原發(fā)性血小板增多癥患者治療中出現(xiàn)慢性粒細(xì)胞白血病1例

劉景華 周 凡 劉 洋 張曉琳 李敏燕 劉彥琴 王吉?jiǎng)?白 穎

(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院，遼寧 沈陽 110016)

原發(fā)性血小板增多癥患者治療中出現(xiàn)慢性粒細(xì)胞白血病1例

劉景華 周 凡 劉 洋 張曉琳 李敏燕 劉彥琴 王吉?jiǎng)?白 穎

(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院，遼寧 沈陽 110016)

目的 認(rèn)識(shí)Ph1陰性原發(fā)性血小板增多癥在病程中向BCR-ABL1陽性慢性粒細(xì)胞白血病的轉(zhuǎn)變。方法 密切監(jiān)測(cè)患者骨髓巨核細(xì)胞的形態(tài)、BCR/ABL P210融合基因轉(zhuǎn)錄水平、FISH法Ph1染色體、JAK2基因V617F突變。結(jié)果 初診時(shí)患者骨髓巨核細(xì)胞胞體大、多分葉核，BCR/ABL P210融合基因陰性，Ph1染色體陰性，JAK2基因?yàn)橐吧停?3個(gè)月后患者骨髓巨核細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)為單圓核小巨核細(xì)胞，BCR/ ABL P210融合基因轉(zhuǎn)為陽性，Ph1染色體轉(zhuǎn)為陽性，JAK2基因仍為野生型。結(jié)論 該患者由Ph1陰性原發(fā)性血小板增多癥在治療過程中轉(zhuǎn)為BCR-ABL1陽性慢性粒細(xì)胞白血病。

原發(fā)性血小板增多癥；慢性粒細(xì)胞白血病

骨髓增殖性腫瘤(MPN)是克隆性造血干細(xì)胞疾病，分為BCR-ABL陽性慢性髓細(xì)胞白血病(CML)和BCR-ABL陰性MPN，后者包括原發(fā)性血小板增多癥(ET)，真性紅細(xì)胞增多癥(PV)和原發(fā)性骨髓纖維化(PMF)。雖然CML和ET在初期的臨床表現(xiàn)和臨床過程上是明顯不同的，但一些CML和ET病例有重疊的臨床特點(diǎn)，可能會(huì)出現(xiàn)ET和CML的共存〔1〕，也可能會(huì)出現(xiàn)ET和CML的交替〔2〕?，F(xiàn)將1例ET轉(zhuǎn)化為CML的病例報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 患者，女，72歲，因反復(fù)心前區(qū)疼痛于2011年1月4日首次就診我科，于2010年10月末情緒激動(dòng)后出現(xiàn)心前區(qū)陣發(fā)性疼痛，持續(xù)2～3 s，服用速效救心丸后，癥狀瞬間緩解。于11月25日精神受打擊后突發(fā)耳鳴，聽力下降，同時(shí)伴有咽痛，就診于某醫(yī)院耳鼻喉科，行血液分析檢查白細(xì)胞13.8×109/L，血紅蛋白131 g/L，血小板541×109/L，肺炎支原體抗體：1∶640，給予左氧氟沙星，長(zhǎng)春西汀等對(duì)癥治療，聽力逐漸恢復(fù)。此期間多次復(fù)查血液分析白細(xì)胞及血小板均高，白細(xì)胞最高達(dá)25×109/L，最低降至13.8×109/L。11月29日心前區(qū)疼痛加重，再次就診某醫(yī)院干診科，24 h動(dòng)態(tài)心電圖提示：房性期前收縮、短陣房速；心臟彩超提示：左室舒張功能減低。給予擴(kuò)冠、抗炎等治療后癥狀緩解。既往高血壓、腔隙性腦梗死病史。查體：胸骨無叩痛，肝脾肋下未觸及。入院后多次檢查白細(xì)胞18×109/L～25×109/L，血紅蛋白130～138 g/L，血小板620×109/L～900×109/L。結(jié)合骨髓穿刺、活檢、白細(xì)胞堿性磷酸酶、BCR/ABL融合基因、JAK2基因V617F突變及Ph1染色體等檢查，診斷：ET。之后口服羥基脲聯(lián)合肌肉注射干擾素α治療，白細(xì)胞5×109/L～10×109/L，血紅蛋白110～120 g/L，血小板360×109/L～540×109/L。期間于2012年6月出現(xiàn)全身多關(guān)節(jié)疼痛，化驗(yàn)檢查類風(fēng)濕因子水平增高。于2012年9月行右側(cè)人工膝關(guān)節(jié)表面置換術(shù)，2013年10月因全身多關(guān)節(jié)腫痛伴活動(dòng)受限，診斷為“類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎”，當(dāng)時(shí)化驗(yàn)檢查白細(xì)胞11.1×109/L 血紅蛋白108 g/L，血小板725×109/L，中幼粒細(xì)胞1%，晚幼粒細(xì)胞2%，嗜酸細(xì)胞2%，嗜堿細(xì)胞9%。再次就診我院，經(jīng)復(fù)查骨髓穿刺、BCR/ABL融合基因、JAK2基因V617F突變及Ph1染色體等檢查，調(diào)整診斷：慢性粒細(xì)胞白血病(慢性期)。自2013年10月30日開始口服伊馬替尼400 mg/d，半個(gè)月后血小板降至275×109/L，白細(xì)胞6.3×109/L。但因關(guān)節(jié)腫痛加重，患者知情同意下?lián)Q用尼洛替尼800 mg/d，現(xiàn)服藥4個(gè)月，無明顯不適癥狀，血象控制較好。

