變體是該基因mRNA的主要形式。半定量RT-PCR和套式PCR實驗檢測結(jié)果表明cadm2b基因在草魚成體腦中高水平表達, 在肝、腎、心臟和肌肉組織中有微量表達。這種表達模式提示草魚中CADM2b主要是由非免疫細胞, 而不是由免疫肥大細胞合成分泌的細胞黏附因子, 可能通過介導(dǎo)免疫肥大細胞與病原靶細胞的黏附而起非特異性抵御病害感染的作用。

草魚; cadm2b; 基因克隆; 組織表達

CDMAs (Cell adhesion molecules)屬于脊椎動物細胞黏附分子(CAMs)家族中免疫球蛋白超家族的成員, 是單次跨膜糖蛋白, 其氮端(胞外區(qū))的3個連續(xù)Ig結(jié)構(gòu)域以親同性(Homophilic)或親異性(Heterophilic)相互作用[1]起穩(wěn)定細胞間黏附的作用, 并以單次跨膜結(jié)構(gòu)域與胞漿區(qū)結(jié)構(gòu)相連接; 其羧基端(胞漿區(qū))具有的近膜4.1蛋白[2]結(jié)合位點和蛋白末端Ⅱ型PDZ蛋白[3]結(jié)合位點, 參與了維持細胞極性和介導(dǎo)細胞信號傳導(dǎo)的過程[4,5]。已有研究表明CADMs是一種多功能的細胞黏附因子, 在精子發(fā)生[6—10]、上皮發(fā)育與穩(wěn)態(tài)維持[11]、中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[12—14]以及抑制眾多腫瘤發(fā)生[15—17]等過程中都起重要作用。此外, CDMAs是介導(dǎo)免疫肥大細胞與靶細胞識別和結(jié)合的關(guān)鍵受體, 對免疫肥大細胞行駛抵御病害感染的功能, 構(gòu)建有機體抵御病害感染的第一道防線至關(guān)重要[3,18—21]。

該蛋白家族的第一個基因cadm1于2002年由Thomas Biederer[16]等首次在成年小鼠前腦中克隆。目前已知在人與小鼠的基因組中有cadm1、2、3、4四個基因[16,22,23,18], 在雞基因組中有cadm1、cadm2、cadm3三個基因[24], 而斑馬魚由于基因組的加倍和基因分化, 在其基因組中有cadm1a、1b、2a、2b、3、4共6個同源基因[25]。除了有不同的同源基因外, 哺乳動物cadm1還通過在轉(zhuǎn)錄后對mRNA前體(pre-mRNA)的不同選擇性剪接而產(chǎn)生不同的mRNA剪接變體(Splice variant)[26]。已經(jīng)證明由不同的剪接變體所產(chǎn)生的CAMD1蛋白質(zhì)異構(gòu)體(Isoforms)調(diào)控免疫肥大細胞的不同功能[27,28]。生物信息學(xué)預(yù)測表明cadm2b可能也存在多種不同的轉(zhuǎn)錄剪接體, 但尚無有關(guān)克隆和功能研究的報道。為研究CADMs是否在草魚構(gòu)建抵御病害感染的第一道防線中起作用, 我們選擇克隆了草魚cadm2b的mRNA, 發(fā)現(xiàn)了該基因的4個不同轉(zhuǎn)錄剪接體, 分析了該基因在成體草魚不同組織中的表達情況。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所使用的草魚(Ctenopharyngodon idellus)為2齡的草魚, 購自杭州城北商貿(mào)園菜市場。適量的草魚腦、肝、腎、鰓、胰、心、肌肉、尾鰭組織樣品經(jīng)液氮冷凍后保存于-80℃, 用于后續(xù)RNA和基因組DNA提取。

1.2 實驗方法

草魚基因組DNA、Total RNA的提取和cDNA第一鏈的獲得草魚的基因組DNA使用酚氯仿法從尾鰭組織中提取。草魚腦、肝臟、鰓、腎臟、胰臟、心臟、肌肉組織的Total RNA的獲取依據(jù)Total RNA Extractor (Trizol)(生工生物工程股份有限公司)試劑盒操作步驟進行, 隨后使用TURBO DNA free kit(ambion)試劑盒對所提取的總RNA進行消化處理, 清除基因組DNA污染。消化后的總RNA溶解于無核酸酶水中并于-80℃冰箱中冷凍保存。以成年草魚各組織純化后的Total RNA為模板,使用Reverse Transcription System(Promega)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈, 實驗過程依據(jù)試劑盒說明書完成。以草魚腦組織總RNA為模板, 使用Clon-Tech公司的SMARTerTMRACE cDNA Amplification的試劑盒分別合成5′RACE和3′RACE相應(yīng)的cDNA文庫, 具體操作按試劑盒說明書進行。

