刀鱭嗅覺(jué)受體基因MOR-51I2克隆、序列分析及組織表達(dá)

王曉梅朱國(guó)利唐文喬

(1. 上海海洋大學(xué)魚類研究室, 上海 201306; 2. 上海市海洋動(dòng)物系統(tǒng)分類與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306)

刀鱭嗅覺(jué)受體基因MOR-51I2克隆、序列分析及組織表達(dá)

王曉梅1,2朱國(guó)利1,2唐文喬1,2

(1. 上海海洋大學(xué)魚類研究室, 上海 201306; 2. 上海市海洋動(dòng)物系統(tǒng)分類與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306)

為研究刀鱭的嗅覺(jué)受體(Olfactory receptor, OR)是否參與其生殖洄游過(guò)程, 利用基因組步移技術(shù), 從洄游型刀鱭(Coilia nasus)中克隆出嗅覺(jué)受體基因MOR-51I2的基因序列全長(zhǎng)。該基因?yàn)閱瓮怙@子結(jié)構(gòu), 編碼區(qū)長(zhǎng)為999 bp。在3′ UTR區(qū)域具有一段微衛(wèi)星序列, 以(AC)n為重復(fù)單位, 并夾有若干T或G堿基, 且在不同生態(tài)型間具有明顯長(zhǎng)度差異。MOR-51I2基因所編碼的蛋白具有7次疏水性α-螺旋的跨膜結(jié)構(gòu), 為G-蛋白偶聯(lián)受體。MOR-51I2基因與已報(bào)道的其他魚類的OR基因所編碼的氨基酸序列的同源性在51%以上, 其中與大西洋鯡(Clupea harengus)的OR51I2-like基因的同源性高達(dá)83%。經(jīng)qRT-PCR分析顯示, 在定居型刀鱭中, MOR-51I2基因主要在嗅囊和性腺中表達(dá), 在肝臟、鰓、肌肉微弱表達(dá), 在心臟和眼睛中幾乎不表達(dá)。其中, 雌性嗅囊中的表達(dá)量約是雄性嗅囊中的2倍, 是精巢和卵巢中的80—100倍。在洄游型刀鱭中, 該基因在雄性嗅囊的表達(dá)量約是雌性嗅囊中的6倍。MOR-51I2基因在洄游型刀鱭的雌性嗅囊中的表達(dá)量約是定居型刀鱭的雌性嗅囊中的1/5, 而在洄游型刀鱭的雄性嗅囊中的表達(dá)量卻是定居型刀鱭的雄性嗅囊中的3倍。這些結(jié)果表明, MOR-51I2基因不但參與刀鱭的嗅覺(jué)功能, 而且可能參與了刀鱭的性腺發(fā)育及生殖洄游過(guò)程, 同時(shí)也可能與其生態(tài)型的分化相關(guān)。

刀鱭; 嗅覺(jué)受體基因; 組織表達(dá); 生殖洄游; 生態(tài)型分化

刀鱭(Coilia nasus)是鯡形目(Clupeiformes)、鳀科(Engraulidae)的一種中小型魚類, 具有洄游和定居兩種生態(tài)型[1—4]。洄游型平時(shí)棲息于中國(guó)、日本和朝鮮半島的近海, 春季性成熟后進(jìn)入河流的中、下游產(chǎn)卵, 孵化后的幼魚順流而下進(jìn)入海中肥育。定居型主要分布于長(zhǎng)江中下游干流及其附屬湖泊, 可在淡水中完成整個(gè)生活史[1,2,4]。在長(zhǎng)江中,定居型刀鱭的資源量豐富, 是低值漁品。但洄游型刀鱭的種群數(shù)量卻呈急劇下降趨勢(shì), 已成為長(zhǎng)江流域最名貴的水產(chǎn)品之一。刀鱭的洄游型和定居型形態(tài)相近, 生殖洄游是區(qū)別兩者的主要表征之一。鑒別生態(tài)類型、闡明生殖洄游機(jī)制對(duì)保護(hù)和利用長(zhǎng)江洄游型刀鱭這一珍貴漁業(yè)資源具有積極意義。已有學(xué)者嘗試用外部形態(tài)的多元分析[5—7]、“寄生蟲(chóng)標(biāo)記”[8,9]、耳石形態(tài)及元素成分[10—13]、肌肉同位素組分差異[14]以及某些基因差異[4,15]等鑒別刀鱭的不同生態(tài)類型, 但對(duì)刀鱭生殖洄游機(jī)制的研究才剛起步[16,17]。

