加味宮外孕II號方對早孕大鼠滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡因子Bax、Bcl-2的影響

鄭文蘭，楊江燕，謝 智，文曉敏

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附原醫(yī)院，貴州 貴陽 550001；2.貴州省綏陽縣中醫(yī)醫(yī)院，貴州 綏陽 550001)

加味宮外孕II號方對早孕大鼠滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡因子Bax、Bcl-2的影響

鄭文蘭1，楊江燕2，謝 智1，文曉敏1

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附原醫(yī)院，貴州 貴陽 550001；2.貴州省綏陽縣中醫(yī)醫(yī)院，貴州 綏陽 550001)

目的 探索加味宮外孕Ⅱ號方對早孕大鼠滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡因子Bax(促凋亡基因)、Bcl-2(抗凋亡基因)的影響。方法 將造模成功的早孕大鼠隨機(jī)分為6組：西藥組(甲氨蝶呤組)、中西藥結(jié)合組(甲氨蝶呤和加味宮外孕Ⅱ號方)、中藥加味宮外孕Ⅱ號方低、中、高劑量組和空白組(生理鹽水)，分別給予甲氨蝶呤1次肌注、中藥或生理鹽水每天灌胃1次，連續(xù)7 d，用藥后第8 d處死孕鼠取出其子宮及孕囊，用免疫組化法檢測滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡因子Bax、Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果 5個(gè)實(shí)驗(yàn)組孕鼠滋養(yǎng)葉細(xì)胞Bcl-2評分降低，Bax評分升高，Bcl-2/Bax比值下降，與空白組比較均有差異(P<0.05)；而中西藥結(jié)合組變化最明顯，與其他幾組比較有差異(P<0.05)，中藥高、中劑量組、西藥組間比較無差異，P>0.05，但與中藥低劑量組比較有差異(P<0.05)。結(jié)論 加味宮外孕II號方和甲氨蝶呤均可通過降低妊娠大鼠滋養(yǎng)葉細(xì)胞的Bcl-2、升高Bax的表達(dá)，使Bcl-2/Bax比值下降從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，達(dá)到殺胚的目的；且中西醫(yī)結(jié)合效果最好，中藥隨劑量增加，殺胚作用逐漸加強(qiáng)。

加味宮外孕Ⅱ號方；滋養(yǎng)細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；實(shí)驗(yàn)研究

異位妊娠是婦科常見的急腹癥，發(fā)病率約為1%，并有逐年增加趨勢[1]，嚴(yán)重者可引起患者失血性休克，甚至死亡，病死率占孕婦死亡總數(shù)的9 %～10 %[2]。本院多年來一直致力于異位妊娠中西醫(yī)結(jié)合治療的臨床研究，取得較滿意的治療效果，實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，活血?dú)⑴呦Y中藥可以通過改變早孕大鼠滋養(yǎng)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)、分泌功能、促使炎細(xì)胞浸潤，致胚胎發(fā)育停滯而起殺胚作用[3]。鄧高丕等研究提示：化瘀消癥中藥可通過下調(diào)滋養(yǎng)葉細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，降低Bcl-2/Bax比值，從而促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的途徑起到治療輸卵管妊娠的作用[4]。為探索本院治療異位妊娠所用方(加味宮外孕Ⅱ號方)對滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的影響，本研究以早孕大鼠為模型，檢測經(jīng)加味宮外孕Ⅱ號方干預(yù)后的大鼠滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的表達(dá)，結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級SD大鼠共110只，性成熟未生育雌性大鼠80只(體重260±10)g；性成熟雄性大鼠30只(體重280±10)g；由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號：SCXK-(渝)2012-0005。

