正常人皮膚活檢汗腺神經(jīng)纖維的分布規(guī)律及特點(diǎn)

李 穎 魏云霄 陳龍劍 凌 麗 趙紅杰 譚海波 路 輝

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 保定 071000)

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正常人皮膚活檢汗腺神經(jīng)纖維的分布規(guī)律及特點(diǎn)

李 穎1魏云霄1陳龍劍1凌 麗 趙紅杰2譚海波2路 輝3

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 保定 071000)

目的 探討正常人汗腺神經(jīng)纖維分布的數(shù)量和形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，尋找汗腺神經(jīng)纖維密度的分布規(guī)律。方法 收集不同解剖部位、年齡和性別的健康成年人皮膚標(biāo)本192例，將其分為6個(gè)解剖部位、4個(gè)年齡組，均男女各半，通過(guò)皮膚活檢結(jié)合組化技術(shù)觀察汗腺神經(jīng)纖維的數(shù)量和形態(tài)學(xué)。結(jié)果 年齡對(duì)汗腺神經(jīng)纖維密度有較大影響；在排除年齡因素影響的情況下，不同性別對(duì)汗腺神經(jīng)纖維密度也有明顯影響。隨肢體取材部位的由近及遠(yuǎn)汗腺神經(jīng)纖維密度表現(xiàn)為逐漸遞減的趨勢(shì)，體現(xiàn)了神經(jīng)軸突“長(zhǎng)度依賴(lài)性”的特點(diǎn)，這種特點(diǎn)在上肢體現(xiàn)地更為明顯。結(jié)論 汗腺神經(jīng)纖維分布規(guī)律特點(diǎn)能為臨床判斷周?chē)窠?jīng)損傷起到更好地促進(jìn)和參考作用。

皮膚活檢；汗腺神經(jīng)纖維；膽堿酯酶染色

皮膚中具有豐富的神經(jīng)纖維，它們是周?chē)窠?jīng)的末梢部分，很多周?chē)窠?jīng)損傷的早期都會(huì)在皮膚神經(jīng)纖維中出現(xiàn)形態(tài)和數(shù)量的異常，其中自主神經(jīng)損傷在很大程度上反映了周?chē)窠?jīng)損傷的情況，其主要表現(xiàn)為皮膚色澤、溫度、出汗異常等，出汗功能作為評(píng)價(jià)自主神經(jīng)功能的指標(biāo)，能夠反映自主神經(jīng)損傷及再生的程度，但目前常用地出汗檢查方法如交感皮膚反應(yīng)、淀粉碘試驗(yàn)等由于尚欠細(xì)致和客觀，因此不能進(jìn)行精確的定量和評(píng)價(jià)〔1〕。研究證實(shí)，支配汗腺的自主神經(jīng)纖維為膽堿能神經(jīng)纖維〔2，3〕，當(dāng)前膽堿酯酶染色常用來(lái)觀察心肌、胰腺、肌肉等組織的自主神經(jīng)變化，尚無(wú)應(yīng)用此方法對(duì)支配汗腺的自主神經(jīng)纖維進(jìn)行評(píng)估的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首次應(yīng)用膽堿酯酶染色進(jìn)行汗腺支配神經(jīng)纖維的定量和形態(tài)學(xué)觀察，以對(duì)汗腺神經(jīng)纖維密度進(jìn)行初步的探索，為臨床評(píng)價(jià)自主神經(jīng)損傷提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 共收集正常人皮膚標(biāo)本192例，標(biāo)本來(lái)源于2009年5月至2013年7月河北大學(xué)附屬醫(yī)院骨科手術(shù)的患者以及神經(jīng)內(nèi)科接受皮膚活檢的受試者，經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)、受試者知情同意，收集其臨床資料。所有受試者均接受神經(jīng)系統(tǒng)檢查(包括膝、跟腱反射，拇指遠(yuǎn)端針刺感、震動(dòng)覺(jué)和精細(xì)觸覺(jué))，除外神經(jīng)疾病史、糖尿病史、過(guò)量飲酒史(指每周飲酒量男性超過(guò)21個(gè)單位、女性超過(guò)14個(gè)單位，一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單位約含8 g乙醇，相當(dāng)于250 ml正常強(qiáng)度的啤酒，一小杯的葡萄酒或一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)分量的烈酒)和神經(jīng)毒性藥物服用史及其他可能的神經(jīng)病變危險(xiǎn)因素接觸史。