魚類生殖洄游的嗅覺(jué)定向(Olfactory orientation)假說(shuō)自20世紀(jì)50年代被提出以來(lái)[18], 嗅覺(jué)在美洲鰻(Anguilla rostrate)、紅大麻哈魚(Oncorhynchus nerka)、大西洋鮭(Pacific salmon)等過(guò)河口生殖洄游魚類的洄游中所起的重要作用已逐漸被證實(shí)[19—21]。魚類嗅覺(jué)依靠水中氣味分子如氨基酸、核苷酸、類固醇、前列腺素和膽汁酸等誘導(dǎo)作用于嗅覺(jué)受體蛋白而引起[16,22,23]。嗅覺(jué)受體主要在嗅覺(jué)上皮組織中表達(dá), 氣味分子與嗅覺(jué)受體蛋白結(jié)合、識(shí)別并引發(fā)化學(xué)信號(hào), 通過(guò)嗅神經(jīng)傳送到神經(jīng)中樞從而實(shí)現(xiàn)嗅覺(jué)識(shí)別[24], 嗅覺(jué)受體蛋白則由嗅覺(jué)受體基因所編碼[25—27]。已發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物嗅覺(jué)受體有在進(jìn)化上相互獨(dú)立的4個(gè)家族, 分別為主嗅覺(jué)受體(Main olfactory receptors, MORs)、犁鼻器受體(Vomeronasal receptors, VRs)、痕量胺相關(guān)受體(Trace-amine associated receptors, TAARs)和類甲酰肽受體蛋白(Formyl peptide receptor-like proteins)[28]。主嗅覺(jué)受體是數(shù)量最大的嗅覺(jué)受體基因亞家族, 最早發(fā)現(xiàn)于褐家鼠(Rattus norvegicus), 編碼區(qū)長(zhǎng)度一般650 bp左右, 無(wú)內(nèi)含子[29,30], 可識(shí)別水溶性氣味分子[26,29,31]。主嗅覺(jué)受體基因目前已在一些模式魚類, 如斑馬魚(Danio rerio)、紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)、綠斑河鲀(Tetraodon nigroviridis)、三刺魚(Gasterosteus aculeatus)、青鳉(Oryzias latipes)等[22,26,30,32,33]開(kāi)展過(guò)研究, 但在非模式物種中研究尚少。在對(duì)多個(gè)刀鱭嗅囊轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序分析的基礎(chǔ)上, 我們已初步篩選出洄游型與定居型刀鱭差異表達(dá)的幾個(gè)MOR基因[16,22]。本研究克隆出其中的一個(gè)MOR基因, 分析了基因結(jié)構(gòu)及在不同組織中的表達(dá), 旨在弄清其在刀鱭兩個(gè)生態(tài)型中的序列差異, 為長(zhǎng)江刀鱭生殖洄游的嗅覺(jué)定向機(jī)制和生態(tài)型演化研究提供一些線索。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

實(shí)驗(yàn)所用刀鱭定居型樣本為2014年3月采自江西鄱陽(yáng)湖都昌水域, 洄游型樣本2014年5月采自長(zhǎng)江靖江江段, 都是2齡、性腺發(fā)育Ⅲ期的個(gè)體, 標(biāo)注為定居PY-1-PY-6, 洄游JJ-1-JJ-6。所有樣本都用定置刺網(wǎng)捕獲, 尚未死亡的個(gè)體立即包埋于-20℃醫(yī)用冰袋中, 使其失去知覺(jué)。在現(xiàn)場(chǎng)迅速用剪刀剖開(kāi)腹部, 檢視性腺發(fā)育狀況, 對(duì)性腺發(fā)育Ⅲ期的個(gè)體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)取樣[31]。定居型樣本取嗅囊、精巢、卵巢、肌肉、心臟、眼睛、胃壁、肝臟和腮等組織或器官, 洄游型樣本僅取嗅囊, 保存于液氮。返回實(shí)驗(yàn)室以后, 根據(jù)刀鱭矢耳石重量與年齡的對(duì)應(yīng)關(guān)系[10,13], 留用2齡個(gè)體作為實(shí)驗(yàn)樣本。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前取出, 置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 刀鱭基因組DNA及總RNA的提取

