厄洛替尼引起皮膚不良反應(yīng)的小鼠模型建立

宋亞中，徐央波，鄧 博， 崔慧娟*，彭艷梅，劉戴維，王塏涵， 劉 凡，段 樺，邱鈺芹，李 嬙

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院，北京 100029)

厄洛替尼引起皮膚不良反應(yīng)的小鼠模型建立

宋亞中1，徐央波1，鄧 博2， 崔慧娟2*，彭艷梅1，劉戴維1，王塏涵1， 劉 凡1，段 樺1，邱鈺芹1，李 嬙1

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院，北京 100029)

目的 厄洛替尼(商品名：特羅凱)是治療非小細(xì)胞肺癌的一種新型靶向藥物，近些年來臨床應(yīng)用甚廣，但副作用較多，其中以皮疹最為多見，且最令患者難以接受。本研究旨在觀察應(yīng)用特羅凱前后小鼠在表皮、病理、免疫組化等方面的改變，復(fù)制特羅凱所致皮疹的動(dòng)物模型,為臨床外用藥物治療皮疹提供模型。方法 使用BALB/c雌性小鼠 20只，隨機(jī)分成4組。實(shí)驗(yàn)組(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組)用濃度為10 g/L的特羅凱溶液按100 mg/kg灌胃，對(duì)照組(Ⅰ組)以等體積去離子水灌胃，每天1次。于給藥前24 h在小鼠頭頸、背、腰處脫毛,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后剪取頸部、背部、腰部皮膚并觀察實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組小鼠在肉眼皮膚、病理切片、免疫組化等方面的改變。結(jié)果 (1)四組小鼠之間在毛發(fā)再生天數(shù)、毛發(fā)完全再生天數(shù)、脫屑時(shí)間、出現(xiàn)皮疹時(shí)間、毛孔擴(kuò)張數(shù)等5方面的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01或P< 0.05)；(2)Ki67：四組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。結(jié)論 (1)此次實(shí)驗(yàn)印證了許多研究者關(guān)于“EGFRIs導(dǎo)致的皮疹為一種炎癥反應(yīng)”的觀點(diǎn)；(2)該皮疹模型可靠實(shí)用，具有可重復(fù)性，適用于“EGFRIs所致皮疹動(dòng)物模型”的大批建立，可推廣以供臨床、試驗(yàn)、研究所用。

厄洛替尼；皮疹；皮膚；病理；免疫組化

肺癌的死亡率占全球腫瘤相關(guān)死亡的首位，而非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌總數(shù)的 80%～85%，目前的治療主要包括手術(shù)、化療、放療、分子靶向治療及生物免疫治療等[1]。分子靶向藥物主要為表皮生長因子受體抑制劑(epidermal growth factor receptor inhibitors,EGFRIs),包括單克隆抗體和EGFR酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor,TKI)等，其中TKI類藥物使用范圍甚廣。厄洛替尼(商品名：特羅凱)、吉非替尼(商品名：易瑞沙)是較早在中國上市的TKI類藥物,也是表皮生長因子受體抑制劑(Epidermal growth factor receptor inhibitors EGFRIs)的代表藥物。但其諸多不良反應(yīng)不容忽視。50%以上接受治療的患者會(huì)發(fā)生皮膚毒性[2]。其中，痤瘡樣皮疹是最常見的EGFRIs皮膚毒性反應(yīng)[3]。雖然Perez-Soler R等[4]認(rèn)為：出現(xiàn)皮疹的患者(75%)的生存期顯著優(yōu)于未出現(xiàn)皮疹的患者，且一項(xiàng)Meta分析也顯示：患者皮疹越嚴(yán)重，療效會(huì)越好[5]。但皮疹會(huì)繼發(fā)瘙癢、疼痛、皮膚受損等不適癥狀，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，甚至有些患者因此而停藥，影響靶向藥物的繼續(xù)治療。所以如何減少或治療靶向藥所致的皮疹等皮膚不良反應(yīng)，是臨床亟待解決的問題。目前仍缺乏行之有效、機(jī)制明確的應(yīng)對(duì)藥物，因此本實(shí)驗(yàn)望有效復(fù)制EGFRIs類藥物所致的皮疹動(dòng)物模型，為臨床盡早研發(fā)治療此類皮疹的藥物提供動(dòng)物模型基礎(chǔ)。鑒于目前主要的TKI類藥物為特羅凱、易瑞沙等，且二者的抗瘤機(jī)制基本相同，主要通過抑制多種上皮細(xì)胞腫瘤中過度表達(dá)的EGFR受體來抑制腫瘤增殖、血管生成、轉(zhuǎn)移來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[6]，而特羅凱導(dǎo)致的皮疹等不良反應(yīng)均高于易瑞沙[7]，所以本實(shí)驗(yàn)將特羅凱定為實(shí)驗(yàn)用藥。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)

