棕櫚花苞抗氧化成分提取及體外抗氧化活性研究

劉龍云，吳彩娥，李婷婷，陳宗勇

(1.南京林業(yè)大學南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心；2.南京林業(yè)大學林學院；3.南京林業(yè)大學輕工科學與工程學院，南京210037；4.貴州大自然科技有限公司，貴陽550000)

棕櫚花苞抗氧化成分提取及體外抗氧化活性研究

劉龍云1，2，吳彩娥1，3*，李婷婷1，3，陳宗勇4

(1.南京林業(yè)大學南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心；2.南京林業(yè)大學林學院；3.南京林業(yè)大學輕工科學與工程學院，南京210037；4.貴州大自然科技有限公司，貴陽550000)

為研究棕櫚花苞中抗氧化成分的最佳提取工藝及體外抗氧化活性，在單因素試驗的基礎上，選取乙醇體積分數、液料比和提取時間為考察因素，以DPPH·自由基清除率和ABTS·+自由基陽離子清除率等抗氧化能力指標為衡量指標，采用Box-Behnken試驗設計來優(yōu)化提取工藝。在最佳提取工藝下得到提取物，測定其多酚和黃酮的含量，并以多項抗氧化指標綜合評價其體外抗氧化能力。結果表明：當乙醇體積分數78%，液料比28∶1 (mL∶g)，提取時間64 min，提取溫度80℃時，棕櫚花苞提取物DPPH·清除率為92.05%，ABTS·+清除率為63.82%，提取物中總酚含量4.72%，得率為15.08 mg/g；總黃酮含量3.63%，得率為11.67 mg/g。本試驗條件下每100 g棕櫚花苞(以干質量計)的體外抗氧化能力相當于2 990～6 262 mg Vc，棕櫚花苞的體外抗氧化能力IC50為0.115～5.795 mg/mL，具備一定的抗氧化能力。

棕櫚花苞；響應面；抗氧化；多酚；黃酮

棕櫚(Trachycarpusfortunei(Hook.)H.Wendl.)，棕櫚科棕櫚屬，圓錐狀花序葉腋生，花小，黃色[1]，產于長江流域以南，是南方特有的經濟樹種和優(yōu)美的觀賞樹種[2]。在南京地區(qū)的棕櫚花期4—5月，而貴州的棕櫚自10月起至第2年3月均有棕櫚花序自棕櫚樹葉腋抽出。蓓蕾期的棕櫚花序，基部具多數大型鞘狀苞片，尚未開放的花苞淡黃色而細小，排列密集如魚子狀。幼嫩可食的棕櫚花苞，是一種很好的菜果，營養(yǎng)豐富，并兼有降血壓和清涼解暑作用[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，棕櫚花蕾水提液、醇提液有興奮子宮平滑肌、抑制腸平滑肌等作用[4-6]。

目前已有文獻報道初出苞的棕櫚花穗中黃酮類物質[7]和酚酸類物質[8]的提取工藝及其部分體外抗氧化活性。其中,花穗提取酚酸類物質的試驗研究表明：其具有較強的體外抗氧化能力，清除DPPH·，·OH，以及絡合Fe2+的IC50分別為 0.69，0.56和0.84 mg/mL[8]。但是，有關未出苞、適宜食用的幼嫩棕櫚花苞中抗氧化成分的提取工藝以及抗氧化活性的研究均鮮見報道。因此，本試驗采用響應面設計法優(yōu)化棕櫚花苞中抗氧化活性成分的提取工藝，并選用多項抗氧化指標評價其體外抗氧化活性，旨在為促進棕櫚花苞的食用開發(fā)提供科學依據，為深入開發(fā)利用棕櫚資源提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料：棕櫚花苞，由貴州大自然科技有限公司提供，產自貴州貴陽生產基地，均為15 a左右樹齡棕櫚樹，11月采摘，為適宜食用的淡黃色幼嫩花苞，去除苞片后經真空冷凍干燥、粉碎、過篩后密封保存(篩孔直徑為0.180 mm)。