利用動(dòng)物組織基因組DNA小量提取試劑盒(上海萊楓生物科技有限公司)并按說(shuō)明書提取洄游(JJ-1-JJ-6)、定居(PY-1-PY-6)刀鱭肌肉基因組DNA, 保存于-20℃冰箱。用EastepTM總RNA提取試劑盒(上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司)提取定居型刀鱭組織或器官及洄游型刀鱭(雌/雄)嗅囊的總RNA, 進(jìn)行3個(gè)重復(fù)。提取后的基因組DNA和總RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè), 判斷其完整性; Thermo Nandrop2000分光光度計(jì)測(cè)RNA A260/ A280值, 評(píng)價(jià)純度, 估測(cè)濃度大小。產(chǎn)物置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 刀鱭cDNA文庫(kù)的建立

使用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒及其方法(寶生物工程有限公司), 以O(shè)ligo dT Primer為引物對(duì)洄游型刀鱭嗅囊總RNA進(jìn)行普通反轉(zhuǎn)錄, 獲得第一鏈cDNA, 為后續(xù)判斷MOR-51I2基因是否含有內(nèi)含子做準(zhǔn)備。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒(同上), 以RT Primer Mix為引物獲得反轉(zhuǎn)錄cDNA, 為后續(xù)qRT-PCR反應(yīng)做準(zhǔn)備。產(chǎn)物保存于-20℃冰箱備用。

1.4 刀鱭MOR-51I2基因序列的獲取

依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期從洄游型刀鱭嗅囊cDNA文庫(kù)中獲得的MOR-51I2基因序列片段, 參照Genome Walking Kit試劑盒(寶生物工程有限公司)中對(duì)特異性引物的設(shè)計(jì)要求, 設(shè)計(jì)出獲取3′序列的特異性引物(3′-SP1、3′-SP2和3′-SP3, 表 1)和獲取5′序列的特異性引物(5′-SP1、5′-SP2和5′-SP3, 表 1)(引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成)。優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件, 利用試劑盒中AP2簡(jiǎn)并引物和特異性引物SP1/SP2/SP3進(jìn)行3輪熱不對(duì)稱PCR反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、切膠回收和克隆測(cè)序(序列均由上海邁浦生物科技有限公司測(cè)序)。最終獲得基因片段的側(cè)翼序列, DNAMAN 6.0軟件拼接后獲得目的基因序列。

表 1 引物序列Tab. 1 Primer sequences

1.5 刀鱭MOR-51I2基因開(kāi)放閱讀框的獲取

(2)合理利用區(qū)塊鏈技術(shù)。區(qū)塊鏈技術(shù)是一種互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)技術(shù)，其特點(diǎn)是去中心化、不可纂改性、公開(kāi)透明，讓每個(gè)人均可參與數(shù)據(jù)庫(kù)記錄。區(qū)塊鏈技術(shù)憑借其去中心化的特點(diǎn)，能夠建立一個(gè)基于網(wǎng)絡(luò)的公共賬本，每一個(gè)區(qū)塊包含一次網(wǎng)絡(luò)交易，從而構(gòu)建一個(gè)更加可靠的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，從根本上解決網(wǎng)絡(luò)交易中欺詐和“尋租”現(xiàn)象。因此，相關(guān)機(jī)構(gòu)應(yīng)合理利用區(qū)塊鏈技術(shù)，進(jìn)一步降低當(dāng)前電子支付存在的病毒侵襲、黑客攻擊、支付數(shù)據(jù)更改、資金無(wú)故流失等風(fēng)險(xiǎn)，健全信用體系，保障用戶權(quán)益。

利用NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中Blastx工具, 對(duì)刀鱭MOR-51I2基因序列進(jìn)行比對(duì),尋找同源性最高的基因序列, 再用jellyfish軟件預(yù)測(cè)該基因的開(kāi)放閱讀框區(qū)域。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果, 在MOR-51I2基因的開(kāi)放閱讀框兩側(cè)設(shè)計(jì)特異性引物(ORF-R/ORF-F, 表 1), 進(jìn)行基因序列的驗(yàn)證, 判斷是否具有內(nèi)含子并獲取基因的開(kāi)放閱讀框。以洄游型刀鱭基因組DNA和嗅囊cDNA為模板, 進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系: 模板＜1 μg, ORF-R (10 μmol/L) 0.5 μL, ORF-F (10 μmol/L) 0.5 μL, 10×Taq Plus Buffer 2.5 μL, dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 2 μL, Taq Plus DNA Polymerase (2.5 U/μL) 0.5 μL, 加ddH2O至25 μL。反應(yīng)條件: 95℃ 5min; 95℃ 45s, 62℃45s, 72℃ 1min 30s, 30個(gè)循環(huán); 72℃ 10min; 10℃保存。對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),合格產(chǎn)物外送測(cè)序。為獲得具有完整開(kāi)放閱讀框的MOR-51I2基因, 利用ORF-R/ORF-F引物對(duì)洄游和定居刀鱭基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng), 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同上。檢測(cè)后, 反應(yīng)產(chǎn)物外送測(cè)序, 拼接后獲得目的片段。

