柏子仁總萜類成分藥理活性及提取工藝研究

馬欣悅，李瑞海，賈天柱

·藥學(xué)研究·

柏子仁總萜類成分藥理活性及提取工藝研究

馬欣悅，李瑞海*，賈天柱

目的 探討從柏子仁中提取總萜類成分的最佳工藝及總萜類成分的鎮(zhèn)靜、催眠和耐缺氧作用。方法 以均質(zhì)時間、溫度、料液比和次數(shù)4個因素進行考察，每個因素3個水平，采用L9(34)正交試驗優(yōu)選提取工藝。觀察柏子仁總萜類成分對小鼠自發(fā)活動、戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時間和睡眠個數(shù)及缺氧小鼠存活時間的影響。結(jié)果 以甲醇溶液作為提取溶劑，提取溫度80 ℃，料液比1∶10，均質(zhì)10 min，均質(zhì)提取1次為最佳提取工藝；總萜類成分能抑制小鼠的自發(fā)活動，延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠睡眠時間，增加小鼠睡眠個數(shù)，延長缺氧小鼠的存活時間。結(jié)論 柏子仁總萜類成分具有鎮(zhèn)靜、催眠和耐缺氧作用；提取方法應(yīng)用均質(zhì)法操作簡單、效率高，適用于柏子仁總萜類成分的提取。

柏子仁；總萜類化合物；均質(zhì)；鎮(zhèn)靜催眠；藥理作用

0 引言

柏子仁為柏科綠喬木植物側(cè)柏的種仁，為常用中藥。柏子仁味甘，性平，歸心、腎、大腸經(jīng)，有養(yǎng)心安神、斂汗、潤腸通便之功[1]。其應(yīng)用歷史悠久，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，《本草綱目》記載：“養(yǎng)心氣，潤腎燥，安魂定，益智寧神”，用于驚悸怔忡，失眠健忘，盜汗，腸燥便秘[2]。近年來研究者應(yīng)用均質(zhì)提取法對植物組織中的萜烯醇、黃酮類物質(zhì)進行提取，收到了很好的效果。均質(zhì)提取法提取速度快，溫度低，能耗低，目的成分得率高，在中藥成分應(yīng)用的報道很少。目前，柏子仁中總萜類成分的藥理活性尚沒有全面的報道，因而本研究通過觀察柏子仁總萜類成分對小鼠自發(fā)活動、戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時間和睡眠個數(shù)以及缺氧小鼠存活時間的影響，研究柏子仁總萜類成分的鎮(zhèn)靜、催眠和耐缺氧作用，為其臨床應(yīng)用提供藥效學(xué)基礎(chǔ)。因此，對于柏子仁總萜類成分的提取方法和藥理活性的研究具有一定價值。

1 材料

1.1 動物 昆明小鼠，雌雄各半，體重18～21 g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司。

1.2 藥品與試劑 柏子仁總萜類成分提取物(柏子仁總萜類成分含量90%，實驗室自制)；柏子仁二萜對照品(含量99.5%，實驗室自制)，陽性藥物組(安神補腦液，吉林敖東延邊藥業(yè)股份有限公司，批號：201508412)；戊巴比妥鈉、甲醇、亞硝酸鈉均為分析純。

1.3 儀器 分光光度計(日本日立)；UV Solutions2.1工作站；ESB-500高剪切均質(zhì)乳化機(上海易勒機電實驗室)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(榮華儀器制造有限公司)；超聲波提取器(奧特賽恩斯儀器有限公司)；0.000 01 g電子天平(SARTORIUS CP225D)。

2 方法與結(jié)果

2.1 柏子仁總萜類成分檢測分析方法的建立[3-4]

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取柏子仁二萜標(biāo)準(zhǔn)品12.00 mg，置于100 mL的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 取樣品，濾過，取續(xù)濾液1 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，備用。

2.1.3 測定方法 精密量取上述供試品溶液0.5 mL，分別置于10 mL的具塞三角瓶中，水浴揮干，各加現(xiàn)配制的高氯酸0.8 mL和冰乙酸5%香草醛溶液0.2 mL，搖勻，60 ℃水浴15 min后，取出轉(zhuǎn)置冰水浴，5 min后精密加入5 mL的冰醋酸，搖勻，靜置10 min，以不加柏子仁二萜對照品的隨行試劑作為空白，在560 nm波長處測定吸光度，以柏子仁二萜作為對照品，按回歸方程計算總萜含量。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取“2.1.1”項下對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別置于10 mL具塞三角瓶中，水浴揮干溶劑，按“2.1.3”項下的方法顯色并測定吸光度，以柏子仁二萜的濃度(C，mg/mL)作為橫坐標(biāo)，吸收度(A)作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：A=28.33 C-0.264，結(jié)果顯示，以柏子仁二萜為對照的總二萜濃度在0.000 6～0.03 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2 常見提取方法的比較[5-7]分別稱取4份5 g的柏子仁粉末置于4個錐形瓶中，加甲醇溶液15 mL，分別以超聲微波、回流、均質(zhì)提取法按“2.1.3”項測定，按“2.1.4”項標(biāo)準(zhǔn)曲線測定樣品含量。見表1。