草魚全長cadm2b cDNA的克隆根據(jù)斑馬魚中cadm2b基因序列設(shè)計跨編碼區(qū)引物cadm2b-S1、cadm2b-AS1 (表 1), 以成年草魚腦組織RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板進行擴增, 并對所獲得的片段進行膠回收和測序。測序的結(jié)果使用NCBI網(wǎng)站中Blast功能進行序列分析, 確定其為草魚cadm2b cDNA序列后, 再依據(jù)這一序列設(shè)計上游、下游的特異性嵌套引物, 使用RACE法擴增草魚cadm2b基因的5′和3′末端序列。

cadm2b基因的5′和3′RACE cDNA第一鏈的合成, 依據(jù)SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit (Clontech)擴增試劑盒說明書進行。隨后, 以新合成的RACE cDNA為模板, 使用設(shè)計的特異性嵌套引物cadm2b-5′RACE AS1、cadm2b-3′RACE S1等(表 1)配合SMARTerTMRACE試劑盒所提供的通用引物UPM(Universal Primer A Mix. Long (0.4 μmol/ L): 5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCA GTGGTATCAACGCAGAGT-3′; Short (2 μmol/L): 5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′與NUP (Nested Universal Primer A. 10 μmol/L: 5′-AAGC AGTGGTATCAACGCAGAGT-3′)使用Premix Extaq酶進行巢式PCR實驗, 擴增cadm2b基因的5′端和3′端cDNA序列。RACE實驗PCR循環(huán)參數(shù)如下:第一輪, 5′RACE實驗使用引物5′RACE AS1與UPM進行實驗; 3′RACE實驗使用引物3′RACE S1與UPM進行實驗。所使用的循環(huán)參數(shù)為: 95℃ 5min, 95℃ 5s, 65℃ 30s, 72℃ 2min (10個循環(huán)); 95℃ 5s, 62℃ 30s, 72℃ 2min (22個循環(huán)), 72℃ 10min。第二輪, 5′RACE實驗使用引物5′RACE AS2與NUP進行實驗; 3′RACE實驗使用引物3′RACE S2與NUP進行實驗。所使用的循環(huán)參數(shù)為: 95℃ 5min, 95℃ 5s, 64℃ 30s, 72℃ 2min (10個循環(huán)); 95℃ 5s, 62℃ 30s, 72℃ 2min (22個循環(huán)), 72℃ 10min。將獲得的5′和3′UTR片段凝膠回收后進行測序, 再根據(jù)所得序列設(shè)計與5′和3′UTR匹配的引物, 通過RT-PCR進行全長cDNA的合成和連鎖分析。

草魚cadm2b cDNA蛋白質(zhì)序列預(yù)測及系統(tǒng)進化分析使用Primer Premier 5軟件預(yù)測cadm2b基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列, 將預(yù)測的結(jié)果分別與其他物種進行同源性分析, 使用MEGA5.1軟件的Neighbor-joining方法構(gòu)建進化樹。依據(jù)軟件預(yù)測的氨基酸序列使用NCBI和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)預(yù)測CADM2b蛋白的結(jié)構(gòu), 最后利用Adobe Illustrator CC2015軟件繪制核酸結(jié)構(gòu)與蛋白結(jié)構(gòu)簡圖。