1.6 刀鱭MOR-51I2基因序列分析

利用VecScreen(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ tools/vecscreen/)在線去除上述測(cè)序結(jié)果的載體, 用DNAMAN6.0軟件進(jìn)行與引物的比對(duì)和拼接, Blastx軟件進(jìn)行基因序列的預(yù)測(cè)翻譯及同源性分析。用Expasy網(wǎng)站(http://expasy.org/tools/)中的ProtParam工具(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì), ProtScale工具(http://ca.expasy. org/tools/protscale.html)分析蛋白質(zhì)親疏水性, TMpred工具(http://www.ch.embnet.org/software/ TMPRED_form.html) 分析蛋白質(zhì)跨膜區(qū), Predict-Protein工具(http://www.predictprotein.org/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二維結(jié)構(gòu), SWISS-MODEL ((http://swissmodel. expasy.org)在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。最后通過(guò)NCBI中Nucleotide blast工具下載同源DNA序列、Protein Blast下載同源蛋白序列, 利用ClustalX軟件進(jìn)行序列比對(duì), MEGA 6.0軟件構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.7 刀鱭MOR-51I2基因的組織表達(dá)譜

用qRT-PCR反應(yīng)分析MOR-51I2基因在定居型刀鱭嗅囊、精巢、卵巢、肌肉、心臟、眼球、胃壁、肝臟及鰓等10個(gè)組織或器官及洄游型刀鱭嗅囊的相對(duì)表達(dá)水平。在MOR-51I2基因編碼區(qū)內(nèi)按熒光定量PCR反應(yīng)的要求, 設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物QOR-R/QOR-F (表 1)。內(nèi)參基因引物為GAPDHR/GAPDH-F (表 1), 采用SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒和Bio-rad CFX Connet實(shí)時(shí)定量PCR儀, 進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系: SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(2×) 10 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各0.4 μL, ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL, cDNA模板(＜100 ng) 2.0 μL, 滅菌蒸餾水6.8 μL, 共20 μL。以內(nèi)參基因引物作陽(yáng)性對(duì)照,滅菌蒸餾水作陰性對(duì)照, 每個(gè)組織和對(duì)照樣本均進(jìn)行3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)條件: 95℃ 30s; 95℃ 5s, 60℃ 30s, 72℃ 32s, 40個(gè)循環(huán); 并做溶解曲線。反應(yīng)結(jié)束后獲得并導(dǎo)出各樣本的Ct (threshold cycle)值, 隨后采用2-ΔΔCt法[34]進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和表達(dá)差異性分析。

1.8 刀鱭MOR-51I2基因中微衛(wèi)星序列分析

由于測(cè)序所得的MOR-51I2基因序列發(fā)現(xiàn)在非編碼區(qū)3′ UTR有一段微衛(wèi)星重復(fù)序列, 因而依據(jù)微衛(wèi)星片段兩側(cè)設(shè)計(jì)了引物(OR-R/OR-F, 表 1)。以洄游型和定居型刀鱭基因組DNA為模板, 進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系: 模板＜1 μg, OR-F (10 μmol/L) 0.5 μL, OR-R (10 μmol/L) 0.5 μL, 2×Taq Plus PCR MasterMix 12.5 μL, 加ddH2O至25 μL。反應(yīng)條件: 95℃ 5min; 95℃ 45s, 63℃ 45s, 72℃ 30s, 30個(gè)循環(huán); 72℃ 10min; 10℃保存。反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 刀鱭MOR-51I2的基因序列

2.2 刀鱭MOR-51I2的蛋白結(jié)構(gòu)

