面筋食品中微生物群落分析及優(yōu)勢(shì)菌分離鑒定

侯愛香，劉靜，李珂，李宗軍，王佐，吳根梁

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 湖南 長(zhǎng)沙410128)

面筋食品中微生物群落分析及優(yōu)勢(shì)菌分離鑒定

侯愛香，劉靜，李珂，李宗軍*，王佐，吳根梁

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 湖南 長(zhǎng)沙410128)

為探明面筋食品腐敗變質(zhì)的主要污染途徑和微生物群落，從生產(chǎn)線、大型超市和零售小賣部多地取樣，用平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)菌落總數(shù)、霉菌酵母數(shù)、耐熱菌和大腸菌群數(shù)，用劃線法和點(diǎn)接法將優(yōu)勢(shì)菌分離，通過形態(tài)觀察和理化試驗(yàn)，結(jié)合16S rDNA序列和18S rDNA的ITS區(qū)域序列進(jìn)行優(yōu)勢(shì)菌鑒定。結(jié)果顯示：小賣部樣品的細(xì)菌總數(shù)達(dá)8×104CFU/g，酵母霉菌數(shù)達(dá)1.20×103CFU/g，都大大超過地方標(biāo)準(zhǔn)上限的數(shù)倍，其他樣品的微生物數(shù)量均在地方標(biāo)準(zhǔn)之內(nèi)，說明擠壓熟化工藝有較好的殺菌效果，后期生產(chǎn)銷售是造成污染的主要途徑；分離優(yōu)勢(shì)菌得 2類細(xì)菌 12株，3類霉菌 8株；2類細(xì)菌的代表菌為糞嗜冷桿菌(Psychrobacter faecalis)、黃褐假單胞菌(Pseudomonas fulva)，3類霉菌的代表菌為溜曲霉(Asperqillus tamarii)、灰黃青霉(penicilium griseofulvum)和黑曲霉(Asperqillus niger)。

面筋食品；細(xì)菌；霉菌；微生物群落

面筋食品是以小麥粉為主要原料，輔以食鹽、食糖、水等混合而成的松散面團(tuán)，經(jīng)專用食品機(jī)械擠壓熟化、成型、調(diào)味、包裝后制成的一種即食食品。因早期的產(chǎn)品多為條狀，所以俗稱辣條；也因起源于湖南平江縣，所以，又稱“湘式面筋”[1]。目前，市面上有條狀、掌狀、方塊狀、領(lǐng)結(jié)狀和螺旋狀的面筋食品。面筋食品香味濃郁，滋味豐滿，口感勁道，食用方便，很受青少年歡迎，并已銷售到歐美國(guó)家，產(chǎn)值每年以 10% 的速率增長(zhǎng)，發(fā)展前景十分廣闊。據(jù)統(tǒng)計(jì)，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)這類產(chǎn)品的生產(chǎn)企業(yè)達(dá)數(shù)千家，年消化面粉320萬t，食用油180萬t，辣椒24萬t，安排就業(yè)人員20多萬人次，該行業(yè)總體規(guī)模已達(dá)千億。盡管如此，但仍因部分企業(yè)生產(chǎn)環(huán)境差、技術(shù)投入少、管理滯后等原因使得面筋食品的質(zhì)量參差不齊，難以形成品牌效應(yīng)，甚至導(dǎo)致面筋食品被誤認(rèn)為是 “垃圾食品”[2]。據(jù)國(guó)家食藥監(jiān)總局2015年發(fā)布的“辣條”食用安全提示披露，面筋食品除了食品添加劑超標(biāo)外，菌落總數(shù)超標(biāo)也是存在的突出問題[3]。面筋食品菌落總數(shù)超標(biāo)一般由生產(chǎn)工藝不規(guī)范和生產(chǎn)環(huán)境不達(dá)標(biāo)等因素引起。條狀面筋產(chǎn)品是湘式面筋起源的代表產(chǎn)品(俗名“辣條”)。本研究中以通過了 GMP認(rèn)證的湖南平江縣某加工廠生產(chǎn)的面筋食品為樣品，對(duì)各樣品的微生物群落進(jìn)行檢測(cè)分析，并對(duì)產(chǎn)品的優(yōu)勢(shì)微生物進(jìn)行分離鑒定，旨在為面筋食品的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)加工提供指導(dǎo)，也為產(chǎn)品的防霉防腐提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采用隨機(jī)抽樣方式[4]，參照 DBS43002—2012進(jìn)行取樣。在湖南平江縣某加工廠生產(chǎn)線中取樣品A1(通過高溫?cái)D壓熟化后拉條切條的產(chǎn)品)，A2(傳送運(yùn)輸?shù)綕L揉槽調(diào)味后的產(chǎn)品)和A3(滾揉調(diào)味后已手工裝袋封口的產(chǎn)品，即包裝成品)，在大型超市取樣品A4(在5個(gè)大型超市購(gòu)買的條狀面筋食品的混合樣)，在小賣部取樣品A5(5所小學(xué)門口小賣部條狀面筋食品的混合樣)。