參考David Surguladze等[8]在2009年報(bào)道的方法進(jìn)行了模型復(fù)制，2013年4月至2015年1月進(jìn)行了以下動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠20只,5周齡，體重17～23 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司[SCXK(京)2012-0001]。飼養(yǎng)、無菌手術(shù)環(huán)境為中日友好醫(yī)院SPF動(dòng)物房[SYXK(京)2008-0019]。溫度為20～26℃，相對(duì)濕度為50%～60%，并按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.3 藥物和試劑

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物分組

將BALB/c雌性小鼠按隨機(jī)法分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4組，每組5只。

1.4.2 飼養(yǎng)

將特羅凱片用滅菌去離子水配置成10 g/L的溶液，按100 mg/kg對(duì)實(shí)驗(yàn)組(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組)進(jìn)行灌胃，每天1次；對(duì)照組(Ⅰ組)用等體積去離子水按100 mg/kg每天灌胃。

1.4.3 取材

于給藥前24 h 對(duì)每只小鼠頭頸、背、腰等處進(jìn)行脫毛。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組小鼠分別于連續(xù)灌胃21 d、7 d、14 d、21 d后取頸部、背部、腰部等處皮膚。

1.5 主要檢測指標(biāo)

當(dāng)采用集中外售的方式時(shí)，由于需要用車輛進(jìn)行運(yùn)輸，增加了運(yùn)輸成本，且外售需委托有資質(zhì)的固廢處置公司進(jìn)行處理，需交付一定處置費(fèi)用，這無疑給公司帶來了一定的處置成本；當(dāng)采用回爐處理時(shí)，由于砷濾餅含硫較高，會(huì)造成放熱，影響爐溫、渣溫以及煙氣溫度，而且會(huì)使閃速爐的冰銅品位有小范圍的波動(dòng)，與此同時(shí)，回爐處理時(shí)，造成砷的循環(huán)，致使廢酸中砷含量增長較快。

1.5.1 皮膚肉眼改變

實(shí)驗(yàn)開始后每日觀測小鼠日?；顒?dòng)情況及皮毛改變。包括：背部剃毛部位紅腫、皮疹和鼠毛重新生長、鼠毛質(zhì)地等情況；未剃毛部位鼠毛卷曲、脫落等情況。

1.5.2 皮膚病理改變

四組小鼠(共20只)分別取材后，蘇木精-伊紅(HE)染色及油紅O染色觀察頸、肩背、腰部皮膚組織。包括毛囊擴(kuò)張、堵塞，嗜中性膿液簇等情況。

1.5.3 免疫組化檢測Ki67

標(biāo)本經(jīng)4%甲醛溶液固定> 6 h，脫水、石蠟包埋，采用免疫組化法檢測Ki67的表達(dá)。參考Olaussen KA等[9]的方法,根據(jù)染色程度和染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)進(jìn)行評(píng)判。已知陽性的乳腺癌組織切片作為陽性對(duì)照，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。Ki67陽性染色定位于細(xì)胞核，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野的陽性細(xì)胞百分比，以其平均值作為評(píng)定依據(jù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 皮膚肉眼改變