經(jīng)ProtParam和ProtScale在線分析, 發(fā)現(xiàn)刀鱭MOR-51I2基因序列所編碼的蛋白質(zhì)序列, 其理化性質(zhì)為: 氨基酸殘基332個(gè)、分子式為C1751H2724N430O443S21、相對(duì)分子質(zhì)量為37560.7、理論pI值為9.45、正/負(fù)電荷殘基數(shù)為29和15、蛋白質(zhì)序列的N端為起始密碼子所編碼的Met殘基、半衰期為30hours、不穩(wěn)定系數(shù)(II)為31.27(＜40, 表明此蛋白較穩(wěn)定)以及總平均親水性(GRAVY)為0.648。經(jīng)Predict Protein在線預(yù)測(cè)工具, 發(fā)現(xiàn)刀鱭MOR-51I2蛋白具有9個(gè)蛋白質(zhì)綁定位點(diǎn)、6個(gè)DNA綁定位點(diǎn)、7個(gè)核苷酸綁定位點(diǎn)(圖 2)。功能區(qū)域主要集中在氨基酸序列的N端、TM5-TM6間非跨膜區(qū)以及羧基端。二級(jí)結(jié)構(gòu)有55.72%為α-型螺旋、10.24% β-型螺旋以及34.04% β-型轉(zhuǎn)角, 并無(wú)二硫鍵結(jié)構(gòu)。經(jīng)SWISS-MODEL在線預(yù)測(cè), 該蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)具有7個(gè)α-型螺旋跨膜結(jié)構(gòu)(圖 3)。

2.3 刀鱭MOR-51I2基因與其他物種相關(guān)基因的進(jìn)化關(guān)系

圖 1 洄游型刀鱭(JJ-5) MOR-51I2基因的核苷酸序列和氨基酸序列Fig. 1 The sequence of nucleotide and amino acid of MOR-51I2 gene in the migratory C. nasus (JJ-5)“=”. 起始密碼子ATG、終止密碼子TAA (“*”); TM1-7. 7個(gè)跨膜域; “-”. 為微衛(wèi)星序列, 長(zhǎng)120 bp“=”. The initiation codon ATG, the termination codon TAA (“*”); TM1-7. Seven transmembrane regions; “-”. Microsatellite sequence, 120 bp

圖 2 MOR-51I2蛋白的功能區(qū)、二級(jí)結(jié)構(gòu)類型和跨膜區(qū)Fig. 2 The protein function region, secondary structure type and transmembrane region of MOR-51I2 protein“Protein binding region”. 蛋白質(zhì)綁定位點(diǎn); “DNA binding region”. DNA綁定位點(diǎn); “RNA binding region”. RNA綁定位點(diǎn); “Helix”. α-型螺旋; “Strand”表示β-型螺旋; “Buried”. 鑲嵌于生物膜內(nèi)片段; “Exposed”. 非鑲嵌于膜內(nèi)的片段; “TM1-7”. 蛋白質(zhì)的7個(gè)跨膜區(qū)域“Protein binding region”. Protein binding sites; “DNA binding region”. DNA binding sites; “RNA binding region”. RNA binding sites;“Helix”. α-helix; “Strand”. β-helix; “Buried”. The sequence that mosaiced in the biofilm; “Exposed”. The sequence that non-mosaiced in the biofilm; “TM1-7”. Seven transmembrane regions

圖 3 MOR-51I2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖Fig. 3 The predicted three-dimensional structure of MOR-51I2 protein1—7表示蛋白質(zhì)7個(gè)α-型螺旋跨膜結(jié)構(gòu)1—7. Seven α-helix position

表 2 同源DNA序列Tab. 2 The homologous DNA sequences

利用NCBI中的nucleotide blast工具作在線預(yù)測(cè), 發(fā)現(xiàn)刀鱭MOR-51I2基因序列與其他魚類同源基因的同源性在66%—85% (表 2)。同一物種選取其中1個(gè)同源性最高的核酸序列進(jìn)行FASTA格式下載, 用MEGA6.0構(gòu)建Neighbour-joining進(jìn)化樹(shù)(圖 4)?？梢?jiàn), 基于核酸序列所構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)可分為兩大支, 其中刀鱭MOR-51I2基因與大西洋鯡(Clupea harengus) OR51I2-like基因、墨西哥脂鯉(Astyanax mexicanus) OR4K15-like基因及斑點(diǎn)雀鱔(Lepisosteus oculatus) OR4K15-like基因處于同一大分支, 序列之間的同源性較高, 分別為85%、76%和74%。但采用刀鱭MOR-51I2基因所編碼的氨基酸序列與其他魚類的同源嗅覺(jué)受體蛋白的氨基酸序列(表 3), 所構(gòu)建的NJ進(jìn)化樹(shù)(圖 5)與基于核酸序列所構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)(圖 4)有較大的差別。