平板計(jì)數(shù)瓊脂(plate count agar，PCA)培養(yǎng)基參照GB/T4789.2—2010 配制；月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(lauryl sulfate tryptose，LST)肉湯、煌綠乳糖膽鹽(brilliant green lactose bile，BGLB)肉湯、VRBA瓊脂平板均參照GB4789.3—2010 配制；孟加拉紅培養(yǎng)基參照 GB4789.15—2010 配制。察氏培養(yǎng)基[5]中含硝酸鈉3.0 g/L，磷酸氫二鉀1.0 g/L，氯化鉀0.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸亞鐵0.01 g/L，蔗糖20.0 g/L。將所有培養(yǎng)基于121 ℃ 滅菌20 min。

1.2 主要儀器設(shè)備和試劑

主要儀器設(shè)備：電熱恒溫水浴鍋HH–8(上海浦東物理光學(xué)儀器廠)；分析天平TP–213(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；光學(xué)顯微鏡 CX系列(日本Olympus)；電熱鼓風(fēng)干燥箱 101–2AB(天津市泰斯特儀器有限公司)；高壓蒸氣滅菌鍋 SP500(日本YAMATO)；超凈工作臺(tái)SW–CJ–2D(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；恒溫生化培養(yǎng)箱SPX–250BS–Ⅱ和霉菌培養(yǎng)箱MJ– 250BS–Ⅱ(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；穗凌冰箱 LG4–882M2F(廣東穗凌電器有限公司)； pH計(jì) Testo205(Testo AG)；PCRMJMini PTC–1148(BIO– RAD)；Imaging System Gel Logic 212(Kodak)；臺(tái)式冷凍離心機(jī)TGL20(長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司)；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 DYY–Ⅲ–4(北京市六一儀器廠)。

主要試劑：藥品和試劑均為分析純。類胡蘿卜素、精氨酸雙水解酶、明膠、淀粉、葡萄糖、海藻糖、間–肌醇、Β–苯丙氨酸、L–脯氨酸、膿青素等細(xì)菌生理生化鑒定試劑盒購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。細(xì)菌引物和真菌引物購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。細(xì)菌引物[6]： F16S–27 (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)，R16S–1492(CGG TTACCTTGTTACGACTTC)。真菌引物[7]：ITS1(TC CGTAGGTGAACCTGCGG)，ITS4(TCCTCCGCTTA TTGATATGC)。細(xì)菌直接PCR試劑盒、真菌DNA提取試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒、PCR回收試劑盒等均購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 各樣品微生物群落的測(cè)定

