水稻糙米重金屬鎘(Cd2+)含量的QTL定位分析

郭小蛟，楊 莉,*，張 濤,，蔣開鋒,，楊乾華，游書梅，曹應江，李昭祥，羅 婧，高 磊，萬先齊，鄭家奎,(.四川省農業(yè)科學院水稻高粱研究所/農業(yè)部西南水稻生物學與遺傳育種重點實驗室，四川 德陽 68000；.國家水稻改良中心瀘州分中心，四川 瀘州 64600)

水稻糙米重金屬鎘(Cd2+)含量的QTL定位分析

郭小蛟1，楊 莉1,2*，張 濤1,2，蔣開鋒1,2，楊乾華1，游書梅1，曹應江1，李昭祥1，羅 婧1，高 磊1，萬先齊2，鄭家奎1,2

(1.四川省農業(yè)科學院水稻高粱研究所/農業(yè)部西南水稻生物學與遺傳育種重點實驗室，四川 德陽 618000；2.國家水稻改良中心瀘州分中心，四川 瀘州 646100)

本研究利用日本晴與瀘恢99構建的188個重組自交系群體，根據已構建的遺傳連鎖圖譜，采用混合線性模型方法，在高鎘含量環(huán)境A和低鎘含量環(huán)境B進行糙米Cd2+含量的QTL定位分析。在A環(huán)境中檢測到2個控制糙米Cd2+含量的QTLs，分別位于第7、8染色體，貢獻率分別為29.8%、8.87%；在B環(huán)境中檢測到1個控制糙米Cd2+含量的QTL，位于第7染色體，貢獻率為7.35%；A、B兩個環(huán)境下的增效基因均來自于親本瀘恢99。試驗表明：鎘濃度對該基因的表達有影響，糙米Cd2+含量QTL基因更易在Cd2+高濃度環(huán)境中表達，因此，Cd2+低吸收水稻材料創(chuàng)制及選育應在Cd2+含量較高的土壤中進行。

水稻；糙米Cd2+含量；QTL定位

水稻(Oryzasativa)是世界上最主要的糧食作物，有50%以上的人口以稻米為主食。近年來，隨著工業(yè)“三廢”排放量的增加，各種化學產品、農藥、化肥的廣泛無節(jié)制使用，使農田土壤中有毒重金屬含量急劇增加，我國面臨的土壤環(huán)境及糧食安全問題日益突出。中國水稻研究所與農業(yè)部2010年的研究稱，全國受到鎘污染的耕地涉及11個省份25個地區(qū)。在湖南、江西等長江以南地帶，這一問題更加突出。南京農大潘根興團隊在全國多個縣級以上市場隨機采購樣品，結果表明，10%左右的市售大米鎘超標。2008年以來，相繼出現(xiàn)了湖南、廣州等地“鎘大米”事件，在社會上引起了強烈反響。重金屬污染特別是Cd2+污染已嚴重危及食物安全，因此引起世界各國的廣泛重視。大量研究表明,不同水稻品種由于遺傳上的差異，在對稻田重金屬元素的吸收和分配上存在很大差異，這種差異不僅存在于種間(不同種和屬)，而且在種內(不同變種或品種)也存在[1、2、3、4、5、6、7、8]。針對重金屬污染土壤的治理方法，國內外學者作了大量研究，取得了一系列的成功技術，但這些方法在有效性、持久性及經濟性方面難以達到預期效果。日本岡山大學教授馬建鋒等[9]研究發(fā)現(xiàn)，種植不含Nramp5基因的水稻，可以有效地解決水稻中Cd2+富集的問題，但是卻破壞了攝取錳元素的能力，導致產量比正常水稻降低了近90%，這在生產上顯然是不能接受的。而通過品種選擇，將作物食用部位的重金屬濃度控制在允許范圍被認為是治理污染的有效途徑，并在向日葵(Helianthus annuus)和硬質小麥上成功應用[10、11、12]，這為該方面的深入研究奠定了基礎。因此，針對土壤重金屬污染，開展作物耐重金屬污染基因的發(fā)掘、分子標記及利用研究，開展作物耐重金屬污染品種的篩選、鑒定和選育研究，必將是有效、持久和經濟的重金屬污染土壤治理策略的發(fā)展趨勢。近年來，有關糙米中Cd2+含量的QTL定位研究也取得了一定的進展[13、14、15]，但總的來說定位的QTL還很少，且貢獻率均不大，還不足以用于分子標記輔助選擇育種。本研究將利用日本晴×瀘恢99構建的RIL群體分析控制糙米中Cd2+含量的QTL，旨在發(fā)掘更多有利基因，為分子標記輔助選擇Cd2+低吸收品種提供一定的理論和技術指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以測序品種日本晴(粳稻)為母本，與我所選育的恢復系瀘恢99(秈稻)雜交，F(xiàn)2代始經單粒傳法獲得369個株系的F8代重組自交系群體(Recombinant inbred lines，RIL)，選取188個株系為試驗材料。