2.4 刀鱭MOR-51I2基因的組織表達(dá)

利用特異性引物QOR-R和QOR-F對(duì)定居型刀鱭的10種組織或器官及洄游型刀鱭(雌/雄)的嗅囊進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng), 得出各樣品的Ct值。以在胃壁中的表達(dá)量為參照值, 利用2-ΔΔCt法分析所得的結(jié)果見(jiàn)圖 6?？梢?jiàn), MOR-51I2基因在肌肉、心臟和眼睛中幾乎不表達(dá); 在肝臟和鰓中的表達(dá)量也很低; 但在嗅囊和性腺中的表達(dá)量很高, 且嗅囊的表達(dá)量是性腺表達(dá)量的30—100倍。另外, 雌性嗅囊中的表達(dá)量約是雄性嗅囊的2倍, 而精巢中的表達(dá)量卻約是卵巢中的2倍。

用同樣方法對(duì)兩種生態(tài)型刀鱭嗅囊中的表達(dá)量進(jìn)行分析比較(圖 7), 顯示MOR-51I2基因在洄游型雄性嗅囊中的表達(dá)量約是其雌性嗅囊中的6倍、定居型雄性嗅囊中的3倍, 但洄游型雌性嗅囊中的表達(dá)量卻僅是定居型雌性嗅囊中的1/5。

2.5 刀鱭MOR-51I2蛋白在兩個(gè)生態(tài)型間的差異性分析

通過(guò)特異引物ORF-R/ ORF-F, 對(duì)洄游型刀鱭(JJ-1-JJ-6)和定居型刀鱭(PY-1-PY-6)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。獲得的DNA序列經(jīng)DNAMAN軟件整理, jellyfish軟件預(yù)測(cè)翻譯的蛋白質(zhì)序列。經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn), 兩個(gè)群體的MOR-51I2蛋白間的相似性為97.5%, 僅有若干氨基酸殘基的變化。

2.6 刀鱭MOR-51I2基因的微衛(wèi)星在不同生態(tài)型間的差異性

用特異引物OR-F/OR-R對(duì)洄游型(JJ-1-JJ-10)和定居型刀鱭(PY-1-PY-10)進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖 8)并測(cè)序。結(jié)果表明, 定居型群體的微衛(wèi)星片段長(zhǎng)度長(zhǎng)于洄游型群體, 但同一群體的不同個(gè)體間其長(zhǎng)度也有一定的變化。分析顯示, 洄游型群體內(nèi)的一致性為86.91%, 定居型群體內(nèi)為93.29%, 兩個(gè)群體間僅82.66%。洄游型群體的微衛(wèi)星組成平均為48.6(AC)、11.4(GC)、0.6(AG)、1.0(AA)及2.4(AT), 定居型群體則為57.0(AC)、12.6(GC)、1.8(AG)、1.0(AA)及4.4(AT), 可見(jiàn)定居型較洄游型多8.4組(AC)1.2組(GC)、1.2組(AG)和2.0組(AT)。

圖 4 刀鱭MOR-51I2核酸序列及其他魚類相關(guān)嗅覺(jué)受體基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 4 The phylogenetic tree based on nucleotide sequence of MOR-51I2 in Coilia nasus and related olfactory receptor in other fishes節(jié)點(diǎn)處的數(shù)值為1000次bootstrap檢驗(yàn)的支持率; 系統(tǒng)樹(shù)中刀鱭用▲標(biāo)出; 下同The numbers at each node represent the popularity rating that was replicated after 1000 bootstrap iterations; ▲ in the figure represented C. nasus; the same applies below

表 3 同源蛋白序列Tab. 3 The homologous protein sequences

3 討論

3.1 MOR-51I2基因結(jié)構(gòu)及其進(jìn)化關(guān)系

本研究通過(guò)染色體步移技術(shù)獲得了一個(gè)刀鱭嗅覺(jué)受體基因, 經(jīng)與NCBI比對(duì), 發(fā)現(xiàn)該基因與大西洋鯡OR 51I2-like基因的同源性最高, 屬于主嗅覺(jué)受體基因家族。由于目前對(duì)該類基因尚未有統(tǒng)一的命名方式, 因此我們將其命名為MOR-51I2。該基因序列長(zhǎng)1653 bp, 開(kāi)放閱讀框區(qū)域長(zhǎng)999 bp, 無(wú)內(nèi)含子, 為單外顯子結(jié)構(gòu), 可編碼332個(gè)氨基酸殘基。所編碼的蛋白質(zhì)有9個(gè)蛋白質(zhì)綁定位點(diǎn)、6個(gè)DNA綁定位點(diǎn)和7個(gè)RNA綁定位點(diǎn), 不含二硫鍵結(jié)構(gòu), 能夠形成7個(gè)疏水性α-型螺旋跨膜結(jié)構(gòu), 是典型的G蛋白偶聯(lián)受體。