菌落總數(shù)、大腸菌群數(shù)分別按 GB/T4789.2—2010、GB4789.3— 2010進(jìn)行測(cè)定；霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)按GB4789.15— 2010進(jìn)行測(cè)定；耐熱菌計(jì)數(shù)參照菌落總數(shù)的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)數(shù)前將樣品置于80 ℃的水浴鍋中加熱15 min。

1.3.2 優(yōu)勢(shì)菌種的分離

通過平板計(jì)數(shù)，以相同外觀的菌落生長(zhǎng)數(shù)量判斷優(yōu)勢(shì)菌群[8]，然后觀察菌落生長(zhǎng)特征，不斷點(diǎn)接或劃線，直至鏡檢無其他雜菌。操作流程：培養(yǎng)基配置—樣品處理—平板計(jì)數(shù)— 點(diǎn)接法[9]或劃線法分離— 純菌落—斜面試管保存 。

1.3.3 優(yōu)勢(shì)菌種的鑒定

采用平板培養(yǎng)特征、個(gè)體形態(tài)特征、生理生化反應(yīng)和分子生物學(xué)的方法進(jìn)行優(yōu)勢(shì)菌鑒定。操作流程：斜面菌種—培養(yǎng)特征觀察[10]—顯微鏡觀察—生理生化特征鑒定—總DNA提取[11]—瓊脂糖電泳[12]—PCR擴(kuò)增[13]—瓊脂糖電泳—回收PCR產(chǎn)物[14]—送檢測(cè)序—序列分析—構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[15]。具體操作步驟如下：

1) 形態(tài)學(xué)觀察。觀察細(xì)菌和霉菌在平板和斜面上的培養(yǎng)特征，同時(shí)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，用光學(xué)顯微鏡放大100 倍觀察；用插片法培養(yǎng)霉菌，用光學(xué)顯微鏡放大40 倍觀察[16]。

2) 生理生化特征鑒定。細(xì)菌生理生化特征鑒定以《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第8版)為依據(jù)，選取14項(xiàng)特征進(jìn)行試驗(yàn)。霉菌不做生理、生化特征鑒定試驗(yàn)。

3) 總DNA的提取。細(xì)菌不提取總DNA，直接用菌體進(jìn)行PCR擴(kuò)增。霉菌總DNA提取步驟如下：挑霉菌至碾缽；在碾缽中加200 μL植物lysis Buffer，研磨至粉狀；繼續(xù)加600 μL植物lysis Buffer，0.8 μL β巰基乙醇，混勻，將碾缽中的菌體轉(zhuǎn)移至離心管，65 ℃水浴40 min，12 000 r/min離心10 min；去上清液，加等體積氯仿抽提，12 000 r/min離心5 min；取上清水相，加 700 μL植物Binding Buffer，上柱靜置5 min，之后12 000 r/min離心2 min；取沉淀，用80%的乙醇500 μL清洗 2 次，12 000 r/min離心1 min；室溫靜置10 min晾干，加40 μL H2O，靜置5～10 min；將懸液換置到新的EP管，13 000 r/min離心2 min，得管底沉淀。該沉淀即為基因組DNA。

4) 目的片段的PCR擴(kuò)增。細(xì)菌目的片段擴(kuò)增反應(yīng)體系50 μL，其中，凍干PCR 2X MIX為25 μL，引物27F、1492R和模板各1 μL；ddH2O為22 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，54℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)35次，72 ℃延伸10 min。霉菌目的片段擴(kuò)增反應(yīng)體系50 μL，其中，凍干PCR 2X MIX為25 μL，引物ITS1、ITS4各1 μL，模板2 μL，ddH2O為21 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，循環(huán)35次，72 ℃延伸10 min。