表 1 用于草魚cadm2b cDNA克隆的引物Tab. 1 Primers used in cloning the cDNA of cadm2b

cadm2b在草魚成體不同組織和器官中表達分析取成年草魚中各組織1 μg Total RNA樣品,按前述方法經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈。半定量PCR實驗所使用的跨內(nèi)含子引物參考斑馬魚cadm2b基因內(nèi)含子結(jié)構(gòu)位置設(shè)計。其序列為KN4 S: 5′-TC GTGGAAGGAGCTGACCAT-3′; KN4 AS: 5′-GAG GCCTGTGATTTCTGGTTTT-3′, 實驗循環(huán)條件為95℃5min; 95℃30s, 57℃30s, 72℃30s (30個循環(huán)); 72℃ 10min。使用β-actin基因作為內(nèi)參基因, 使用的引物為GrassF β-actin S: 5′-TCACACCTTCTAC AACGAGCTGCG-3′, GrassF β-actin AS: 5′-GAA GCTGTAGCCTCTCTCGGTCAG-3′, PCR循環(huán)條件為: 95℃ 5min; 95℃ 30s, 55℃ 30s, 72℃ 30s, 30個循環(huán); 72℃ 10min。當(dāng)不存在基因組污染時, 條帶大小為330 bp, 而存在基因組污染時條帶大小為651 bp。為檢測在不同組織中cadm2b的微量表達, 在上述半定量引物的內(nèi)側(cè)設(shè)計了巢式PCR引物。其序列為KN4巢S1: 5′-ATCAGTGATGTTACTCTGTC AGATG -3′KN4巢AS1: 5′-TGATTTCTGGTTTT GCTGGAACG-3′。實驗循環(huán)條件為95℃ 5min; 95℃ 30s, 56℃ 30s, 72℃ 20s (30個循環(huán)); 72℃10min。

熒光定量RT-PCR實驗使用TaKaRa公司的Prime ScriptTMRT reagent Kit對不同組織的mRNA進行逆轉(zhuǎn)錄。各不同組織所用的總RNA量均為為250 ng。用SYBR Premix Ex Taq試劑盒, 在LightCycler 480 System上進行熒光定量分析。反應(yīng)條件為: 95℃30s; 95℃ 5s, 62℃ 30s (40個循環(huán))。為保證結(jié)果的可靠性, 對每一樣品的分析都重復(fù)了3次。所獲得的CT值使用2-ΔΔCt法對數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果

2.1 草魚cadm2b cDNA結(jié)構(gòu)及預(yù)測的氨基酸序列

用引物cadm2b-S1、cadm2b-AS1通過RT-PCR方法在成年草魚腦組織RNA中擴增到了一段長約1.2 kb的序列。對該序列進行測序和使用NCBI網(wǎng)站中Blast功能進行序列分析的結(jié)果表明其與斑馬魚cadm2b序列高度同源, 故可以確定其為草魚cadm 2b cDNA序列。隨后使用與該序列匹配的上下、游特異性嵌套引物, 通過RACE法擴增草魚cadm2b基因的5′和3′末端序列, 分別獲得了長度為238 bp的5′-UTR產(chǎn)物, 以及長度分別為228 bp和1.4 kb的3′UTR產(chǎn)物(圖 1A)。在通過測序獲得這些RACE產(chǎn)物的序列后, 分別設(shè)計了與5′UTR和兩條不同3′RACE產(chǎn)物序列匹配的引物。然后用其進行了RT-PCR全長序列克隆和連鎖分析(表 1, 圖 1B)。對其所得產(chǎn)物的序列分析結(jié)果表明用5′端引物cadm2b-LS S1與3′端短片段匹配的引物cadm2b-LS AS1配對進行連鎖分析只得到一條cDNA序列, 而與3′端長片段匹配的引物cadm2b-LS AS2配對進行連鎖分析得到3條不同的cDNA序列。序列比對結(jié)果表明這4條cDNA在5′端區(qū)域的序列都完全相同, 只在3′端的3個局部區(qū)域有缺失片段的差異, 而每個cDNA的缺失片段都不同(圖 2)。因此, 可以確定這4條不同的cDNA是cadm2b 的不同剪接體。

參考預(yù)測的斑馬魚cadm2b基因剪切突變體名稱以及序列的同源性的比對, 我們將草魚這4條mRNA序列分別命名為cadm2b、cadm2bX2、cadm2bX3和cadm2bX6 (圖 2)。cadm2b基因cDNA全長為1669 bp,開放閱讀框(ORF)長1203 bp, 編碼400個氨基酸, 其5′UTR長238 bp, 3′UTR長228 bp。 cadm2bX2 cDNA全長2783 bp, 開放閱讀框長1323 bp, 編碼440個氨基酸, 其5′UTR長238 bp, 3′UTR長1222 bp。cadm2bX3 cDNA全長2755 bp, 開放閱讀框長1296 bp,編碼431個氨基酸, 5′UTR長238 bp, 3′UTR長1221 bp。cadm2bX6 cDNA全長2649 bp, 開放閱讀框1161 bp,編碼386個氨基酸, 5′UTR長238 bp, 3′UTR長1250 bp。這些cDNA序列已經(jīng)遞交至GenBank, cadm2b、cadm2bX2、cadm2bX3和cadm2bX6的序列號分別為KT893252、KT599436、KT599437、KT-599438。