試驗試劑：DPPH，日本東京化工工業(yè)；ABTS、菲洛嗪，阿拉丁工業(yè)有限公司；鐵氰化鉀、三氯乙酸，上海凌峰化學試劑有限公司；亞油酸，上海藍季生物試劑有限公司；福林酚試劑、過硫酸鉀、2-硫代巴比妥酸、菲啰啉，國藥集團化學試劑有限公司；抗壞血酸、EDTA二鈉，南京化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

TU-1800PC型紫外可見分光光度計，美國優(yōu)尼柯公司；ALPHA 1-2 LDplus真空冷凍干燥機，德國Christ公司；R-210旋轉蒸發(fā)儀，瑞士Buchi公司；TG16-WS臺式高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；MDF-U32V立式超低溫冰箱，日本三洋SANYO公司；DKS-12型電熱恒溫水浴鍋，上海經濟區(qū)海鹽中新電器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 響應面法優(yōu)化提取工藝

以棕櫚花苞干粉為試驗材料，單因素試驗采用熱回流提取法進行提取，分析不同的提取條件對棕櫚花苞抗氧化活性的影響。結果表明，溫度對其影響并不顯著，其他3項具有顯著影響，得出最適提取條件分別為：乙醇體積分數75%；液料比(溶劑體積V∶樣品質量m)25∶1(mL∶g)；提取時間60 min；提取溫度80℃。

在單因素試驗基礎上，選取乙醇體積分數(A)、液料比(B)和提取時間(C)為考察因素，提取溫度選用80℃，以ABTS·+清除率和DPPH·清除率為衡量指標，采用Box-Behnken試驗設計，得到表1所示的因素水平編碼表。結合響應面分析法，進行回歸方程擬合度檢驗和顯著性檢驗，分析各試驗因素對DPPH·清除率和ABTS·+清除率的影響及因素間的交互作用，優(yōu)選出最佳提取工藝參數。

表1 響應面試驗因素水平編碼表

1.3.2 棕櫚花苞體外抗氧化活性評價方法

將在最優(yōu)工藝條件下提取得到的棕櫚花苞提取物配制成不同濃度的溶液，采用多項抗氧化指標，進行抗氧化活性的研究及評價。以抗壞血酸或EDTA為對照，參考文獻[9-15]的測定方法對棕櫚花苞提取液分別進行清除DPPH·自由基能力、總抗氧化能力、總還原能力、羥基自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力、抗脂質過氧化活性和Fe2+螯合能力的測定。

2 結果與分析

2.1 響應面優(yōu)化提取工藝試驗結果與分析

2.1.1 Box-Behnken試驗設計方案及結果

根據單因素試驗確定的試驗因素及水平，將乙醇體積分數(A)、液料比(B)和提取時間(C)作為考察因素，以DPPH·自由基清除率和ABTS·+自由基清除率為響應值，采用Box-Behnken試驗設計三因素三水平的響應面分析試驗，試驗設計及結果見表2。

表2 響應面中心組合試驗設計與結果

2.1.2 Box-Behnken試驗結果方差分析

利用Design Expert 8.0軟件，對表2試驗設計方案多元回歸擬合，得出響應值Y1(DPPH·清除率)對影響棕櫚花苞抗氧化成分提取的關鍵因素(A、B、C)的二次多項回歸模型，編碼值的擬合方程為：

Y1=87.97+10.39A+8.78B+6.68C-4.99AB-3.67AC-3.80BC-10.57A2-4.38B2-9.53C2

由表3方差分析可知：模型的F=40.55，P=0.000 4，表明試驗所采用的回歸模型是極顯著的。失擬項的F=7.70，P=0.117 2>0.05，無失擬因素存在。由分析結果來看，單一因素中，乙醇體積分數(A)對響應值Y1的影響最大，其P=0.000 1，影響極顯著。液料比、提取時間均達到極顯著水平。對響應值Y1的交互影響中，A和B、A和C、B和C的交互作用達到了顯著水平，交互項按影響大小排列分為AB>BC>AC，說明各因素對棕櫚花苞清除DPPH·自由基的能力并不是簡單線性關系。