5) PCR產(chǎn)物回收。在2.0%瓊脂糖凝膠電泳膠片上切取目的片斷，加入300 μL/(100 mg)回收試劑液A，在60 ℃水浴至膠片完全溶化，加入50 μL回收試劑液B混勻，將溶液置于離心柱中，靜置5 min，12 000 r/min離心1 min，棄液體，在沉淀中加入80%乙醇500 μL，12 000 r/min離心1 min，棄液體。重復(fù)1次。將沉淀于12 000 r/min離心5 min，甩干余液，晾5～8 min，將離心柱置于新的離心管中，加入30 μL 的ddH2O，靜置10 min，13 000 r/min離心3 min，得管底沉淀。將該沉淀置于－18 ℃冰箱凍藏，隨后送至北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序。

6) 序列分析。將測(cè)得的堿基序列上傳至網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，將序列在 GenBank中進(jìn)行比對(duì)，利用 Lasergene軟件構(gòu)建樣品中優(yōu)勢(shì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 各樣品微生物群落的測(cè)定結(jié)果

關(guān)于面筋食品的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)還未制定。湖南廠家采用的是湖南地方標(biāo)準(zhǔn)《湘式擠壓糕點(diǎn)》DBS43002— 2012。此標(biāo)準(zhǔn)要求菌落總數(shù)(CFU/g)≤1.0×104，大腸菌群數(shù)(MPN/(100 g))≤9.0×10，酵母和霉菌數(shù)(CFU/g)≤1.5×102。本研究中采用本標(biāo)準(zhǔn)。由表1可見，A1的菌落總數(shù)、霉菌和酵母數(shù)、耐熱菌數(shù)、大腸菌群數(shù)都很少，說明擠壓熟化能起到商業(yè)殺菌效果。A2的大腸菌群數(shù)和耐熱菌數(shù)很少，但菌落總數(shù)、霉菌酵母數(shù)分別為 4.2×102、2.2×10 CFU/g，說明產(chǎn)品在冷卻傳送過程中已受到了傳送帶、空氣、滾揉槽、調(diào)味料或操作人員的污染；A3的大腸菌群數(shù)和耐熱菌數(shù)分別為3 MPN/(100 g)和2.5×10 CFU/g，菌落總數(shù)、霉菌酵母數(shù)分別為9.5×102、6.8×10 CFU/g，比A1和A2的菌落總數(shù)、霉菌酵母數(shù)多，說明運(yùn)送槽、工作人員、空氣、包裝臺(tái)面的微生物殘留導(dǎo)致微生物數(shù)量增加。市售成品A4和A5的各項(xiàng)微生物指標(biāo)均在地方標(biāo)準(zhǔn)之內(nèi)，A5的細(xì)菌總數(shù)、霉菌酵母數(shù)超過了地方標(biāo)準(zhǔn)，說明小賣部零售面筋食品存在一定的微生物超標(biāo)現(xiàn)象，其細(xì)菌總數(shù)高達(dá)地方標(biāo)準(zhǔn)上限的8倍，霉菌酵母數(shù)比地方標(biāo)準(zhǔn)上限高10倍以上。對(duì)5個(gè)樣品進(jìn)行巴士殺菌處理后，用平板計(jì)數(shù)法測(cè)樣品的耐熱菌數(shù)量，在 A1中基本未發(fā)現(xiàn)耐熱菌，說明擠壓熟化工藝對(duì)耐熱菌的殺菌效果好；在 A2、A3中有少量耐熱菌，說明產(chǎn)品暴露于空氣中冷卻、調(diào)味、包裝時(shí)會(huì)受到輕度污染，但耐熱菌數(shù)量不到菌落總數(shù)的3%，不是生產(chǎn)中的主要污染微生物；A4、A5樣品中耐熱菌的含量都很少，說明貯運(yùn)銷售過程中引起面筋食品腐敗變質(zhì)的主要微生物不是耐熱菌。綜合分析5個(gè)樣品的微生物數(shù)量，發(fā)現(xiàn)面筋食品的優(yōu)勢(shì)微生物是細(xì)菌和霉菌，擠壓熟化工藝的殺菌效果良好，后期運(yùn)輸、調(diào)味和銷售過程是主要的污染途徑。