1.2 骨髓BCR/ABL P210融合基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè) 留取3～5 ml EDTA抗凝骨髓進(jìn)行骨髓單個(gè)核細(xì)胞分離和RNA提取，之后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA及RQ-PCR：在15 μl PCR反應(yīng)模板中加入含有逆轉(zhuǎn)錄酶的10 μl PCR反應(yīng)液，42℃ 37 min，94℃ 5 min；94℃ 15 s，60℃ 60 s，40次循環(huán)；37℃ 1 min。ABL基因作為內(nèi)參照基因。目的基因BCR-ABL(P210)引物及探針序列：上游引物b2：5′-CCGC TGACCATCAATAAGGAA-3′，下游引物a2：5′-CTCAGACCCTGAGGCTCAAA GT-3′；探針BCR-ABL：5′-FAM-AGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCT-TAMRA-3′。內(nèi)參基因ABL引物及探針序列：上游引物ENF1003：5′-TGGAGA TAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3′，下游引物ENR1063：5′-TGGAGATA ACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3′；探針ENPr1043：5′-FAM-CCATTTTTG GTTTGGGCTTCACACCATT-TAMRA-3′。

1.3 JAK2基因V617F突變的檢測(cè) 留取3～5 ml EDTA抗凝骨髓液，提取DNA。采用AS-PCR方法。PCR反應(yīng)體系為：10×PCR緩沖液2.5 μl，10 μmol/L的F1引物1.2 μl(正義引物：5′-GT-GAATAGTCCTAGTGTTTTCAGTTTCA-3′)、F2引物1.3 μl(正義引物：5′-AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3′)、R引物2.5 μl(反義引物：5′-ATCTATAGTCATGCTGAAAGTAGGAGAAAG-3′)，50 ng/μl模板DNA 2 μl，2 μl的25 mmol/L MgCl2，2 μl的各種dNTP和2 μl Taq DNA聚合酶，加雙蒸水至12.5 μl。之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳及測(cè)序。