核酸序列比較顯示, 刀鱭MOR-51I2基因與大西洋鯡OR51I2-like基因、墨西哥脂鯉OR4K15-like基因及斑點(diǎn)雀鱔OR4K15-like序列之間的同源性較高, 親緣關(guān)系較近, 這一結(jié)果基本符合魚類目一級(jí)階元的進(jìn)化關(guān)系[35]。但刀鱭MOR-51I2基因所編碼的氨基酸序列與其他同源氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù), 盡管與大西洋鯡及墨西哥脂鯉這一小分支上的親緣關(guān)系并沒(méi)有改變, 卻與斑點(diǎn)雀鱔的親緣關(guān)系發(fā)生了變化, 而進(jìn)化上位于高等的紅麗魚卻單獨(dú)處于進(jìn)化樹(shù)的基部位置。因此, 基于核酸序列所構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)可能更大程度地反映了物種之間的進(jìn)化關(guān)系, 而基于氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)可能更多地體現(xiàn)了該基因在功能上的趨同關(guān)系。從基因的結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)度、編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)看, 刀鱭MOR-51I2基因均與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的魚類MOR基因相符[30, 34]。

圖 5 刀鱭MOR-51I2氨基酸序列與其他魚類相關(guān)嗅覺(jué)受體蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 5 The phylogenetic tree based on amino acid sequence of MOR-51I2 in C. nasus and related olfactory receptor in other fishes

圖 6 MOR-51I2基因在定居型刀鱭組織中的表達(dá)差異(n=3)Fig. 6 The expression of MOR-51I2 in organs/tissues of the settlement C. nasus (n=3)

3.2 MOR-51I2基因的組織表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)顯示, MOR-51I2基因主要在嗅囊中表達(dá), 在性腺中的表達(dá)量也很高, 而肌肉、心臟、眼睛、肝臟和鰓中幾乎不表達(dá)或表達(dá)量很低。但雌性嗅囊中的表達(dá)量要高出雄性嗅囊約2倍, 而精巢中的表達(dá)量是卵巢中的約2倍。這表明MOR-51I2基因不但與嗅覺(jué)功能有關(guān), 也可能參與了刀鱭的性腺發(fā)育, 在雌雄個(gè)體間又存在著差異。

圖 7 MOR-51I2基因在不同生態(tài)型刀鱭嗅囊中的表達(dá)差異(n=3)Fig. 7 The expression of MOR-51I2 in rosettes of the different ecotypes of C. nasus (n=3)

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn), MOR-51I2基因在洄游型雄性嗅囊中的表達(dá)量約是同一生態(tài)型雌性嗅囊表達(dá)量的6倍, 但定居型雌性嗅囊中的表達(dá)量卻約是同一生態(tài)型雄性嗅囊表達(dá)量的2.5倍。這預(yù)示著洄游型群體的雄性個(gè)體, 可能比雌性個(gè)體具有更強(qiáng)的識(shí)別水溶性氣味分子的能力。定居型則相反, 雌性識(shí)別水溶性氣味分子的能力可能明顯強(qiáng)于雄性。分析還發(fā)現(xiàn), 雄性嗅囊中的表達(dá)量洄游型要明顯大于定居型, 而雌性則定居型要大于洄游型(圖 7)。這是否預(yù)示著, 洄游型刀鱭的雄性個(gè)體在溯河生殖洄游中起著主導(dǎo)作用, 而定居型刀鱭的雌性個(gè)體在尋找產(chǎn)卵場(chǎng)時(shí)起主導(dǎo)作用？還需要克隆更多的基因加以證實(shí)。