圖 1 草魚cadm2b 全長mRNA的克隆過程Fig. 1 Schema of cloning cadm2b full-length cDNAs of grass carpA. 草魚cadm2b 3′RACE產(chǎn)物的電泳圖譜; B. 克隆草魚cadm2b全長剪切突變體的引物位置; M. MarkerA. Gel electrophoretogram of 3′RACE products of cadm2b in grass carp; B. Positions of PCR primers used in cloning full length cDNAs of grass carp cadm2b splice variants. M. Marker

圖 2 草魚cadm2b、cadm2bX2、cadm2bX3、cadm2bX6 cDNA的差異Fig. 2 The differences of grass carp cadm2b, cadm2bX2, cadm 2bX3 and cadm2bX6 cDNAs相同的花紋標(biāo)示具有相同核酸序列的cDNA片段, 平行雙斜杠表示忽略部分相同的序列Same decorative box indicates the region with identical nucleotide sequence. Double parallel lines indicate the skipped identical nucleotide sequence

如圖 2, 5′UTR區(qū)域的序列都相同。在CDS區(qū)域, cadm2bX2具有一段長27 bp的獨有序列, 位于CDS區(qū)域的第962位到988位堿基; cadm2bX6則在1084位與1085位堿基之間較其余3個剪切突變體缺失一段長106 bp的序列, 這段序列在cadm2b和cadm2bX3中位于第1085到1190位堿基, 而在cadm2bX2序列中則由于其獨有片段的影響位于1112到1217位堿基。值得注意的是, 從這個差異片段之后開始的直到polyA尾, cadm2bX2、cadm 2bX3和cadm2bX6這3個剪切突變體的堿基序列是完全一致的, 而cadm2b與其余3個剪切突變體的序列明顯不同。

2.2 不同物種的cadm2b基因氨基酸序列比較和聚類分析

基于4個剪接體CDS區(qū)的核苷酸序列使用Primer Premier 5軟件進行氨基酸序列預(yù)測, 獲得4個剪接體可能的蛋白氨基酸序列。預(yù)測的草魚CADM2b蛋白氨基酸序列經(jīng)Jellyfish軟件比對, 顯示其與GenBank中斑馬魚CADM2a (NP_956958.1)、斑馬魚CADM2b (NP_001107027.1)、爪蟾CADM2 (NP_001005713.1)、黑猩猩CADM2 (XP_00944 4170.1)、雞CADM2 (XP_004938397.1)、小鼠CADM2 (NP_848836.2)、人CADM2 (NP_001161 146.1)的同源基因蛋白序列相似性分別為73.3%、97.2%、60.6%、63%、52.7%、68.5%和61.4%。除斑馬魚以外, 在以上列舉的物種中無其余3個蛋白亞型CADM2bX2、CADM2bX3和CADM2bX6的對應(yīng)蛋白, 因此并未對它們進行蛋白比對。

基于CADM2b氨基酸序列的同源性分析, 我們集中現(xiàn)有其他物種的CADMs基因數(shù)據(jù), 利用MEGA 5.1軟件的Neighbor-joining方法構(gòu)建了不同物種CADMs家族的系統(tǒng)進化樹(圖 3)。由圖可見, 草魚CADM2b首先與斑馬魚CADM2b發(fā)生聚類, 較其他物種具有最接近的親緣關(guān)系。

圖 3 依據(jù)草魚CADM2b蛋白氨基酸序列所構(gòu)建的部分脊椎動物進化樹Fig. 3 The unrooted phylogenetic tree of some vertebrates based on CADM2b amino acid sequences