表3 DPPH·清除率回歸模型方差分析

利用Design Expert 8.0軟件，對表2試驗設計方案多元回歸擬合，得出響應值Y2(ABTS·+清除率)對影響棕櫚花苞抗氧化成分提取的關鍵因素(A、B、C)的二次多項回歸模型，編碼值的擬合方程為：

Y2=59.57+7.39A+7.66B+9.45C-3.46AB-0.86AC-4.24BC-7.34A2-4.26B2-9.85C2

由表4方差分析可知：模型的F=57.29，P=0.000 2<0.001，表明試驗所采用的回歸模型是極顯著的，可以用此模型進行統(tǒng)計分析。失擬項的F=4.15，P=0.200 4，說明使用該方程進行擬合的效果較好。由分析結果來看，單一因素中，提取時間(C)對響應值Y2的影響最大，P<0.000 1，影響極顯著。乙醇體積分數、液料比均達到極顯著水平。對響應值Y2的交互影響中，A和B、B和C的交互作用達到顯著水平，而A和C的交互作用不顯著，交互作用大小為BC>AB，說明各因素對棕櫚花苞清除ABTS·+自由基的能力并不是簡單線性關系。

表4 ABTS·+清除率回歸模型方差分析

2.1.3 交互作用分析

由Design Expert 8.0軟件分析交互作用得圖1。從圖1a可以看出，沿A因素(乙醇體積分數)向峰值移動，等高線密度大于沿B因素(液料比)移動的密度。這表明乙醇體積分數對DPPH·清除率影響的主效應大于液料比。從圖1b可以看出，液料比對DPPH·清除率影響的主效應略大于提取時間。從圖1c可以看出，乙醇體積分數對DPPH·清除率影響的主效應稍大于提取時間。由上可知，3個因素對DPPH·清除率的影響順序為：乙醇體積分數>液料比>提取時間，這與方差分析結果一致。

圖1 各因素對DPPH·清除率影響的響應面圖Fig. 1 The response surface map of the effects of various factors on DPPH· free radical clearance rate

由Design Expert 8.0軟件分析交互作用得到圖2。從圖2a可以看出，乙醇體積分數對ABTS·+清除率影響的主效應與液料比近乎相同。從圖2b可以看出，提取時間對ABTS·+清除率影響的主效應大于液料比。綜上可知，3個因素對DPPH清除率的影響順序為：提取時間>液料比>乙醇體積分數，這與方差分析的結果一致。

圖2 各因素對ABTS·+清除率影響的響應面圖Fig. 2 The response surface map of the effects of various factors on ABTS·+ free radical clearance rate

2.1.4 響應面優(yōu)化及其抗氧化成分分析

運用Design Expert 8.0 軟件，設置DPPH·和ABTS·+清除率達到極大值時，求解得到棕櫚花苞抗氧化成分提取的理論最優(yōu)條件為：乙醇濃度78.04%，液料比28.44∶1，提取時間63.63 min，在此條件下的DPPH·清除率的理論值為93.23%，ABTS·+清除率為64.61%。按照上述調整后的最佳提取工藝條件為：乙醇質量分數78%，液料比28∶1，提取時間64 min，提取溫度為80℃。進行3次驗證試驗，得DPPH·清除率平均值為92.05%，ABTS·+清除率平均值為63.82%，與預測值的誤差較小，且每組試驗結果均處于表5可信度區(qū)間內。可見所得回歸方程可以較好地擬合棕櫚花苞中抗氧化成分的提取情況。

在最佳提取工藝下提取得到的棕櫚花苞提取物，采用GB/T 8313—2008中的方法二測定其總酚含量為4.72%，得率為15.08 mg/g；采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法[16-18]測定其總黃酮含量(質量分數)為3.63%，得率為11.67 mg/g。在此優(yōu)化工藝下既得提取物的抗氧化能力高，抗氧化物質含量較高。