觀察發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組(Ⅰ組)小鼠剃毛后鼠毛生長較快，在2周時(shí)完全恢復(fù)，頸、肩部未出現(xiàn)皮疹。實(shí)驗(yàn)組(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組)小鼠平均第4天見皮膚脫屑，第8天可見背部散在紅色皮疹，第13天皮疹消失，毛發(fā)生長緩慢，3周時(shí)仍未完全恢復(fù)(參見圖1)。與文獻(xiàn)報(bào)道[8，10]相符。四組小鼠在毛發(fā)再生天數(shù)(其中Ⅱ與Ⅳ差異顯著(P < 0.01))、毛發(fā)完全再生天數(shù)(其中Ⅱ與Ⅳ、Ⅲ與Ⅳ P < 0.05)、出現(xiàn)脫屑時(shí)間(其中：Ⅰ與Ⅱ、Ⅰ與Ⅲ P < 0.05)、出現(xiàn)皮疹時(shí)間(其中，Ⅰ與Ⅲ、Ⅰ與Ⅳ P < 0.05)等四個(gè)方面有差異，總體上有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05或P < 0.01)(參見表1)

2.2 皮膚病理改變結(jié)果

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組蘇木精-伊紅(HE)染色可見毛囊周圍中性粒細(xì)胞增多伴堵塞、膿樣嗜中性粒細(xì)胞在毛囊管外面集群所致的毛囊炎癥(參見圖2D、d)。與文獻(xiàn)報(bào)道[8，11，12]相符。

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組油紅O染色可見擴(kuò)張、膨脹的的卵泡明顯增多(參見圖2E、e)。與文獻(xiàn)報(bào)道[8，11，12]相符。毛孔擴(kuò)張數(shù)：四組間有差異，總體上有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01)(其中：Ⅰ與Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ差異顯著 P < 0.01)(參見表2)。

2.3 免疫組化檢測Ki67

Ki67：實(shí)驗(yàn)組Ki67稍高于對(duì)照組[13，14](參見圖2F、f)。四組間無明顯差異，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)(參見表2)。

3 討論

EGFRIs所致皮膚毒性反應(yīng)眾多，其中痤瘡樣皮疹最為常見、嚴(yán)重。其機(jī)制尚未明確，目前相關(guān)研究如下：LacoutureME等[15]認(rèn)為厄洛替尼(特羅凱)所致皮疹病理表現(xiàn)可分成4個(gè)階段：(1)皮紅腫和皮膚敏感性增加；(2)炎性細(xì)胞因子分泌和局部浸潤；(3)T淋巴細(xì)胞增多的丘疹膿皰；(4)硬皮癥。病理表現(xiàn)主要為：(1)表皮炎性細(xì)胞浸潤并包繞過度角化和擴(kuò)張的毛囊管；(2)表皮層化膿性毛囊炎伴上皮細(xì)胞層破裂。LenzHJ等[16]通過皮疹活檢發(fā)現(xiàn)：病理多表現(xiàn)為毛囊周圍炎和化膿性毛囊炎。錢軍等[17]通過對(duì)患者皮膚組織活檢發(fā)現(xiàn) ,EGFRI相關(guān)皮疹表現(xiàn)為真皮上層、卵泡破裂層和上皮棘層松解層的一種混合性炎性反應(yīng)。CunninghamD等[18]認(rèn)為：EGFRI引起基底角質(zhì)細(xì)胞生長停滯和過早成熟分化，并伴有中性粒細(xì)胞的釋放。LacoutureME等[19]認(rèn)為中性粒細(xì)胞釋放的某些酶導(dǎo)致角質(zhì)細(xì)胞凋亡，凋亡的細(xì)胞積聚在真皮下導(dǎo)致皮膚進(jìn)一步的損傷, 最終形成觸痛、丘疹膿皰和甲溝炎。Guttman-YasskyE等[20]在EGFRI患者的皮膚組織中檢測到單核細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞的浸潤，提示EGFRIs相關(guān)的皮疹最終可能與炎癥相關(guān)。