2.3 草魚CADM2b蛋白中功能區(qū)域結(jié)構(gòu)域的預(yù)測

使用NCBI和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)在線分析軟件對預(yù)測的草魚CADM2b蛋白和3個轉(zhuǎn)錄突變體CADM2bX2、X3、X6蛋白進行蛋白結(jié)構(gòu)域分析。分析結(jié)果表明, CADM2b和CADM2bX2、X3、X6都具有CADM家族保守的4個功能區(qū), 但存在蛋白結(jié)合位點的差異(圖 4)。在N端, 4個蛋白的第1到第24位氨基酸均為蛋白的信號肽結(jié)構(gòu), 3個Ig樣(Immunoglobulin-like, Ig-like)結(jié)構(gòu)域分別位于蛋白序列的第35到第129位, 第151到第229位, 第247到第 310位。3個Ig結(jié)構(gòu)域從前到后分別屬于Ⅴ型、C1型和Ⅰ型Ig結(jié)構(gòu)域, 第一個Ig結(jié)構(gòu)域與人類CADM2蛋白的第一個Ig樣結(jié)構(gòu)域高度相似, 第二個Ig結(jié)構(gòu)域與人類所有CADMs家族(CADM1、2、3、4)蛋白中的第二個Ig樣結(jié)構(gòu)域高度相似, 而第三個Ig樣結(jié)構(gòu)域與人類CADM2蛋白的第3個Ig樣結(jié)構(gòu)域有著高度的相似性。在C端, 這4個蛋白均具有一個單次跨膜結(jié)構(gòu)域：在CADM2b和CADM2bX3、CADM2bX6中位于第335到第357位氨基酸, 在CADM2bX2中則位于第344到第366位氨基酸。CADM2b、CADM2bX2、CADM 2bX3中具有與4.1蛋白相互作用的位點。該位點在CADM2B和CADM2bX3中定位于第358到第371位氨基酸上, 在CADM2bX2中則定位于第367到第380位氨基酸上。在4個由前體mRNA不同剪接而形成的蛋白質(zhì)中, 只有CADM2b具有與PDZII型蛋白相互作用的位點, 該位點定位于C端末端的第397到400位氨基酸上。

圖 4 草魚CADM2b四種蛋白亞型的預(yù)測結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 4 The prediction structures of four protein isoforms of CADM2b in grass carp

2.4 草魚cadm2b基因在草魚成體組織的表達

為了檢測cadm2b基因在草魚成體組織中的表達, 我們依據(jù)NCBI所提供的斑馬魚cadm2b基因內(nèi)含子結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù), 在草魚cadm2b基因中設(shè)計了跨第四內(nèi)含子的特異性引物。用草魚基因組DNA進行的PCR擴增所獲得的產(chǎn)物片段長長度在1600—1800 bp (圖 5A), 而cDNA作為模板擴增的RT-PCR產(chǎn)物長度為150 bp (圖 5B), 說明該引物的確是跨草魚cadm2b基因的第四內(nèi)含子。這一結(jié)果提示草魚與斑馬魚cadm2b基因可能具有相似的基因組結(jié)構(gòu)。

半定量RT-PCR只在成體草魚的腦中檢測到了cadm2b的表達, 在其他組織中沒有檢測到可分辨的表達(圖 5B)。為確定在其他組織中是否有微量表達, 我們用套式PCR引物進行了第二輪檢測。肝、腎、心臟和肌肉組織中都能檢測到cadm2b的表達,而在鰓和胰腺組織中仍然檢測不到表達(圖 5B)。這些結(jié)果說明成體草魚中cadm2b在腦中有高水平表達, 在肝、腎、心臟和肌肉組織中有較低水平的表達, 在鰓和胰腺組織中不表達。草魚中的這種組織表達式樣與小鼠中cadm2的組織表達式樣[23]相似, 即主要表達于腦組織中, 同時也在多種組織中有微量表達。

圖 5 草魚cadm2b基因在成體組織中的表達Fig. 5 The expression of cadm2b in various adult tissues of grass carpA. 以草魚基因組DNA為模板擴增的cadm2b產(chǎn)物電泳圖譜; B.以mRNA為模板的RT-PCR和套式PCR電泳圖譜; C. cadm2bX2與cadm2b在不同成體草魚組織中的相對表達量, 誤差線代表平均數(shù)標(biāo)準差; 套式PCR中腦組織所用模板為稀釋200倍的RTPCR產(chǎn)物, 其余組織為稀釋100倍的RT-PCR產(chǎn)物;1—7分別為腦, 肝, 腎, 鰓, 胰, 心, 肌肉樣品; M. 分子長度標(biāo)記A. Gel electrophoretogram of PCR products amplified from grass carp genome DNA template; B. Gel electrophoretogramof RTPCR and nested-PCR products; C. The expression of cadm2bX2 and cadm2b in different adult tissues, bar ralats represent mean standard deviation. The templates used in nested primer PCR are the 200 and 100 times diluted RT-PCR products in the brain and other tissues, respectively. 1—7 stands for brain, liver, gill, kidney, pancreas, heart, muscle tissue, respectively. M. molecular length markers