表5 可信度報告

2.2 棕櫚花苞體外抗氧化能力綜合評價

2.2.1 清除DPPH·自由基能力測定

經數據處理得到圖3，棕櫚花苞提取液在0～400 μg/mL范圍內，清除DPPH·自由基的能力逐漸達到最高值93%左右，呈顯著正相關關系。抗壞血酸對照組質量濃度高于25 μg/mL時，DPPH·清除率平穩(wěn)在90%以上，明顯高于相同濃度棕櫚花苞提取液的清除率。當棕櫚花苞提取液濃度增加至300 μg/mL時，對DPPH·自由基清除能力達到92.05%，與抗壞血酸對照組的清除能力達到同等水平。

圖3 不同濃度棕櫚花苞提取液對DPPH·清除率Fig. 3 DPPH· radical scavenging activities of palm bud extract at different concentrations

為了更準確地評價抗氧化活性，用IC50來表征抗氧化能力的大小，IC50值越低表明清除能力越高。另外抗氧化能力值(AEAC)代表棕櫚花苞提取物清除DPPH·自由基的能力與對照Vc清除能力的比值。單位mg Vc/100g定義為每100 g樣品相當于Vc的毫克數。

由回歸方程可計算出AEAC當量值。IC50值分別由SPSS 22.0軟件算出，結果見表6。每克棕櫚花苞相當于30.85 mg的Vc(0.175 mmol Vc)，IC50為114.5 μg/mL，雖然低于人工合成的常用抗氧化劑Vc，但與米書梅等[17]測定的常見水果、蔬菜(鮮重)的AEAC值17.41～85.29 mg相比，棕櫚花苞仍然表現(xiàn)出較高的清除能力。

表6 棕櫚花苞的DPPH·自由基清除能力

2.2.2 總抗氧化能力測定

通過Excel處理數據得到圖4，棕櫚花苞提取液質量濃度超過1 mg/mL后，對ABTS·+自由基陽離子的清除能力快速增加，逐漸達到最高99%左右，呈顯著正相關關系。質量濃度高于6 mg/mL之后趨于穩(wěn)定?？箟难豳|量濃度在0～0.5 mg/mL范圍內，清除率很快升高至95%以上，明顯高于相同濃度的棕櫚花苞提取物。質量濃度高于0.5 mg/mL之后，抗壞血酸的清除率穩(wěn)定在98%左右。當棕櫚花苞提取液質量濃度超過6 mg/mL時，與抗壞血酸的清除能力達到同等水平。

圖4 不同濃度棕櫚花苞提取液對ABTS·+清除率Fig. 4 ABTS·+ radical scavenging activities of palm bud extract at different concentrations

棕櫚花苞提取液對ABTS·+自由基陽離子的清除能力測定結果見表7。由表7可以看出，每克棕櫚花苞相當于29.901 mg 的Vc(或0.17 mmol的Vc)，IC50值為1.747 mg/mL，這組數據仍然低于人工合成的常用抗氧化劑Vc，AEAC當量比DPPH·自由基清除能力略下降，但差異極小。與米淑梅等[19]測定的常見水果、蔬菜的總抗氧化能力AEAC值27.10～111.20 mg Vc/100g相比，棕櫚花苞提取物對ABTS·+自由基陽離子的清除能力，即總抗氧化能力較強。

表7 棕櫚花苞的ABTS·+自由基清除能力

2.2.3 羥基自由基清除能力測定

棕櫚花苞提取液在0～3.5 mg/mL范圍內，隨著提取液濃度的增大，樣品對·OH自由基的清除能力呈現(xiàn)一定的量效關系(圖5)。棕櫚花苞提取物對·OH自由基有一定的清除作用。在試驗濃度范圍內，棕櫚花苞提取液對·OH自由基的清除能力均低于相同濃度的Vc。對照組抗壞血酸在0.5 mg/mL時，對·OH自由基的清除率已經接近80%。由于樣品濃度過高時，吸光值反而超過未損傷管的吸光值。樣品濃度過低，起不到清除作用。所以本試驗要嚴格篩選合理的樣品濃度來參與反應，才能測出清除能力強弱的變化規(guī)律。