1.2 分組 分別按照年齡、性別及解剖部位進(jìn)行分組，收集標(biāo)本時(shí)性別分組已經(jīng)考慮在其他兩種分組之中：①按年齡分組：以20歲為一個(gè)年齡段進(jìn)行分組，分別為≤20歲，21～40歲，41～60歲，≥61歲，每組48例，男女各半。(2)按解剖部位分組：手背，前臂(前臂遠(yuǎn)端)，上臂(上臂遠(yuǎn)端)，足背，小腿(小腿遠(yuǎn)端)，大腿(大腿近端)，每組32例，男女各半。

1.3 主要試劑 碘化乙酰硫代膽堿、多聚賴(lài)氨酸(Sigma公司)，醋酸鈉、醋酸、硫酸銅、檸檬酸鈉、鐵氰化鉀、丙酮、蔗糖、磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)，多聚甲醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，飽和苦味酸、梯度酒精、二甲苯、中性樹(shù)脂(我院中心實(shí)驗(yàn)室)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)本獲取 (1)骨科手術(shù)的患者：于術(shù)中將含有全層皮膚及皮下組織的皮膚標(biāo)本取下后修整為直徑約3 mm的組織塊，并立即投入Zamboni固定液中常規(guī)固定。(2)皮膚活檢的受試者：患者仰臥位，充分暴露活檢部位，常規(guī)消毒皮膚，戴無(wú)菌手套，鋪無(wú)菌洞巾，2%利多卡因局部麻醉，在擬取材處行長(zhǎng)約1 cm的縱行切口，鈍性分離皮下組織，留取0.3 cm×1 cm大小的全層皮膚組織，并立即投入Zamboni固定液中常規(guī)固定。切口徹底止血，清點(diǎn)器械，敷料，關(guān)閉切口，再次酒精消毒，無(wú)菌紗布覆蓋，膠布加壓固定。術(shù)后給予抗感染，止痛等對(duì)癥治療。

1.4.2 標(biāo)本處理 Zamboni固定液中常規(guī)固定16～24 h，之后將標(biāo)本放入20%蔗糖溶液中過(guò)夜，直到標(biāo)本沉至容器底部為止，將標(biāo)本放入-70℃低溫冰箱中(裝入封口塑料袋內(nèi)密封)保存?zhèn)溆谩Ｈ旧?，將凍結(jié)標(biāo)本放入恒冷冰凍切片機(jī)內(nèi)進(jìn)行垂直于皮膚表面的連續(xù)切片，用OCT包埋劑將標(biāo)本固定在金屬栓上，-20℃下恒冷切片機(jī)內(nèi)放置片刻后，即可牢固的固定載有皮膚標(biāo)本的金屬栓于金屬卡盤(pán)上。將切片機(jī)設(shè)定在切片厚度為15 μm的狀態(tài)下，連續(xù)切片。

1.4.3 HE染色 (1)將切片放入蘇木精染液7～10 min；(2)自來(lái)水沖洗3～5 min；(3)1%鹽酸酒精分化5～10 s；(4)自來(lái)水沖洗1～5 min；(5)弱氨水返藍(lán)0.5～1 min；(6)自來(lái)水沖洗5～10 min；(7)鏡檢著色程度；(8)0.5%水溶性伊紅染液5～10 min；(9)蒸餾水洗數(shù)秒鐘；(10)逐級(jí)酒精脫水：70%、80%、95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ；(11)二甲苯透明兩次；(12)中性樹(shù)膠封固。

1.4.4 膽堿酯酶組織化學(xué)染色 采用改良Karnovsky-Root染色法〔4〕進(jìn)行膽堿酯酶染色。陰性對(duì)照：孵育液中不加碘化乙酰硫代膽堿。陽(yáng)性結(jié)果：膽堿酯酶活性部位呈棕紅色或棕黃色。