1.2 田間試驗與表型分析

2012年夏季，選取2個土壤Cd2+含量不同的田塊進行了試驗，其中A環(huán)境土壤Cd2+含量為1.45mg/kg，B環(huán)境土壤Cd2+含量為0.15mg/kg(國家規(guī)定，pH值≤7.5土壤安全標準為0.3mg/kg，pH值 ≥7.5時為0.6mg/kg，大米中的安全鎘含量為0.2mg/kg)。2個親本及188個株系于4月1日播種，5月8日移栽。每個株系種植4行，每行10株，株行距16.67cm×26.67cm，兩環(huán)境田間肥水管理、病蟲害防治同常規(guī)大田管理。

正季稻成熟時，收取2、3行各5株種子，自然風干后儲存3個月，送四川省農業(yè)科學院分析測試中心，采用GB/T5009.15-2003方法檢測糙米中的Cd2+含量。

1.3 數(shù)據分析和QTL定位

用SPSS統(tǒng)計軟件進行表型數(shù)據的統(tǒng)計分析。根據已構建的遺傳連鎖圖譜(趙建國，2013)[16]，利用基于混合線性模型[17]的QTL Network2.0[18]軟件進行QTL分析。以P = 0.005為統(tǒng)計檢測閾值, 即當標記的P 值小于統(tǒng)計檢測閾值時, 認為該標記處存在1個QTL；最后將檢測到的所有QTL 以及它們之間的上位性互作以及與環(huán)境的互作整合到一個全QTL 模型中, 用基于Gibbs 抽樣的Bayesian 方法估計遺傳效應。QTL的命名參照McCouch[19]水稻QTL命名方法。

2 結果分析

2.1 親本及群體表型

在2個不同Cd2+含量的土壤環(huán)境下(表1)，雙親糙米Cd2+含量性狀差異均達極顯著水平，其中秈稻瀘恢99糙米Cd2+含量明顯比粳稻日本晴高。A環(huán)境下，糙米Cd2+含量性狀在RIL群體中表現(xiàn)為連續(xù)變異，株系間變異幅度很大，變異范圍在0.18～5.54mg/kg之間，差異明顯。大多數(shù)株系性狀值居于雙親中間，部分株系呈超親優(yōu)勢，個別株系甚至比土壤背景值高出幾倍，糙米Cd2+含量性狀表現(xiàn)正態(tài)分布(圖1)，表明糙米Cd2+含量是受多基因控制的數(shù)量性狀。B環(huán)境中性狀亦呈連續(xù)變異，株系間的變異范圍為0.0039～0.27mg/kg，幅度變較大，但大多數(shù)株系糙米Cd2+含量很低，大約60%的株系Cd2+含量集中在0.0039～0.037mg/kg之間，株系間差異不明顯，性狀表現(xiàn)出一定的偏分離，不符合正態(tài)分布，這可能與B環(huán)境土壤Cd2+含量低有關。從本試驗的結果來看，土壤背景值對水稻籽粒Cd2+含量這一性狀的表達有影響，Cd2+含量高的土壤背景下更有利于鑒別株系間的性狀差異。

表1 雙親及群體在兩種環(huán)境下的性狀表現(xiàn)值

圖1 A環(huán)境188個家系糙米Cd2+含量的正態(tài)分布圖

2.2 QTL定位分析

根據已構建的遺傳連鎖圖譜[16]，該圖譜包含有覆蓋水稻全基因組12條染色體的207個DNA分子標記。其中SSR標記136個，STS標記24個，Indel標記47個。連鎖圖譜全長為2397cM，標記間平均距離為12.29cM。在A環(huán)境中檢測到2個糙米Cd2+含量的QTL，即位于第7、8染色體上的qCCBR-7-1和qCCBR-8，均表現(xiàn)出增效作用，增效基因均來自瀘恢99。貢獻率分別為29.8%和8.87%，加性效應分別為-0.4943和-0.2154。同時還檢測到qCCBR-7-1和qCCBR-8之間存在上位性互作，但效應值較低僅為2.37%。B環(huán)境中檢測到1個QTL，qCCBR-7-2位于第7染色體SSR標記RM214與RM11之間，與A環(huán)境中檢測到qCCBR-7-1位置相近(圖2)，貢獻率為7.35%，增效基因來自于親本瀘恢99。