表1 各樣品的菌落總數(shù)、霉菌酵母數(shù)、大腸菌群數(shù)和耐熱菌數(shù)Table 1 Total aerobic plate count, number of moulds and yeasts, coliforms and the heat-resistance bacteria in gluten foods

2.2 優(yōu)勢(shì)菌種的分離結(jié)果

選取優(yōu)勢(shì)菌菌落進(jìn)行分離純化，得到優(yōu)勢(shì)細(xì)菌12株，霉菌8株。12株優(yōu)勢(shì)細(xì)菌可以根據(jù)斜面培養(yǎng)特征分為2類：一類呈灰白色，有7株，編號(hào)為1A，1B，1C，…，1G，稱灰白類；一類呈微黃色，有5株，編號(hào)為5A，5B，5C，…，5E，稱微黃類。以培養(yǎng)2 d后的斜面菌落特征為依據(jù)，8株霉菌可分為3類：a類有3株，著生黃綠色孢子，菌株編號(hào)為2–1、2–2、2–3；b類有3株，著生黑色孢子，菌株編號(hào)為3–1、3–2、3–5； c類有2株，著生青灰色孢子，菌株編號(hào)為3–3和3–4。

2.3 優(yōu)勢(shì)微生物的鑒定結(jié)果與分析

2.3.1 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

觀察2類細(xì)菌和3類霉菌在平板上的培養(yǎng)特征，同類菌株的菌落大小和培養(yǎng)特征一致，選各類優(yōu)勢(shì)菌的代表菌株1D、5D、2–1、3–4、3–5拍照，記錄培養(yǎng)特征如圖1和圖2所示。

圖1 細(xì)菌菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of bacteria

圖2 霉菌菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of moulds

由圖1、圖2可見，1D菌落呈灰白色，表面濕潤(rùn)光澤，呈規(guī)則露滴狀，邊緣整齊；5D菌落呈微黃色，表面濕潤(rùn)光澤，半透明，呈較小的圓點(diǎn)狀，邊緣整齊。2–1在培養(yǎng)基中出現(xiàn)大量褐黃色孢子和菌絲；3–4在培養(yǎng)基中出現(xiàn)大量中央凸起的灰黃色輻射狀菌落，菌落表面呈短絨狀，四周灰青色；3–5在培養(yǎng)基中有眾多黑色孢子和菌絲。

觀察2類細(xì)菌和3類霉菌的個(gè)體形態(tài)，發(fā)現(xiàn)同類菌在顯微鏡下的個(gè)體大小和形態(tài)特征基本一致；選各類代表菌株 1D、5D、2–1、3–4、3–5拍照，記錄其個(gè)體形態(tài)特征。對(duì)細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，用光學(xué)顯微鏡放大1 000倍觀察(圖3和圖4)，發(fā)現(xiàn)1D和5D均為革蘭氏陰性和無芽孢的小桿菌。對(duì)霉菌進(jìn)行插片培養(yǎng)，用光學(xué)顯微鏡放大 400倍觀察(圖5～7)，2–1菌絲有隔膜和足細(xì)胞，分生孢子梗無隔膜，頂端膨大；3–4菌絲有隔膜，分子孢子梗有隔膜，無頂囊，分生孢子呈掃帚狀分布；3–5菌絲有隔膜和足細(xì)胞，分生孢子梗無橫隔膜，頂端膨大。