圖 8 刀鱭MOR-51I2基因中微衛(wèi)星序列在不同生態(tài)型間的比較Fig. 8 Alignment of microsatellite sequence of olfactory receptor MOR-51I2 between the different ecotypes of C. nasusM代表Trans DNA MarkerⅠ; 泳道1—10代表洄游型刀鱭群體; 泳道11—20代表定居型刀鱭群體; 泳道21代表陰性對(duì)照(用ddH2O代替DNA模板)M. Trans DNA MarkerⅠ; 1—10. Migratory C. nasus; 11—20. Settlement C. nasus; 21. Negative control (ddH2O instead of DNA)

3.3 MOR-51I2基因的微衛(wèi)星結(jié)構(gòu)

此外, 在MOR-51I2基因緊鄰終止密碼子TAA的3′ UTR非編碼區(qū)中有一段微衛(wèi)星序列, 其中以(AC)n最豐富, 具有長(zhǎng)度多態(tài)性, 在定居型和洄游型群體間具有明顯的擴(kuò)增差異帶。前者的微衛(wèi)星條帶明顯多于后者, 微衛(wèi)星平均長(zhǎng)度前者也高于后者。微衛(wèi)星側(cè)翼序列的突變和重復(fù)次數(shù)長(zhǎng)度的變化, 包含著重要的物種進(jìn)化信息[36,37]。本研究所顯示的MOR-51I2基因表達(dá)量差異、微衛(wèi)星序列變化以及核酸和蛋白構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)差異, 是否與刀鱭定居型種群的形成和洄游習(xí)性的喪失相關(guān), 還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

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CLONING, SEQUENCE ANALYSIS AND TISSUES EXPRESSION OF COILIA NASUS OLFACTORY RECEPTOR GENE MOR-51I2

WANG Xiao-Mei1,2, ZHU Guo-Li1,2and TANG Wen-Qiao1,2
(1. Laboratory of Fishes, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Shanghai Key Laboratory of Marine Animal Taxonomy and Evolution, Shanghai 201306, China)

Olfaction is an important tool for fish to perceive the external environment. To study the role of olfactory receptors in the spawning migration of Coilia nasus, the full-length sequence of olfactory receptor gene MOR-51I2 was cloned from the migratory C. nasus using genome walking technology. The MOR-51I2 gene was composed of a single exon with the open reading frame of 999 bp. The 3′ untranslated region of this gene had a microsatellite sequence formed by (AC)n inserted by several T and G. In addition, the microsatellite sequences in different ecotype of C. nasus had significant length difference. The MOR-51I2 was a G-protein-coupled receptor with seven hydrophobic alphahelical transmembrane structures. The MOR-51I2 protein shared homology (＞51%) with known related olfactory receptors from other fishes and it reached 83% homology with the olfactory receptor 51I2-like protein in Clupea harengus. The MOR-51I2 gene was highly expressed in the female olfactory rosettes of the settlement population of C. nasus, which is two times compared with that in male olfactory rosettes and 80 to 100 times compared with that in testis and ovary. The MOR-51I2 gene was expressed weakly in liver and gills and was almost not detected in the muscle, heart and eye. The expression level of female olfactory rosettes was 5 times higher than that in male olfactory rosettes in the migratory population. The expression level in female olfactory rosettes of the settlement population was 5 times higher than that in female olfactory rosettes in the migratory population, while the expression level in the male olfactory rosettes of the migratory population was 2 times higher than that in male olfactory rosettes in the settlement population. These results suggest that MOR-51I2 gene may not only regulate the olfactory function of C. nasus, but also mediate gonad development, spawning migration, and ecological differentiation of C. nasus.

Coilia nasus; Olfactory receptor gene; Tissues expression difference; Spawning migration; Ecotype differentiation

Q344+.1

A

1000-3207(2017)01-0033-10

10.7541/2017.5

2016-01-12;

2016-05-28

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203065); 國(guó)家自然科學(xué)基金(31172407, 31472280); 高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)科研專項(xiàng)(2012 3104110006); 上海高校水產(chǎn)學(xué)高峰學(xué)科資助 [Supported by the Special Fund for Agro-Scientific Research in the Public Interest (201203065); the National Natural Science Foundation of China (31172407, 31472280); the Ministry of Education's Doctoral Discipline Foundation (20123104110006); Shanghai Universities First-class Disciplines Project of Fisheries]

王曉梅(1989—), 女, 安徽亳州人; 碩士; 主要從事魚類生殖洄游研究。E-mail: xmw0212@163.com

唐文喬, 教授, 博士生導(dǎo)師。E-mail: wqtang@shou.edu.cn