在4個剪接體中cadm2bX2和cadm2b分別在其序列中部和3′ 端的差異剪接位點有獨有序列, 可以設(shè)計特異性擴增引物。為了解不同剪接突變體在成體組織中的豐度是否存在差異, 我們用實時定量RT-PCR方法比較了cadm2bX2和cadm2b剪接突變體在成體組織中的豐度差異。檢測cadm2bX2的定量引物為: RTX2 S: AGATTTCCCAGGTACAA CTACAGATCCTAACGCT, RTX2 AS: TGATGA AGCACAGGGTGATGAAGAC, 跨越3′ 端的差異剪接位點。檢測cadm2b的定量引物為: RT cadm2b S: ACACTGCCATCATCAATGCGGAGGGGA ACC, RTcadm2b AS: AACAGAGACAAAGCCAG ACCAGACT, 跨越中部的差異剪接位點。電泳檢驗結(jié)果表明這兩對引物的RT-PCR產(chǎn)物都為單一特異性產(chǎn)物。實時定量RT-PCR結(jié)果表明在腦組織中cadm2b和cadm2bX2兩種剪接體都有高水平表達,但cadm2b剪接體的豐度比cadm2bX2剪接體的豐度高約4倍; 在肝、腎、鰓、胰、心臟和肌肉等組織中都只檢測到微量的cadm2b剪接體存在, 沒有檢測到cadm2bX2剪接體的存在 (圖 5C)。

3 討論

本實驗使用RT-PCR、RACE等方法克隆了草魚cadm2b基因的4條長度不同的cDNA全長序列。序列比對分析表明這些mRNA是cadm2b基因的不同剪接突變體, 分別命名為cadm2b, cadm2bX2、X3、X6。根據(jù)堿基序列所進行的氨基酸序列和蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示這4個CADM2b蛋白亞型都具有CADM家族保守的4個功能區(qū), 但其蛋白結(jié)合位點存在差異。CADM2b剪接突變體具有全部功能區(qū),而其他3個剪接突變體都有功能區(qū)缺失; 實時定量RT-PCR檢測結(jié)果表明cadm2b剪接突變體的豐度顯著高于cadm2bX2, 提示CADM2b剪接突變體可能是該基因的主要表達形式。在草魚成體組織中cadm2b基因在腦中高水平表達, 在肝、腎、心臟和肌肉組織中有微量表達, 提示草魚中CADM2b主要由非免疫細胞, 而不是由免疫肥大細胞特異性表達分泌的細胞黏附因子。

3.1 草魚基因組中cadm2b 前體mRNA上可能有3個選擇性剪接位點

Thomas Biederer[26]研究發(fā)現(xiàn), 在人類基因組中cadm2基因有10個外顯子。第一個外顯子存在一個替代剪接供體位點(Alternative splice donor sites),不同剪接突變體之間比對發(fā)現(xiàn)選擇性剪接現(xiàn)象出現(xiàn)在第八個外顯子處, 共產(chǎn)生3種剪接突變體。在小鼠基因組中cadm2b有11個外顯子, 選擇性剪接現(xiàn)象出現(xiàn)在第九外顯子處, 共產(chǎn)生2種剪接突變體。斑馬魚基因組中cadm2b有10個外顯子[26], NCBI數(shù)據(jù)庫中預(yù)測可能產(chǎn)生7個剪接變體, 但尚無克隆不同剪接變體的實驗報道。