表1 常見提取方法的比較(%)

2.3 正交試驗優(yōu)選[5-7]以均質(zhì)時間、溫度、料液比和次數(shù)4個因素進行考察，每個因素3個水平，采用L9(34)正交試驗優(yōu)選提取工藝。因素水平見表2。以柏子仁二萜成分為指標(biāo)，對柏子仁總萜類含量進行評價，進行提取工藝條件優(yōu)選。正交試驗結(jié)果見表3。方差分析見表4。

表2 柏子仁總萜類成分提取工藝優(yōu)選正交試驗因素水平

由R值可知，各因素對總萜類成分提取的影響大小順序為A>D>C>B；方差分析結(jié)果A因素均質(zhì)時間具有顯著影響。最后確定提取工藝為A2B2C1D1，即均質(zhì)時間10 min，溫度80 ℃，料液比1∶10，提取1次。

表3 柏子仁總萜類成分提取工藝優(yōu)選正交試驗

表4 方差分析結(jié)果

注：F0.05(2.2)=19.00

2.4 重復(fù)性實驗 按優(yōu)選的提取工藝提取3批柏子仁總萜，測定其含量，結(jié)果為5.99%±0.2% (n=3)。

2.5 柏子仁總萜類成分對小鼠自發(fā)活動的影響[8]將50只小鼠按給藥不同(雌雄各半)隨機分5組：空白組，陽性組(5 μL/g)，柏子仁總萜類成分3個劑量組(0.4、0.8、1.6 mg/g)。各組小鼠灌胃給藥，共7 d，灌胃前將小鼠投入木箱中適應(yīng)20 min，記錄2 min內(nèi)行動累積時間及前肢離地次數(shù)，最后1次用藥后1 h按同法測定小鼠2 min內(nèi)的活動數(shù)值，見表5。

2.6 柏子仁總萜類成分對藥物誘導(dǎo)小鼠睡眠時間的影響[9]取50只小鼠，分組及給藥方法同“2.5”，最后1次給藥后1 h，繼續(xù)給藥戊巴比妥鈉50 μg/g，記錄小鼠翻正反射消失前的持續(xù)時間，見表6。

表5 柏子仁總萜類成分對小鼠活動的影響

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01

表6 柏子仁總萜類成分對戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時間的影響

注：與空白組比較，**P<0.01

2.7 柏子仁總萜類成分對藥物誘導(dǎo)小鼠睡眠的影響[10]取70只小鼠，分組及給藥方法同“2.5”，最后1次給藥后1 h，繼續(xù)給藥戊巴比妥鈉30 μg/g，觀察翻正反射消失1 min及以上的小鼠只數(shù)。

2.8 柏子仁總萜類成分對張口持續(xù)時間的影響[11]取50只小鼠，分組及給藥方法同“2.5”，最后1次給藥后1 h，依次用大剪刀在小鼠雙耳連線處快速斷頭，并立即用秒表記錄斷頭小鼠的張口動作持續(xù)時間，見表7。

表7 柏子仁總萜類成分的耐缺氧作用

注：與空白組比較，**P<0.01

2.9 柏子仁總萜類成分對NaNO2中毒性小鼠存活時間的影響[11]取50只小鼠，分組及給藥方法同“2.5”，最后1次給藥后1 h，繼續(xù)給藥NaNO2800 μg/g，并立即記錄小鼠存活時間，見表7。

3 討論

3.1 預(yù)試驗中首先對提取溶劑進行選擇 經(jīng)比較，在甲醇、乙醇和乙酸乙酯等溶劑中，以甲醇含量最高，最后確定其為提取溶劑。預(yù)試驗中發(fā)現(xiàn)，均質(zhì)提取時間長，提取完全，但超過10 min后，沒有明顯變化。料液比對于提取有很大影響，預(yù)試驗中發(fā)現(xiàn)，料液比1∶40時，含量不再增加。最后確定，均質(zhì)時間、溫度、料液比和次數(shù)4個因素，每個因素3個水平進行考察。

3.2 由表4的R值可知，各因素對總萜類成分提取的影響大小順序為A>D>C>B；以R值最小的B溫度為誤差項進行方差分析，結(jié)果A因素均質(zhì)時間對總萜類成分提取具有顯著影響，但同時也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)達到2水平的時候，含量不再增加，最后確定選擇2水平。由于溫度、料液比、次數(shù)均不是影響實驗的主要因素，因此可選擇利于生產(chǎn)的水平，溫度選擇2水平，80 ℃，而料液比高、提取次數(shù)多則會增加溶劑量，對于后續(xù)的濃縮等操作帶來很大的負擔(dān)，而且會使工藝更加繁瑣。故確定提取工藝為A2B2C1D1，即均質(zhì)時間10 min，溫度80 ℃，料液比1∶10，提取1次。