此次實(shí)驗(yàn)用鼠為BALB/c雌性小鼠，主要考慮雄性小鼠之間通常有打斗、抓撓，不易于飼養(yǎng)、管理，且易出現(xiàn)抓痕等難于與皮疹等皮膚不良反應(yīng)相鑒別，而雌性小鼠則較少出現(xiàn)上述現(xiàn)象，故本次實(shí)驗(yàn)暫用雌性小鼠，但我們將在后續(xù)研究中進(jìn)一步比較探究不同性別小鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)組用藥后在表皮出現(xiàn)毛發(fā)生長緩慢甚至脫落、脫屑、紅疹等，在病理上表現(xiàn)為毛囊周圍中性粒細(xì)胞群集伴堵塞而形成的毛囊炎、毛囊擴(kuò)張，且對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組之間在毛發(fā)再生天數(shù)、毛發(fā)完全再生天數(shù)、脫屑時(shí)間、出現(xiàn)皮疹時(shí)間、毛孔擴(kuò)張數(shù)等5方面的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01或P < 0.05)，結(jié)合上述研究，本實(shí)驗(yàn)用濃度為10g/L的特羅凱溶液按100mg/kg對(duì)小鼠灌胃致其出現(xiàn)皮疹等不良反應(yīng)，此模型在表皮組織、病理切片上的表現(xiàn)與DavidSurguladze等的文獻(xiàn)報(bào)道基本相符，且可靠實(shí)用、具有可重復(fù)性，提示“EGFRIs所致皮疹”的動(dòng)物模型建立基本成功，同時(shí)也印證了許多研究者關(guān)于“EGFRIs導(dǎo)致的皮疹為一種炎癥反應(yīng)”的觀點(diǎn)。但四組小鼠在Ki67測試方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。結(jié)合既往研究：

表1 四組小鼠用特羅凱(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組)、去離子水(Ⅰ組)干預(yù)前后毛發(fā)、皮膚變化出現(xiàn)的時(shí)間(±s，n=5)

注：與對(duì)照組(Ⅰ組)相比,*P< 0.05；與實(shí)驗(yàn)組(Ⅳ組)相比：△P< 0.05,■P< 0.01。

Note. Compared with control group(Ⅰ組)，*P< 0.05. Compared with experimental group(Ⅳ組)，△P< 0.05,■P< 0.01.

注：(A)對(duì)照7 d組；(B)對(duì)照12 d組；(C)對(duì)照16 d組；(a)實(shí)驗(yàn)7 d組；(b)實(shí)驗(yàn)12 d組；(c)實(shí)驗(yàn)16 d組圖1 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠在毛發(fā)和皮膚的變化Note.(A)Control group at 7 days.(B)Control group at 12 days.(C)Control group at 16 days.(a)Experimantal group at 7 days.(b)Experimantal group at 12 days.(c)Experimantal group at 16 days.Fig.1 Control group and experimantal group mice′s change in hairs and skins

注：(D)對(duì)照組；(d)實(shí)驗(yàn)組(HE染色,×100)。(E)對(duì)照組；(e)實(shí)驗(yàn)組(油紅O染色，×100)。(F)對(duì)照組；(f)實(shí)驗(yàn)組(免疫組化，×40)。圖2 對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組小鼠皮膚組織在病理切片和免疫組化等方面的變化Note.(D)Control group.(d)Experimantal group ( HE staining，×100).(E)Control group.(e)Experimantal group( Oil Red O staining，×100).(F)Control group.(f)Experimantal group( Immunohistochemical staining，×40).Fig.3 Pathological and immunohistochemical changes of the skin tissue of mice in control group and experimantal group

組別Groups毛囊擴(kuò)張ThenumberofporeexpansionKi67Ⅰ組ⅠGroup220±084025±014Ⅱ組ⅡGroup1940±152#025±061Ⅲ組ⅢGroup2080±148#026±002Ⅳ組ⅣGroup2280±228#026±006

注：與對(duì)照組(Ⅰ組)相比#P< 0.01。

Note. Compared with control group(Ⅰ組)，#P< 0.01.

Mario.E在2006年闡明：基底層中角質(zhì)形成細(xì)胞的EGFR受抑制會(huì)導(dǎo)致生長受限和過早分化，表現(xiàn)為細(xì)胞核相關(guān)抗原(Ki67)下調(diào)。吳萍等[13]的研究也表明：EGFR和Ki67在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中呈協(xié)同作用。正常表皮中Ki67僅在基底層有弱陽性表達(dá)[14]，該指標(biāo)可以反應(yīng)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖是否受到影響。Ki67表達(dá)于所有活躍的細(xì)胞周期階段，并隨細(xì)胞周期改變[21]。Ki67單克隆抗體只標(biāo)記G1后期、S期和G2期、M期細(xì)胞核抗原，且Ki67抗原半衰期短，這些特點(diǎn)使Ki67 成為優(yōu)質(zhì)的細(xì)胞增殖標(biāo)記物[22]。此次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)并未得出特羅凱用藥前后Ki67有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異，可能與樣本量稍小、小鼠取材前剃毛等因素存在相關(guān)性，抑或二者之間本無聯(lián)系，臨床有待進(jìn)一步研究及驗(yàn)證。