我們所獲得的草魚四種不同的cadm2b mRNA剪接體中, cadm2b 編碼區(qū)從3′末端的最后13個堿基到整個3′UTR區(qū)域的序列與其他3個剪接的相應(yīng)序列都完全不同, 說明在草魚cadm2b 基因的3′端區(qū)域有一個選擇性剪接位點, 2種不同的剪接方式。在cadm2bX6編碼區(qū)靠近的3′端的1084位與1085位堿基之間缺失一段在其他3個剪接突變體中都存在的序列, 說明在此處存在第二個選擇性剪接位點, 兩種不同的剪接方式。cadm2bX6在3′端的堿基序列雖然與cadm2bX2和X3相同, 但因不同的剪接選擇而發(fā)生了移碼突變導(dǎo)致了其后端所編碼的氨基酸序列與cadm2bX2和X3完全不同。在cadm2bX2編碼區(qū)第962位到988位堿基處有一段在其他3個剪接變體中都缺失的序列, 說明在該位置存在第三個選擇性剪接位點, 2種不同的剪接方式。這3個選擇性剪接位點的存在證明了魚類的cadm2b基因具有比哺乳動物更多樣化的轉(zhuǎn)錄后剪接方式, 也提示草魚cadm2b可能有更多的mRNA剪接體。

3.2 草魚CADM2b四個蛋白亞型功能的可能差異

在CADMs家族中, 蛋白N端的3個連續(xù)Ig結(jié)構(gòu)域以非鈣離子依賴的親同性(Homophilic)、親異性(Heterophilic)相互作用與靶受體結(jié)合, 介導(dǎo)跨膜細胞黏附的作用, 這與免疫細胞與靶細胞之間的識別和黏附作用密切相關(guān)。在C端, CADMs家族中的4.1蛋白結(jié)合位點能與4.1B/Dal1蛋白和4.1N蛋白發(fā)生相互作用[10,29]。4.1B蛋白[30]是一種的細胞骨架錨定蛋白, 它通過與跨膜蛋白胞質(zhì)端的4.1蛋白結(jié)合位點相互作用, 直接介導(dǎo)細胞質(zhì)膜與細胞骨架之間相互連接。位于C末端的PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白結(jié)合位點則在家族中和在進化上都高度保守[25], 特異性的與膜結(jié)合鳥苷酸激酶家族(Membrane-associated guanylate kinase, MAGUK)成員發(fā)生相互作用, 介導(dǎo)細胞信號的傳遞與細胞極性的維持[31]。目前發(fā)現(xiàn)能與CADMs家族發(fā)生相互作用的MAGUK家族成員有鈣/鈣調(diào)素相關(guān)絲氨酸蛋白激酶(Calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase, CASK)[16]、Dlg3[22](Discs large 3)、MPP3(Membrane proteinpalmitoylated 3)[9]和Pals2[32]。

根據(jù)草魚cadm2b基因4種不同剪接體的序列所預(yù)測的4種CADM2b蛋白亞型中, 只有CADM2b具有與斑馬魚以及其他物種同源蛋白一致的所有功能區(qū)域, 即胞外區(qū)N端的短信號肽, 3個連續(xù)的Ig結(jié)構(gòu)域, 連接蛋白胞外區(qū)和胞漿區(qū)的單次跨膜結(jié)構(gòu)域,胞漿區(qū)的近膜4.1蛋白結(jié)合位點, 以及位于C末端的Ⅱ型PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白結(jié)合位點。因此, CADM2b可能具有靶細胞識別、黏附、信號傳導(dǎo)和細胞極性維持等所有功能的蛋白質(zhì)。其他3種蛋白質(zhì)亞型都具有完整胞外結(jié)構(gòu)域和單次跨膜結(jié)構(gòu)域, 因此都可能起介導(dǎo)細胞間的黏附的作用。但CADM2bX2和CADM2bX3缺乏CADMs家族所共有的Ⅱ型PDZ蛋白結(jié)合位點, 不可能在介導(dǎo)細胞間黏附后, 進而起介導(dǎo)細胞信號的傳遞與細胞極性的維持的作用, 而只能起穩(wěn)固細胞膜與細胞骨架間相互聯(lián)系的作用。而CADM2bX6因同時缺乏與4.1蛋白和Ⅱ型PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白的結(jié)合位點, 則可能既不參與介導(dǎo)細胞膜與細胞骨架的連接, 也不參與信號傳導(dǎo)和細胞極性的維持, 僅僅參與介導(dǎo)細胞間識別與黏附,作為細胞膜之間的錨定分子起鞏固細胞間黏附的作用。