1.5 觀察指標(biāo) (1)汗腺及其支配神經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察：鏡下觀察各切片汗腺及神經(jīng)纖維著色情況，在光學(xué)顯微鏡下對(duì)染色切片進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。(2)汗腺支配神經(jīng)纖維密度定量〔5,6〕分析：400×光學(xué)顯微鏡下觀察膽堿能神經(jīng)著色情況，每個(gè)活檢標(biāo)本至少有3張切片參加定量，每張切片隨機(jī)選取3～5個(gè)具有汗腺分布的視野進(jìn)行觀察，使用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件根據(jù)陽(yáng)性神經(jīng)纖維與背景的灰度差異，對(duì)圍繞汗腺的膽堿能神經(jīng)纖維進(jìn)行鑒別和定量，結(jié)果以陽(yáng)性神經(jīng)纖維的面積占汗腺管(包括神經(jīng)纖維)所占總面積的比率表示，并以百分比表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.0軟件行單因素方差分析(ANOVA)、q檢驗(yàn)、u檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 正常人汗腺組織HE染色形態(tài)學(xué)特點(diǎn) 在光學(xué)顯微鏡下，可清晰地看到淡紅色的外泌汗腺分泌部結(jié)構(gòu)，由單層椎體細(xì)胞構(gòu)成，為單曲管狀，管狀腺體盤(pán)旋呈不規(guī)則球形，多位于真皮和皮下組織交界處，見(jiàn)圖1。

2.2 正常人汗腺及其支配神經(jīng)纖維膽堿酯酶染色形態(tài)學(xué)特點(diǎn) 膽堿酯酶染色后的切片經(jīng)過(guò)蘇木素復(fù)染，汗腺組織呈現(xiàn)藍(lán)紫色，為盤(pán)旋狀不規(guī)則球形，支配汗腺的膽堿能神經(jīng)纖維呈棕色，以環(huán)形密集地纏繞分布在汗腺小管周?chē)?，排列及分布均勻不等，有的可呈團(tuán)簇狀分布，有的分布稀疏，甚至汗腺小管周?chē)鸁o(wú)明顯著色，排列不規(guī)則，密度不均勻，見(jiàn)圖2。

圖1 汗腺組織 HE染色(×400)

男67歲，小腿

女 17歲，上臂

2.3 汗腺神經(jīng)纖維密度定量結(jié)果 不同解剖部位之間的比較：汗腺神經(jīng)纖維密度在不同解剖部位之間存在差異(P<0.05)，上臂與前臂之間、前臂與手背之間、大腿與小腿之間差異顯著、前臂與小腿之間、上臂與大腿之間差異顯著(P<0.01)，小腿與足背之間、前臂與大腿之間、小腿與手背之間、手背與足背之間兩兩比較無(wú)差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。不同年齡之間的比較：≤20歲組與21～40歲組之間、21～40歲組與41～60歲組之間、21～40歲組與≥61歲組之間兩兩比較差異顯著(均P<0.01)；而≤20歲組與41～60歲組之間、41～60歲組與≥61歲組之間、≤20歲組與≥61歲組之間兩兩比較無(wú)差異(均P>0.05)，見(jiàn)表2。不同性別之間的比較：在排除年齡因素影響的情況下，不同性別對(duì)汗腺神經(jīng)纖維密度有明顯影響，男性明顯高于女性(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表1 不同解剖部位汗腺神經(jīng)纖維密度定量結(jié)果±s，n=32)

與小腿組比較：1)P<0.05；與前臂組比較：2)P<0.05；與大腿組比較：3)P<0.05

表2 不同年齡組汗腺神經(jīng)纖維密度定量結(jié)果±s，n=48)

與21～40歲組比較：1)P<0.05

表3 不同性別汗腺神經(jīng)纖維密度定量比較結(jié)果±s，n=96)

3 討 論

自主神經(jīng)是完整神經(jīng)系統(tǒng)的有機(jī)組成部分之一，自主神經(jīng)功能檢查對(duì)評(píng)價(jià)周?chē)窠?jīng)損傷和修復(fù)是不可缺少的，其分布到皮膚上的纖維與感覺(jué)纖維分布相同，感覺(jué)消失區(qū)與無(wú)汗區(qū)相符合。周?chē)窠?jīng)損傷后感覺(jué)喪失區(qū)內(nèi)的皮膚干燥無(wú)汗，隨著神經(jīng)的再生，出汗逐漸增多。因此檢查出汗功能，對(duì)判斷周?chē)窠?jīng)損傷及再生的程度具有重要的指導(dǎo)意義〔1,7〕。