1.2 藥物與試劑 加味宮外孕II號方組成：丹參15 g，桃仁9 g，赤芍15 g，莪術(shù)9 g，三棱9 g，全蝎10 g，土鱉蟲10 g，蜈蚣9 g，紫草25 g；以上中藥購于貴州省中醫(yī)院；稱取上藥后，水煎、過濾、濃縮成每毫升各含生藥6 g(高劑量)、3 g(中劑量)、1.5 g(低劑量)的3種藥液，分別裝瓶標(biāo)記，置于4℃冰箱冷藏備用。注射用甲氨喋呤(MTX)，5 mg/瓶，生產(chǎn)批號H14022462，山西普德藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；鼠抗人Bcl-2單克隆抗體及鼠抗人Bax單克隆抗體均購自廣州深達(dá)生物制品技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型制備 現(xiàn)有的文獻(xiàn)資料未發(fā)現(xiàn)有建立異位妊娠動(dòng)物模型的方法。本研究用早孕大鼠作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，造模方法參照《藥理?shí)驗(yàn)方法學(xué)》[5]。所有雌鼠連續(xù)行陰道脫落細(xì)胞涂片檢查2周，剔除無動(dòng)情周期雌鼠16只，入組有規(guī)律動(dòng)情周期的雌鼠64只；將雄鼠與雌鼠按1：1比例合籠過夜，次日清晨取雌鼠陰道分泌物行光鏡檢查，如發(fā)現(xiàn)精子即為妊娠第1 d。

2.2 動(dòng)物分組與給藥 將交配成功的雌鼠隨機(jī)編號分為6組：西藥組、中西藥結(jié)合組和中藥低、中、高劑量組、空白組。經(jīng)計(jì)算，每只大鼠加味宮外孕II號方給藥劑量為0.777 mL/100 g/d，MTX給藥劑量為0.7775mg/100 g。給藥的時(shí)間為09：00-10：00。

2.2.1 西藥組 妊娠第1 d按0.7775mg/100 g體重肌注MTX，1次為1療程，以后不再給藥，并同時(shí)按0.777 mL/100 g體重予生理鹽水灌胃，1次/d。

2.2.2 中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組 妊娠第1 d按0.777 mL/100 g體重分別給予高劑量、中劑量、低劑量的加味宮外孕Ⅱ號方灌胃，1次/d。

2.2.2 中西藥結(jié)合組 妊娠第1 d予中劑量加味宮外孕Ⅱ號方灌胃及MTX肌注。方法同西藥組及中藥中劑量組。

2.2.3 空白組 妊娠第1 d按0.777 mL/100 g體重予0.9%生理鹽水灌胃，1次/d。中藥及生理鹽水灌胃均連續(xù)用7 d。

2.3 Bcl-2、Bax的檢測

2.3.1 孕鼠妊娠子宮標(biāo)本的采集 孕鼠第7 d晚8∶00開始禁飲食，次日8：00處死大鼠后迅速取出子宮并置于4%多聚甲醛固定24 h，制成石蠟切片。

2.3.2 Bcl-2、Bax的檢測 將上述石蠟切片脫蠟、水化后采用免疫組化法檢測滋養(yǎng)葉細(xì)胞凋亡因子Bcl-2、Bax的表達(dá)。嚴(yán)格按照Bcl-2、Bax試劑盒操作說明進(jìn)行操作。Bcl-2、Bax診斷評分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[6]擬定。隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野，計(jì)算陽性細(xì)胞的百分率，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分為：在細(xì)胞內(nèi)無棕黃色顆粒為陰性(-)記0分；在<50%的細(xì)胞內(nèi)有棕黃色顆粒為弱陽性(+)記1分；在≥50%的細(xì)胞內(nèi)有較淺的棕黃色或在<50%的細(xì)胞內(nèi)有明顯較深棕黃色顆粒為陽性(++)記2分；在≥ 50%的細(xì)胞內(nèi)有明顯較深的棕黃色顆粒為強(qiáng)陽性(+++)記3分。求每例10個(gè)高倍視野評分的平均值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

3 結(jié)果

3.1 滋養(yǎng)細(xì)胞Bcl-2表達(dá)評分 與空白組比較，5個(gè)實(shí)驗(yàn)組大鼠妊娠滋養(yǎng)葉細(xì)胞Bcl-2表達(dá)評分均下降，P<0.05；中西藥結(jié)合組和中藥高劑量組下降最明顯，分別與另外3個(gè)實(shí)驗(yàn)組比較有差異，P<0.05；中西藥結(jié)合組和中藥高劑量組間比較無差異，P>0.05；西藥組和中藥中劑量組比較無差異，P>0.05；與中藥低劑量組間比較有差異，P<0.05。詳見表1。