隨著靶向藥物在臨床中的應(yīng)用逐漸增多，其導(dǎo)致的皮疹等不良反應(yīng)在臨床中也越發(fā)常見。但目前我們對(duì)特羅凱等靶向藥物所致皮疹的原因、發(fā)病機(jī)制尚未明確，故無有效的、針對(duì)性強(qiáng)的藥物。本文參考國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，復(fù)制TKI類藥物所致的皮疹動(dòng)物模型，并通過觀察小鼠用特羅凱前后在肉眼皮膚、病理切片、免疫組化等方面的改變對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)，進(jìn)一步探討了特羅凱的發(fā)病機(jī)制，為評(píng)價(jià)外用藥、特別是中成藥的有效性及作用機(jī)理提供動(dòng)物模型。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)由中日友好醫(yī)院提供實(shí)驗(yàn)室、資金及設(shè)備，在此向中日友好醫(yī)院表示感謝。并向提供部分資金資助的北京市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)表示感謝。感謝導(dǎo)師崔慧娟教授的悉心指導(dǎo)，感謝鄧博、徐央波、彭艷梅師姐及其他同門在實(shí)驗(yàn)過程中的幫助)

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The establishment of mouse model of Erlotinib-induced skin adverse reactions

SONG Ya-zhong1, XU Yang-bo1, DENG Bo2, CUI Hui-juan2*, PENG Yan-mei1, LIU Dai-wei1, WANG Kai-han1,LIU Fan1,DUAN Hua1,QIU Yu-qin1,LI Qiang1

(1.Beijing University Of Chinese Medicine，Beijing 100029，China；2.China-Japan Friendship Hospital，Beijing 100029，China)

Objective Erlotinib (Trade Name: Tarceva) is a new targeted drug for the treatment of non-small cell lung cancer (NSCLC) that has a wide clinical application in recent years, but commonly carries many side effects, among which the most common and unbearable one is rash. The aim of this study is to observe the changes of epidermis, pathology, immunohistochemistry and other aspects before and after the application of Tarceva in mice and try to copy the rash animal models caused by Tarceva and thus to provide models for the clinical topical medications of rash. Methods 20BALB/c female mice were randomly divided into four groups.The experimental group(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ group) was given 100 mg/kg dosage with the concentration of 10 g/L erlotinib solution by gavage, and the control group (I group)with an equal volume of deionized water by gavage once daily. The hairs from the head,neck and back of each mouse were removed 24 hours prior to the administration,and at the end of the experiment, clipping the skin in the neck, back and waist ,then observed differences between the experimental group and the control group in mice skin, biopsy, immunohistochemistry and the like. Results (1)There were statistically significance (P< 0.01 orP< 0.05) in the four groups of mice in five aspects as hair regrowth days, days of the complete regrowth of hair, desquamation time , the time of appearance of rash and the number of pore expansion；(2)Ki67:There were no statistically significant differences among the four groups(P> 0.05).Conclusions (1)This experiment confirms many researchers’ point of view that “the rash induced by EGFRIs is an inflammatory response”(2)A mouse model of rash induced by FGFRIs is successfully established，and this is a reliable，practical and reproducible model which applies to a large number of establishment of "EGFRIs drug-induced rash in animal models",and can be popularized for clinical,experimental and institutional uses.

Erlotinib；Rash；Skin；Pathology；Immunohistochemistry

中日友好醫(yī)院院內(nèi)課題(2013-MS-42)；北京市科技計(jì)劃首都臨床特色應(yīng)用研究專項(xiàng)(Z151100004015168)。

宋亞中(1989-)，男，碩士研究生，專業(yè)：中西醫(yī)結(jié)合腫瘤內(nèi)科。E-mail：18800100355@163.com

崔慧娟(1963-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合腫瘤內(nèi)科及靶向藥物所致皮疹等不良反應(yīng)。E-mail： cuihj1963@163.com

研究報(bào)告

R-332

A

1671-7856(2017) 01-0016-06

10.3969.j.issn.1671-7856.2017.01.004

2016-06-13