圖3 1D的顯微形態(tài)(10×100)Fig.3 Micromorphology of 1D

圖4 5D 的顯微形態(tài)(10×100)Fig.4 Micromorphology of 5D

圖5 2–1的顯微形態(tài)(10×40)Fig.5 Micromorphology of 2–1

圖6 3–4的顯微形態(tài)(10×40)Fig.6 Micromorphology of 3–4

圖7 3–5的顯微形態(tài)(10×40)Fig.7 Micromorphology of 3–5

由圖1～7可見，2類細(xì)菌表面光滑，菌落濕潤(rùn)，且均為革蘭氏陰性的小桿菌(但憑此還不能得出 2類細(xì)菌具體的種屬信息。2類細(xì)菌種屬信息的確定還需要結(jié)合生理、生化反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果和分子生物學(xué)鑒定試驗(yàn)結(jié)果來判斷)。根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》中對(duì)各菌特征的描述，由各類霉菌優(yōu)勢(shì)菌的菌落形態(tài)和菌絲結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可以得出：3株a類霉菌著生黃綠色孢子，菌絲有隔膜和足細(xì)胞，可初步判斷其為曲霉(選取其中的代表菌株 2–1進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定試驗(yàn))；3株b類霉菌著生黑色孢子，菌絲有隔膜和足細(xì)胞，可初步判斷其為曲霉(選取其中的代表菌株3–5進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定試驗(yàn))；2株c類霉菌著生青灰色孢子，菌絲有隔膜，分生孢子呈掃帚狀，可初步判斷其為青霉(選取其中的代表菌株 3–4進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定試驗(yàn))。

2.3.2 生理生化特征鑒定結(jié)果

由表2可見，7 株灰白色類的細(xì)菌生理生化反應(yīng)特征完全一致，結(jié)合培養(yǎng)特征、顯微形態(tài)，對(duì)照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》第八版各菌的特征描述，該7株細(xì)菌的生理生化特征符合惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的特征。5株微黃色的細(xì)菌的生理生化反應(yīng)特征也完全一致，但與《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》第八版中記載的惡臭假單胞菌特征比對(duì)，這5株菌能在41～42 ℃生化培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，能夠水解明膠，與惡臭假單胞菌的生理生化特征不符；與記載的產(chǎn)堿假單胞菌對(duì)比，這5株菌L–脯氨酸反應(yīng)為陽(yáng)性，與產(chǎn)堿假單胞菌的生理生化特征也不符。可見，參考《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》第八版，不能確定5株微黃色細(xì)菌具體的分類地位。分別選這兩類細(xì)菌的代表菌株1D和5D進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定試驗(yàn)。

表2 所分離的12株細(xì)菌的生理生化反應(yīng)結(jié)果Table 2 Physiological & biochemical experiment results of 12 strains of bacteria

2.3.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果與分析

1) 目的片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果與分析。由圖 8可見，產(chǎn)物條帶清晰，兩細(xì)菌目的片段的大小均約為1 600 bp。

圖8 細(xì)菌16S rDNA的電泳結(jié)果Fig.8 16S rDNA electrophoretogram of bacteria

由圖9可見，擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶清晰，3株霉菌目的片段的大小約500～750 bp。

圖9 霉菌ITS rDNA的電泳結(jié)果Fig.9 ITS rDNA electrophoretogram of moulds

2) 送檢測(cè)序結(jié)果與分析。檢測(cè)基因序列，測(cè)出細(xì)菌1D堿基序列1 432個(gè)，細(xì)菌5D堿基序列1 427個(gè)。將這兩序列在網(wǎng)站http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/上進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)1D與登錄號(hào)LK391545.1糞嗜冷桿菌(Psychrobacter faecalis)序列的相似度為99%，細(xì)菌5D與登錄號(hào)JQ229296.1黃褐假單胞菌(Pseudomonas fulva)序列、登錄號(hào)KM079616.1惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)序列的相似度均為99%。從基因庫(kù)中調(diào)出這3種細(xì)菌的基因序列，構(gòu)建細(xì)菌1D和5D的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖10所示。

圖10 2株細(xì)菌的16S rDNA區(qū)域序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.10 Phylogenic tree of 2 strains of bacteria based on 16S rDNA