表1 6組孕鼠滋養(yǎng)細(xì)胞Bcl-2表達(dá)評分的比較±s)

3.2 滋養(yǎng)細(xì)胞Bax表達(dá)評分及Bcl-2/Bax比值 與空白組比較，5個(gè)實(shí)驗(yàn)組大鼠滋養(yǎng)細(xì)胞Bax表達(dá)評分均有上升，P<0.05；而中西藥結(jié)合組和中藥高劑量組上升最明顯，分別與另外3個(gè)實(shí)驗(yàn)組比較有差異，P<0.05；前2組間比較無差異，P>0.05，西藥組與中藥中、低劑量組間比較無差異，P>0.05。

Bcl-2/Bax比值：和空白組相比，另外5組Bcl-2/Bax比值均降低，P<0.05；其中中西藥結(jié)合組與其他4個(gè)用藥組比較有差異，P<0.05；中藥高劑量組、中藥中劑量組、西藥組間比較無差異，P>0.05，但與中藥低劑量組比較有差異，P<0.05。詳見表2。

表2 6組孕鼠滋養(yǎng)細(xì)胞Bax表達(dá)評分及Bcl-2/Bax比值的比較

4 討論

中醫(yī)認(rèn)為，異位妊娠的病機(jī)是少腹血瘀實(shí)證，其治則為活血?dú)⑴呦Y。本院以活血?dú)⑴呦Y法為立方依據(jù)擬定的經(jīng)驗(yàn)方即加味宮外孕Ⅱ號方，方藥組成：丹參、赤芍、桃仁、三棱、莪術(shù)、蜈蚣、全蝎、土鱉蟲、紫草等。方中丹參有活血祛瘀、涼血消癰、除煩安神之功。赤芍具有清熱涼血、消癥止痛的功效，桃仁有活血祛瘀推陳致新之功，三棱、莪術(shù)均有破血行氣、消積止痛之功，蜈蚣、全蝎有攻毒散結(jié)、通絡(luò)止痛之功。土鱉蟲有破血逐瘀之功效，紫草長于涼血活血。全方共奏活血化瘀、殺胚消癥之功效。鄭文蘭等[3]研究認(rèn)為該方可使早孕大鼠滋養(yǎng)葉細(xì)數(shù)量、超微結(jié)構(gòu)及分泌功能發(fā)生明顯變化，從而導(dǎo)致胚胎死亡。

細(xì)胞凋亡是由基因編碼決定的細(xì)胞主動(dòng)死亡，其啟動(dòng)和進(jìn)程受一定程序的控制。其中抗凋亡蛋白 Bcl-2和促凋亡蛋白Bax在細(xì)胞凋亡通路中起著重要的調(diào)節(jié)作用。Bcl-2/Bax蛋白的比值決定了細(xì)胞存活或凋亡，Bcl-2>Bax，細(xì)胞趨于存活；Bcl-2

[1]豐有吉，沈鏗.婦產(chǎn)科學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：70-71.

[2]Berg CJ，Atrash HK，Koonin LM，et al.Pregnancy-related morality in the United States，1987-1990.Obstet Gynecol，1996，88(1)：161.

[3]鄭文蘭，趙春梅，楊江燕.活血?dú)⑴呦Y法對早孕大鼠妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2013，(10)：60-61.

[4]鄧高丕，袁爍.化瘀消癥殺胚復(fù)方含藥血清對體外培養(yǎng)輸卵管妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2012，27(4)：1003-1007.

[5]徐淑云，卞職濂，陳修，等.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1991.1313-1314.

[6]張婷，呂東，王鳳蓮.細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2在子癇前期患者胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)及意義[J].泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào).2011，32(4)：264-266.

[7]王衛(wèi)東.Bcl-2/Bax比率與細(xì)胞“命運(yùn)”[J]。中國腫瘤生物治療雜志，2007，14(4)：393-396.

鄭文蘭(1963-)，女，貴州人，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合婦科。

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1007-2349(2015)12-0073-02

2015-09-29)