3.3 由表1可知，超聲提取、回流提取和均質(zhì)提取法的含量較高。微波提取法提取成分的含量較低。但有研究顯示，微波提取這一新興提取方法具有很多的優(yōu)勢及發(fā)展前途，本實驗結(jié)果較低，可能是由于使用家用微波爐，對于功率、加熱時間等參數(shù)都無法進行精確調(diào)節(jié)，可能造成提取含量較低。超聲提取、回流提取和均質(zhì)提取中，均質(zhì)提取具有優(yōu)勢，主要表現(xiàn)在，和其他兩種方法相比，其操作簡單；與回流需要長時間加熱不同，均質(zhì)提取不會破壞熱敏性成分，同時能源消耗量較小。與超聲提取法相比，均質(zhì)提取減少了粉碎的環(huán)節(jié)而且提取時間較短，提取率較高。

3.4 本研究結(jié)果表明，與空白組比較，柏子仁總萜類成分3個劑量組(0.4、0.8、1.6 mg/g) 2 min內(nèi)小鼠行動累積時間和前肢離地次數(shù)不同程度減少，睡眠時間、斷頭小鼠張口持續(xù)時間不同程度延長；與空白組比較，柏子仁總萜類成分中、大劑量組(0.8、1.6 mg/g)使小鼠入睡只數(shù)增加，NaNO2中毒小鼠存活時間不同程度延長。

3.5 藥理實驗結(jié)果表明，柏子仁中總萜類成分具有良好的鎮(zhèn)靜催眠和耐缺氧等活性作用，但試驗過程中，小鼠的自主性活動有明顯的個體差異，不能用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)判定是否符合標(biāo)準(zhǔn)，如：上肢舉起的高度和幅度等，應(yīng)在小鼠適應(yīng)行動箱時注意其活動幅度和上肢舉起高度，如有特殊情況及時標(biāo)記，在正式實驗時多加注意。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005.

[2] 張民慶.現(xiàn)代臨床中藥學(xué)[M].上海:上海中醫(yī)藥大學(xué)出版社,2002:733.

[3] 李瑞海.脂肪油和總二萜含量與柏子仁質(zhì)量的相關(guān)性分析[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2015,21(12):9-11.

[4] 申樞,紀(jì)思宇,李瑞海.不同產(chǎn)地柏子仁中氨基酸成分比較分析[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2014,20(9):125-128.

[5] 王艷,張鐵軍.微波萃取技術(shù)在中藥有效成分提取中的應(yīng)用[J].中草藥,2005,36(3):470-473.

[6] 陳國鈞.超聲技術(shù)在中草藥有效成分提取中的應(yīng)用[J].機電信息,2005,18(102):56-58.

[7] 范本雋,張志森.高壓均質(zhì)機超細粉碎機理探討[J].華東理工大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2004,30(1):96-98.

[8] 葛會奇,賈天柱.五味子炮制品鎮(zhèn)靜催眠作用研究[J].遼寧中醫(yī)雜志,2007,34(5):636-637.

[9] 肖韋坐,劉宗林,李智欣,等.柏子仁中改善睡眠有效成分的研究[J].食品科學(xué),2007,28(7):475-477.

[10]孫付軍.柏子仁皂苷和柏子仁油改善睡眠作用的研究[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2010,5(5):394-395.

[11]王宇翎.養(yǎng)心安神顆粒的鎮(zhèn)靜、催眠和耐缺氧作用[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2003,38(2):118-119.

Research on pharmacological activity and extracting process of total terpenoids inplatycladiseed

MA Xin-yue,LI Rui-hai*,JIA Tian-zhu

(College of Pharmacy,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,China)

Objective To determine the best technology of extracting total terpenoid components fromplatycladiseedand explore the sedative,hypnotic and hypoxia effect of total terpenoid components.Methods The process of extraction was optimized by L9(34) orthogonal experiment with homogeneous time,temperature,liquid ratio and the times of extraction as factors,three levels in each factor.The effects of total terpenoid components on spontaneous activity of mice,the sleeping time and the number of the sleeping in mice induced by pentobarbital sodium and the survival time of hypoxia mice were observed.Results The best extracting process was as follows:methanol was used as the extraction solvent,extraction temperature was at 80 ℃,material liquid ratio was 1∶10,homogeneous for 10 min,and homogeneous extraction was 1 time.Total terpenoid components could inhibit the spontaneous activity of mice and prolong the sleeping time of mice induced by pentobarbital sodium,increase the number of sleeping mice,and prolong the survival time of mice with hypoxia.Conclusion Total terpenoids components inplatycladiseedhare sedative,hypnotic and hypoxia effect.Homogeneous measure used in the extraction method is simple,efficient and suitable for the extraction of total terpenoid components inplatycladiseed.

Platycladiseed;Total terpenoids;Homogeneous;Sedative hypnotic;Pharmacological effect

2016-05-13

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，大連 116600

國家藥典委員會，國家藥品標(biāo)準(zhǔn)科研項目(201203)

10.14053/j.cnki.ppcr.201701019

*通信作者