目前臨床中檢查汗腺功能的方法，最簡(jiǎn)單的方法就是用手指觸摸皮膚，局部有濕潤(rùn)感表示有汗，也可用放大鏡觀察有無(wú)細(xì)小的汗點(diǎn)，也可用淀粉碘試驗(yàn)，即在檢查部位涂1.5%碘酊，干燥后撒上淀粉，然后用紅外線(xiàn)燈烘烤，如出現(xiàn)藍(lán)色，表示有出汗功能。但上述方法均較粗糙，無(wú)法進(jìn)行定量評(píng)價(jià)。

關(guān)于泌汗功能的檢查還包括泌汗軸突反射定量試驗(yàn)、溫控排汗試驗(yàn)、交感皮膚試驗(yàn)等，但上述診斷方法，大多由于其本身較為復(fù)雜、方法操作繁瑣、設(shè)備昂貴不易實(shí)施，或受周?chē)h(huán)境、溫度影響，難以客觀定量等，使臨床診斷和應(yīng)用受到限制〔8〕。

已經(jīng)有多位學(xué)者研究表明〔9～14〕，汗腺神經(jīng)纖維密度與出汗功能有明顯的相關(guān)性，且對(duì)周?chē)窠?jīng)特別是自主神經(jīng)纖維損傷起到了一定的參考作用，因此我們采用改良Karnovsky-Root染色法進(jìn)行膽堿酯酶染色，觀察支配汗腺的膽堿能神經(jīng)纖維的分布特點(diǎn)和規(guī)律。

我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不同解剖部位之間,上臂、前臂、手背和大腿、小腿、足背的汗腺神經(jīng)纖維密度均存在隨肢體取材部位的由近及遠(yuǎn)表現(xiàn)為一個(gè)逐漸遞減的趨勢(shì)，而前者表現(xiàn)的更為明顯，另外，上臂的汗腺神經(jīng)纖維密度在所有的解剖部位中是最高的，甚至高于大腿組很多。同時(shí)，汗腺神經(jīng)纖維密度在不同解剖部位的分布差異較緩，且數(shù)值變化趨勢(shì)趨于平穩(wěn)。我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)隨著身體解剖部位的不同，泌汗小管的結(jié)構(gòu)、泌汗神經(jīng)的支配模式或者免疫反應(yīng)性有所改變的證據(jù)，對(duì)于每個(gè)小管面積中軸突的密度全身各處是否一致也沒(méi)有進(jìn)行系統(tǒng)的觀察和研究。在不同年齡之間的比較顯示,年齡對(duì)汗腺神經(jīng)纖維密度有較大影響，不同年齡組之間有明顯區(qū)別，而且隨著年齡增長(zhǎng)，汗腺神經(jīng)纖維密度有回升的趨勢(shì)，密度的最高值集中在≤20歲組和≥61歲組。因此可以看出，年齡對(duì)汗腺神經(jīng)纖維密度的影響有隨著年齡增長(zhǎng)的趨勢(shì)。與此同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)不同年齡組汗腺神經(jīng)纖維密度分布，汗腺神經(jīng)纖維密度與年齡之間沒(méi)有形成直線(xiàn)回歸與直線(xiàn)相關(guān)的關(guān)系，也就是說(shuō)隨著年齡的逐漸增長(zhǎng)，汗腺神經(jīng)纖維密度沒(méi)有出現(xiàn)明顯的增高或降低的變化趨勢(shì)，年齡對(duì)其影響比較復(fù)雜。