檢測(cè)基因序列，測(cè)出霉菌2–1堿基序列601個(gè)，霉菌3–4堿基序列526個(gè)，霉菌3–5堿基序列603個(gè)。將3株霉菌的序列在網(wǎng)站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/上進(jìn)行 BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn) 2–1與登錄號(hào)KP165434.1溜曲霉(Asperqillus tamarii)序列的相似度為 99%，3–4與登錄號(hào) KF811439.1灰黃青霉(Penicilium griseofulvum)序列的相似度為99%，3–5與登錄號(hào)HQ285563.1黑曲霉(Asperqillus niger) 序列的相似度為100%。從基因庫(kù)中調(diào)出這3種霉菌的基因序列，構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹如圖11所示。

圖11 3株霉菌的ITS rDNA區(qū)域序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.11 Phylogenic tree of 3 strains of moulds based on ITS rDNA

觀察圖10所示的系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)1D為糞嗜冷桿菌(P.faecalis)，5D為黃褐假單胞菌(P.fulva)。這兩菌都為革蘭氏陰性小桿菌。該結(jié)果與形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果一致。菌株1D的生理生化特征與惡臭假單胞菌(P.putida)的相符，而分子生物學(xué)鑒定結(jié)果為糞嗜冷桿菌(P.faecalis)。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹比較兩者的親緣關(guān)系，糞嗜冷桿菌(P.faecalis)是惡臭假單胞菌的分支，因此以分子生物學(xué)鑒定結(jié)果為準(zhǔn)，判斷1D為糞嗜冷桿菌(P.faecalis)。綜合5D 的培養(yǎng)特征、個(gè)體形態(tài)、生理生化反應(yīng)與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，判斷5D為黃褐假單胞菌(P.fulva)。

觀察圖11所示系統(tǒng)發(fā)育樹，得出霉菌2–1為溜曲霉(A.tamarii)，3–4為灰黃青霉(P.griseofulvum)，3–5為黑曲霉(A.niger)。3株霉菌的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果均與形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

研究發(fā)現(xiàn)，從面筋食品生產(chǎn)線上所取樣品(A1、A2、A3)和在大型超市購(gòu)買樣品(A4)的各項(xiàng)微生物指標(biāo)均符合地方標(biāo)準(zhǔn)；在小賣部購(gòu)買樣品(A5)的細(xì)菌總數(shù)與霉菌酵母數(shù)都超過地方標(biāo)準(zhǔn)，說明擠壓熟化工藝的殺菌效果良好，后期運(yùn)輸、調(diào)味和銷售過程是主要的污染途徑。依據(jù)微生物指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，大型超市面筋食品的質(zhì)量?jī)?yōu)于小賣部的。面筋食品微生物超標(biāo)現(xiàn)象可以通過規(guī)范工藝和改善生產(chǎn)、銷售環(huán)境衛(wèi)生狀況等方式進(jìn)行控制和預(yù)防。面筋食品的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為糞嗜冷桿菌(P.faecalis)和黃褐假單胞菌(P.fulva)。這2種細(xì)菌均為革蘭氏陰性和無芽孢的小桿菌，經(jīng)過擠壓熟化工藝可將其殺滅。優(yōu)勢(shì)霉菌為溜曲霉(A.tamarii)、灰黃青霉(P.griseofulvum)和黑曲霉(A.niger)。這3種霉菌主要來自于香辛調(diào)味料和空氣。對(duì)生產(chǎn)環(huán)境、調(diào)味輔料進(jìn)行殺菌消毒，即可避免霉菌對(duì)產(chǎn)品的污染。