3.3 草魚cadm2b可能在成體不同組織中介導(dǎo)細胞黏附

成體草魚cadm2b基因不僅在腦組織中高水平表達, 也在肝、腎、心臟和肌肉組織中有微量表達。在成體草魚中的這種組織表達式樣與在成體小鼠中的組織表達式樣高度相似。在成體小鼠中cadm2b主要表達于腦、嗅球和睪丸, 同時也在心臟、肺、腎、肝和消化道中存在極微量表達[5]。這種相似性提示在脊椎動物進化過程中cadm2b 基因的功能和組織特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制都是保守的。cadm2b 基因在草魚中與在哺乳動物中一樣, 也可能在多種組織和器官中介導(dǎo)多種不同細胞的黏附。由于草魚CADM2b蛋白主要由非免疫細胞表達和分泌, 可能通過介導(dǎo)免疫肥大細胞與病原靶細胞的黏附而起非特異性抵御病害感染的作用。

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MOLECULAR CLONING AND EXPRESSING ANALYSIS OF CADM2B IN ADULT TISSUES OF GRASS CARP, CTENOPHARYNGODON IDELLUS

LIANG Jian-Jia1, ZHANG Qiong-Yu2, LI Heng1, ZHENG Jian-Bo1and LUO Chen1
(1. College of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China; 2. Department of Basic Medical Science, Yongzhou Vocational Technical College, Yongzhou 425100, China)

CADMs (cell adhesion molecules) family play important roles in establishing the first line of defense against illnesses and infections by mediating adhesion between immune mast cells and their target cells. Grass carp (Ctenopharyngodon idellus) has low livability at the age of 1 and 2 due to its susceptibility to infection by virus or bacterium. To investigate whether CADMs participate in building the first line of defense against infection in grass carp, we cloned the mRNA of grass carp cadm2b, and identify 4 different full length cDNA of cadm2b from grass carp brain tissue. According to sequences alignment, sequences of the 5′ terminal are identical among all the four cDNAs while various deleted fragments found in three different position in their 3′ terminals. These results indicated that these four mRNAs, named cadm2b, cadm2bX2, cadm2bX3 and cadm2bX6, are splicing variants from cadm2b gene. The full length of cadm2b is 1669 bp with a 1203 bp long open reading frame (ORF) coding 400 amino acids. The full length of cadm2bX2 is 2783 bp with a 1323 bp long ORF coding 440 amino acids. The full length of cadm2bX3 is 2755 bp with a 1296 bp long ORF coding 431 amino acids. The full length of cadm2bX6 cDNA is 2649 bp with a 1161 bp long ORF coding 386 amino acids. Prediction of amino acid sequences base on nucleotide sequenceds showed that all the four CADM2b isoforms contain the four conserve functional domains of CADM family in the N-terminals, but the C-terminals are variance. CADM2b has a juxtamembrane 4.1 protein binding domain and PDZ type Ⅱ protein binding domain in the C-terminal. Both CADM2bX2 and CADM2bX3 lack the PDZ type Ⅱ protein binding domain. CADM2bX6 possesses neither the juxtamembrane 4.1 protein binding domain nor the PDZ type Ⅱ protein binding domain. Quantitative RT-PCR results suggested that splicing variant cadm2b is the main form of cadm2b mRNA. A highlevel cadm2b was detected in brain tissue and a very low-level cadm2b was detected in liver, kidney, heart and muscle. These findings suggest that CADM2b is a cell adhesion molecule synthesized and secreted by nonimmune cells, and might play a role in against various infections by mediating adhesion between immune mast cells and their target cells in grass carp.

Grass carp; cadm2b; Gene cloning; Tissue expression

Q344+.1

A

1000-3207(2017)01-0009-09

10.7541/2017.2

2016-01-25;

2016-06-17

浙江省科技重大專項(2012C12907-9)資助 [Supported by Scientific Research Funds of Zhejiang Provincial Science and Technology Department (2012C12907-9)]

梁健嘉(1990—), 男, 廣西羅城仫佬族自治縣人; 碩士; 主要從事發(fā)育生物學(xué)研究。E-mail: liangjianjiannick@126.com

羅琛, 男, 教授, 博士生導(dǎo)師; 主要從事細胞與發(fā)育生物學(xué)研究。E-mail: luoc@zju.edu.cn