3 討論

3.1 QTL定位結果比較

數(shù)量性狀易受環(huán)境影響，同一數(shù)量性狀的QTL在不同定位群體、不同環(huán)境及不同年份等QTL檢測結果均會有所不同。Ishikawa等[13]利用含39個片段代換系的圖譜檢測到位于第3、6、8染色體上的3個控制糙米中Cd2+含量的QTLs。沈希宏等[14]利用協(xié)青早B×中恢9308構建的RIL群體在不同的土壤環(huán)境下分別檢測到2個、1個控制糙米中Cd2+含量的QTLs，分別位于第5、7和11染色體上，貢獻均在9%左右。陳志德[15]利用韭菜青×IR26的重組自交系群體(RIL),在5 mg/kg Cd2+脅迫下進行糙米Cd2+濃度的QTL定位，在第11染色體上檢測到2個控制糙米Cd2+濃度的QTL。本研究利用日本晴與R99的RIL群體，在土壤Cd2+濃度較高的A環(huán)境中在第7和第8染色體上各檢測到了1個QTL，B環(huán)境中第7染色體上檢測到1個QTL。與前人的研究比較發(fā)現(xiàn)，是3個新的糙米Cd2+含量QTL位點。位于第7染色體的2個QTL在物理位置上比較近，qCCBR-7-1(鎘較高濃度)的貢獻率較大29.8%，沈希宏等[14]在第7染色體上也定位了1個控制糙米Cd2+含量QTL位點，可能該區(qū)域是控制糙米Cd含量的基因區(qū)域。而qCCBR-7-2(低濃度)貢獻率小，可能是因為糙米Cd含量QTL基因在土壤低Cd濃度下不易表達。因此，在此研究基礎上，進一步開展qCBBR-7-1基因的精細定位和克隆研究，開展水稻與Cd2+的分子生物學研究，探明控制水稻糙米Cd含量基因的遺傳、分子和生理生化機制，發(fā)掘更多有利基因，最終利用分子標記輔助選擇或轉基因技術改良雜交水稻不育系和恢復系親本，選育水稻籽粒Cd2+低吸收品種，對于解決我國面臨的糧食生產安全問題具有理論和技術指導意義。

表2 QTL定位結果及遺傳參數(shù)估算

圖2 控制糙米中Cd2+含量的QTL圖譜(▲環(huán)境A ●環(huán)境B)

3.2 性狀與環(huán)境的相關性

沈希宏等[14]在不同Cd2+污染程度土壤中，檢測到了顯著的QTL與環(huán)境互作效應，說明環(huán)境對基因表達有顯著影響。本實驗中，環(huán)境A和環(huán)境B土壤Cd2+濃度分別為1.45 mg/kg和0.15mg/kg。A環(huán)境中出現(xiàn)了比親本高數(shù)倍的株系，株系間的性狀差異明顯，而在B環(huán)境中株系間差異不如A環(huán)境顯著，尤其是吸收量低的株系所占比例較大,這很可能與B環(huán)境的土壤Cd2+濃度較低導致了糙米Cd2+含量QTL基因不易表達有關。從本研究結果看，土壤Cd2+濃度高更有利于Cd2+含量QTL基因的表達。楊莉[8]曾利用不完全雙列雜交材料在較高鎘環(huán)境下研究了鎘的遺傳效應，結果表明，籽粒低Cd2+雜交稻組合的選育，雙親的遺傳改良和組合的評價篩選都很重要，不育系改良的效果比恢復系好。因此，Cd2+低吸收材料(品種)的鑒定及選育最好選擇在Cd2+含量較高的環(huán)境中進行。

4 結論

(1)發(fā)現(xiàn)3個新的糙米Cd2+含量QTL位點，其中第7染色體的2個QTL在物理位置上比較近，qCCBR-7-1(鎘較高濃度)的貢獻率較大29.8%，值得做進一步研究。第7染色體上可能存在一個Cd2+含量基因區(qū)域。

(2)土壤Cd2+濃度高更有利于Cd2+含量QTL基因的表達，因此Cd2+低吸收材料(品種)的鑒定及選育最好選擇在Cd2+含量較高的環(huán)境中進行。

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2016-11-19

四川省科技支撐計劃項目(2015SZ0048)、四川省財政現(xiàn)代農業(yè)技術創(chuàng)新與示范項目。

郭小蛟(1988-)，女，研究實習員，碩士，專業(yè)方向為水稻遺傳育種。E-mail：gxiaojiao@163.com。*為通訊作者。