面筋食品生產(chǎn)為中國(guó)新興的地方產(chǎn)業(yè)，國(guó)外對(duì)其的了解和研究都還處于空白階段。食品添加劑和微生物數(shù)量超標(biāo)是面筋食品存在的兩大主要問題[6,17]。本研究中探明了造成面筋食品污染的微生物及其污染來源，開啟了面筋食品研究的新領(lǐng)域。若要全面了解面筋食品微生物的構(gòu)成和多樣性，需要對(duì)研究方法進(jìn)行改進(jìn)，如采用樣品中可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)微生物的常用檢測(cè)技術(shù) PCR–DGGE或 PCR–TGGE[18–19]、通過16SV4區(qū)引物(515F和806R)鑒定細(xì)菌的多樣性、通過ITS1–5F/ITS2區(qū)引物鑒定真菌的多樣性[20–21]等等。

糞嗜冷桿菌(P.faecalis)和黃褐假單胞菌(P.fulva)通常是通過人為感染的[22]。面筋食品生產(chǎn)中一般采用人工分裝，因此，要對(duì)與產(chǎn)品接觸的工作臺(tái)面、器皿和操作人員等人為感染途徑進(jìn)行嚴(yán)格消毒。大部分企業(yè)采用紫外線、臭氧和 75%的乙醇?xì)⒕?，其消毒效果良好。進(jìn)一步改進(jìn)生產(chǎn)工藝，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化調(diào)味、運(yùn)輸和分裝，減少人員接觸，能從根本上減少污染途徑。面筋食品中的優(yōu)勢(shì)霉菌溜曲霉(A.tamarii)、灰黃青霉(P.griseofulvum)和黑曲霉(A.niger)存在于香辛調(diào)味料和空氣中，因此有必要對(duì)香辛調(diào)味料和空氣進(jìn)行殺菌消毒。常采用紫外線和臭氧技術(shù)對(duì)空氣進(jìn)行殺菌處理。面筋食品使用的香辛調(diào)味料種類繁多，對(duì)辣椒、孜然等干燥原料的殺菌可以參考文獻(xiàn)[23–27]中的方法。此外，改變生產(chǎn)工藝，如在原工藝的基礎(chǔ)上增加成品殺菌工序，或?qū)枇险{(diào)味操作工序調(diào)至擠壓熟化工藝之前，等等，這樣既不增加成本，又可殺菌，減少后期污染。

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責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王 庫(kù)

Analysis of microbial community and isolation and identification of their dominant microorganism in gluten food

HOU Aixiang, LIU Jing, LI Ke, LI Zongjun*, WANG Zuo, WU Genliang
(College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

To understand the dominant decaying microorganism, microfora composition and pollution pathways that causing gluten food deterioration, multiple samples of gluten foods were collected from various approaches, such as the factory production lines, large supermarket and small store.The total aerobic bacterial count, number of moulds and yeasts, coliforms and heat–resistance bacteria were tested using plate count method; the dominant microorganism were jointly isolated using plate streak method and point planting method, and their identification were based on the microscopic examination, physiological & biochemical test and the 16S rDNA gene sequence (the ITS sequence of 18S rDNA).The results showed that the total aerobic plate count from small store was 8×104CFU/g, the number of moulds and yeasts reached to 1.20×103CFU/g, which exceeded several times more than the limitation of local standard, while, the microbial populations from other sources of samples were in the scope of local standard.These results indicated that the extrusion technology was good for sterilization, but the later production and sale process was the main pathway leading to gluten food pollution.There 12 strains of bacteria which were subdivided into two categories and 8 strains of moulds which were subdivided into three categories were isolated in the test.The 2 dominant strains of bacteria were Psychrobacter faecalis, Pseudomonas fulva, and the 3 dominant strains of moulds were Asperqillus tamarii, Penicilium griseofulvum and Asperqillus niger.

gluten food; bacteria; mold; identification

TS201.3

：A

：1007-1032(2017)01-0079-08

2016–05–01

2016–09–27

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(2015XCX1517)

侯愛香( 1982—)，女，湖南臨湘人，博士研究生，講師，主要從事食品微生物技術(shù)和食品文化研究，aixianghou@163.com；*通信作者，李宗軍，教授，主要從事食品生物技術(shù)研究，hnlizongjun@163.com