圖5 不同濃度棕櫚花苞提取液清除·OH自由基能力Fig. 5 Influence of palm bud extract concentration on ·OH scavenging activities

棕櫚花苞提取液對·OH自由基的清除能力由表8可以看出，每克棕櫚花苞相當于62.622 mg Vc(0.36 mmol Vc)，IC50值為2.347 mg/mL，這組數據仍然低于人工合成的常用抗氧化劑Vc，但從AEAC當量來看抗氧化能力還是較高的?？梢娮貦盎ò崛∥飳ΑH自由基的清除能力也很高。

表8 棕櫚花苞的·OH自由基清除能力

2.2.4 總還原能力測定(普魯士藍法)

棕櫚花苞提取液在0～10 mg/mL范圍內，樣品管吸光值平緩的上升至1.8左右，普魯士藍生成量穩(wěn)步增加，還原能力逐漸增強，呈顯著正相關關系；達到15 mg/mL時，溶液吸光值接近2.5，已經接近分光光度計最大值(圖6)。如果再增加棕櫚花苞提取液濃度，雖然吸光值會變大，看似還原能力有所增強，實際上分光光度儀測量誤差增大，而且可能所有的Fe3+早已被全部還原了，只是樣品的吸光值在增加。這樣就不能正確反映出真實的變化規(guī)律。所以試驗中必須保證鐵氰化鉀足量，即Fe3+離子足量，又要控制樣品濃度不能過高。

圖6 不同濃度棕櫚花苞提取液的還原能力Fig. 6 Reducing ability of palm bud extract at different concentrations

對照組抗壞血酸在2～15 mg/mL范圍內，吸光值一直都維持在2.4左右。整體來看，棕櫚花苞提取物的總還原能力弱于Vc。以吸光值1.0為參考量時，計算棕櫚花苞的抗氧化能力AEAC為每克干質量的棕櫚花苞相當于43.46 mg 抗壞血酸。由于普魯士藍法不是針對某一種自由基清除能力，而是樣品總的還原能力，因此可用來反映樣品總的抗氧化活性。

2.2.5 超氧陰離子自由基清除能力測定

圖7 不同濃度棕櫚花苞提取液清除自由基能力Fig. 7 Influence of palm bud extract concentration on scavenging activities

2.2.6 抗脂質過氧化活性測定

棕櫚花苞提取液質量濃度在0～9 mg/mL范圍時，隨著濃度的增加，脂質氧化抑制率幾乎一直在升高，但是變化規(guī)律不一致。質量濃度在3～4 mg/mL之間時，抑制率顯著增加，其他濃度時較為平緩。質量濃度超過9 mg/mL時，抑制能力反而減弱(圖9)。可能是提取液濃度變高后，棕櫚花苞中的某些物質與硫代巴比妥酸結合生成了其他化合物。而且并非所有的脂類氧化體系都有丙二醛產生。此外，此試驗最好在pH=3.0左右的環(huán)境體系中反應。配制TBA溶液時，必須用NaOH溶液溶解，再由HCl溶液定容，那么既要保證溶解完全，又要控制TBA為酸性溶液，最終溶液的pH不好控制。試驗過程中發(fā)現(xiàn)，pH對試驗影響很大，pH高時，TBA溶液為淡粉色；pH低時，TBA溶液為淡黃色。pH過高，不能發(fā)生顯色反應。pH低一點，顯色反應變成橙黃色。控制合理的pH才能出現(xiàn)紅色反應物。

在試驗范圍內，脂質氧化抑制率始終不高，可能與棕櫚花苞中的抗氧化成分對脂質過氧化物的抑制能力較低有關。在質量濃度為9 mg/mL時達到的最高抑制率只有53%。

圖8 不同濃度棕櫚花苞提取液脂質氧化抑制率Fig. 8 Influence of palm bud extract concentrations on inhibition of lipid oxidation rate