由于自主神經(jīng)的結(jié)構(gòu)、功能比較復(fù)雜，目前對(duì)其研究尚欠細(xì)致和全面，因此仍無(wú)精確的定量評(píng)價(jià)方法〔1〕。本實(shí)驗(yàn)首次采用皮膚神經(jīng)活檢結(jié)合膽堿酯酶染色的方法對(duì)皮膚汗腺的神經(jīng)支配情況進(jìn)行病理學(xué)觀察，從形態(tài)學(xué)和分布數(shù)量上進(jìn)行探索研究，該方法具有操作簡(jiǎn)單、能夠定量分析和形態(tài)學(xué)觀察、能夠排除其他人為、環(huán)境等干擾因素、方法客觀的特點(diǎn)〔15〕，同時(shí)作為一種研究膽堿能神經(jīng)的方法，它還能夠反映自主神經(jīng)的病理變化，彌補(bǔ)目前臨床研究的不足。

1 沈?qū)幗?朱家愷.自主神經(jīng)功能評(píng)價(jià)在周?chē)窠?jīng)損傷和修復(fù)中的臨床應(yīng)用〔J〕.中華顯微外科雜志,1994;17(3):178-9.

2 李伯塤.現(xiàn)代實(shí)用皮膚病學(xué)〔M〕.西安:世界圖書(shū)出版公司,2007:1,4.

3 王德昌,傅洪濱,王一兵.人體皮膚組織學(xué)彩色圖譜〔M〕.濟(jì)南:山東科學(xué)技術(shù)出版社,1999：11.

4 顧立強(qiáng),裴國(guó)獻(xiàn).周?chē)窠?jīng)損傷基礎(chǔ)與臨床〔M〕.北京:人民軍醫(yī)出版社,2001:24.

5 Sommer C,Lindenlaub T,Zillikens D,etal.Selective loss of cholinergic sudomotor fibers causes anhidrosis in Ross syndrome〔J〕.Ann Neurol,2002;52(1):247-50.

6 Swartling C,Naver H,Pihl-Lundin I,etal.Sweat gland morphology and periglandular innervation in essential palmar hyperhidrosis before and after treatment with intradermal botulinum toxin〔J〕.J Am Acad Dermatol,2004;51(5):739-45.

7 Ishibashi F,Kojima R,Kawasaki A,etal.Correlation between sudomotor function,sweat gland duct size and corneal nerve fiber pathology in patients with type 2 diabetes mellitus〔J〕.J Diabet Invest,2014;5(5):588-96.

8 夏 婷,李雙慶.糖尿病自主神經(jīng)病變〔J〕.華西醫(yī)學(xué),2004;19(3):525-6.

9 Perretti A,Nolano M,De Joanna G,etal.Is Ross syndrome a dysautonomic disorder only? An electrophysiologic and histologic study〔J〕.Clin Neurophysiol,2003;114(1):7-16.

10 Lauria G，Hsieh ST，Johansson O,etal.European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy〔J〕.J Periph Nerv Sys,2010;15(2):79-92.

11 Sohna E,Gibbonsb CH,Wangb N,etal.Quantitative analysis of human cutaneous vasomotor innervation〔J〕.Autonom Neurosci,2015;192(1):114.

12 Gordon SA,Lessard M,Reyna S,etal.The diagnostic utility of Sudoscan for distal symmetric peripheral neuropathy〔J〕.J Diabet Complica,2014;28(4):511-6.

13 Luo KL,Chao CC,Hsieh PC,etal.Effect of glycemic control on sudomotor denervation in type 2 diabetes〔J〕.Diabet Care,2012;35(3):612-6.

14 Liu Y,Billiet J,Ebenezer GJ,etal.Factors influencing sweat gland innervation in diabetes〔J〕.Neurology,2015;84(16):1652-9.

15 Kafaie J,Kim M,Krause E.Small fiber neuropathy following vaccination〔J〕.J Clin Neuromuscul Dis,2016;18(1):37-40.

〔2015-11-19修回〕

(編輯 李相軍)

河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(H2013201255)；河北省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(152777187)

凌 麗(1980-)，女，博士，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事周?chē)窠?jīng)損傷的研究。

李 穎(1982-)，女，主治醫(yī)師，主要從事周?chē)窠?jīng)損傷研究。

R745.4

A

1005-9202(2017)02-0433-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.079

1 河北大學(xué)研究生院 2 河北省望都縣醫(yī)院

3 保定市清苑區(qū)人民醫(yī)院