2.2.7 Fe2+螯合能力測定

棕櫚花苞提取液質量濃度在0～1.6 mg/mL范圍時，隨濃度的增加，對Fe2+的螯合能力不斷增強，但是變化速率不太一致，線性規(guī)律稍差。當提取液質量濃度達到1.6 mg/mL以上，棕櫚花苞對Fe2+的螯合能力幾乎不再變化，螯合率達到80%以上(圖9)。對照組抗壞血酸在此試驗條件下，并無反應發(fā)生，故選用EDTA作為陽性對照組。當質量濃度0.5 mg/mL以上，EDTA對Fe2+的螯合率就已經達到90%左右，比棕櫚花苞的螯合能力強。棕櫚花苞對Fe2+的螯合率達到50%時的提取液濃度為0.147 mg/mL。

圖9 不同濃度棕櫚花苞提取液Fe2+螯合能力Fig. 9 Chelating ability of different concentrations of palm bud extract on Fe2+

3 結 論

本試驗在單因素試驗基礎上，以液料比、提取時間及以乙醇體積分數為指標通過三因素三水平響應面設計對棕櫚花苞的提取工藝條件進行優(yōu)化，得到棕櫚花苞抗氧化活性最高時的提取工藝參數：乙醇體積分數78%，液料比28∶1，提取時間64 min，提取溫度80℃，此時總酚含量為4.72%，總黃酮含量為3.63%，均是其抗氧化功能的物質基礎。

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Extraction of antioxidant components in palm bud and antioxidative activityinvitro

LIU Longyun1,2, WU Cai’e1,3*, LI Tingting1,3, CHEN Zongyong4

(1.Co-InnovationCenterforSustainableForestryinSouthernChina,NanjingForestryUniversity;2.CollegeofForestry,NanjingForestryUniversity;3.CollegeofLightIndustryScienceandEngineering,NanjingForestryUniversity,Nanjing210037,China;4.GuizhouNatureTechnologyCo.Ltd.,Guiyang550000,China)

In order to explore the optimal extraction process of antioxidant components in palm buds and the antioxidant activity of palm budsinvitro, the freeze-dried palm bud was used as test material, and the effects of extraction condition on the antioxidant activity of palm bud extracted by heat reflux was analyzed. Based on the results of single factor experiment, it was found that the effect of extraction temperature on the antioxidant activity of the extracts was not significant, and that the other three extraction conditions had significant effect on the extraction efficiency. The optimal extraction scheme of palm bud antioxidant components was designed by Box-Behnken test. The effects of the volume fraction of ethanol, liquid-to-solid ratio and extraction time on antioxidant activity of palm buds were studied, and the interaction between extraction conditions was considered, with DPPH·free radical scavenging rate and ABTS·+radical scavenging rate as the index, to optimize the extraction process. Under the optimum extraction condition, the contents of polyphenols and flavonoids in the extracts of palm buds were determined and antioxidant capacity of the extractsinvitrowas evaluated by a number of antioxidant indexes. The results showed that when the volume fraction of ethanol was 78%, solid-to-liquid ratio was 28∶1 (mL∶g), and the extraction was carried out at 80℃ for 64 min, the DPPH·clearance rate of palm bud extracts was 92.05%; the ABTS·+clearance rate was 63.82%; the total phenol content in the extract was 4.72%; with the yield of 15.08 mg/g; the total flavonoids content 3.63% with the yield of 11.67 mg/g. Under this experimental condition, antioxidant capacityinvitroof 100 g palm bud (in dry weight) was equivalent to 2 990-6 262 mg of Vc. The IC50of palm budinvitroantioxidant capacity was 0.115-5.795 mg/mL. Palm bud exhibits certain antioxidant capacity.

palm bud; response surface; antioxidation; polyphenols; flavonoids

2016-06-12

2016-11-05

江蘇省科技支撐計劃重點研發(fā)項目(BE2015315)；江蘇省自然科學基金項目(BK20150883)。

劉龍云，女，研究方向為森林資源加工與利用。通信作者：吳彩娥，女，教授。E-mail:wucaie@njfu.edu.cn

TQ35

A

2096-1359(2017)01-0070-08