1.4 Ph1染色體FISH的檢測(cè) 留取3～5 ml肝素抗凝骨髓液。采用Spectrum Orange標(biāo)記的序列特異性DNA探針ABL及Spectrum Green標(biāo)記的序列特異性DNA探針BCR。探針處理：每份標(biāo)本探針1 μl，加雜交稀釋液4 μl混勻，將探針混合液5 μl加于玻片的待雜交區(qū)，蓋上玻片。用橡膠膠水封片后，放于自動(dòng)原位雜交儀中，程序設(shè)定78℃ 變性5 min，42℃雜交20 h。雜交結(jié)束后，洗片，去除蓋玻片，將玻片置于46℃的0.3% NP-40/0.4×SSC中洗滌2 min，再置于2×SSC/0.1NP-40中洗滌45 s，置于2×SSC中脫水4 min，再置于70%的酒精中脫水4 min，取出玻片，晾干，復(fù)染，吸取10 μl的DAPI于雜交區(qū)，置于4℃冰箱，待30 min后觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 初診骨髓涂片及活檢 骨髓涂片：骨髓增生明顯活躍，粒系細(xì)胞比例明顯增高，早幼粒細(xì)胞1%，中幼粒細(xì)胞15%，晚幼粒細(xì)胞17.5%，嗜酸粒細(xì)胞4.5%，嗜堿粒細(xì)胞3%，紅系細(xì)胞比例減低，全片共見巨核細(xì)胞230只，為胞體大、多分葉核巨核細(xì)胞(見圖1)；外周血涂片：未見早、中、晚幼粒細(xì)胞，嗜堿粒細(xì)胞12%；骨髓活檢：骨髓增生活躍，粒系細(xì)胞比例增高，可見各階段細(xì)胞散在分布，紅系細(xì)胞比例減低，巨核細(xì)胞6只，少量纖維細(xì)胞增生。

2.2 調(diào)整診斷時(shí)骨髓涂片 骨髓增生明顯活躍，粒細(xì)胞增生明顯活躍，中、晚幼粒細(xì)胞比值增高，原始粒細(xì)胞0.8%，早幼粒細(xì)胞2.4%，中幼粒細(xì)胞23.2%，晚幼粒細(xì)胞24%，紅細(xì)胞增生減低，全片見巨核細(xì)胞220只，為單圓核小巨核細(xì)胞(見圖1)。

圖1 初診及調(diào)整診斷時(shí)骨髓巨核細(xì)胞形態(tài)(×100)

2.3 初診基因及染色體等相關(guān)檢查 骨髓細(xì)胞BCR/ABL P210融合基因定量檢測(cè)：陰性；外周血細(xì)胞BCR/ABL熒光原位雜交FISH檢測(cè)：陰性(見圖2)；骨髓細(xì)胞JAK2基因?yàn)橐吧?；骨髓白?xì)胞堿性磷酸酶陽性率14% 積分14分。

2.4 調(diào)整診斷時(shí)基因及染色體等相關(guān)檢查 骨髓細(xì)胞BCR/ABL P210融合基因定量檢測(cè)：陽性；外周血細(xì)胞BCR/ABL熒光原位雜交FISH檢測(cè)(見圖2)：陽性；骨髓細(xì)胞JAK2基因?yàn)橐吧汀?/p>

圖2 初診及調(diào)整診斷時(shí)外周血細(xì)胞BCR/ABL熒光原位雜交FISH檢測(cè)(×100)

3 討 論

MPN傳統(tǒng)上分為BCR-ABL陽性的CML和BCR-ABL陰性的MPN，后者包括原發(fā)性PMF、PV和ET。雖然在2005年前pubmed上曾報(bào)道數(shù)篇的Ph陽性ET〔3,4〕，但此后隨著對(duì)疾病性質(zhì)的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)及疾病定義的進(jìn)一步限定，目前對(duì)于PMF和ET的診斷要求是沒有Ph染色體，而Ph染色體的存在是診斷CML的必備條件。然而，當(dāng)Ph染色體陽性MPN缺乏CML的典型特征〔5〕(白細(xì)胞增高并核左移、脾臟腫大、嗜堿性粒細(xì)胞增多、小單圓核巨核細(xì)胞)時(shí)，會(huì)給臨床醫(yī)生在疾病的診斷過程中帶來不少困惑。

我們的病例在初始診斷時(shí)符合WHO對(duì)于ET的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔6〕：①血小板>450×109/L；②巨核細(xì)胞增殖，體積大，形態(tài)成熟，無粒系或紅系增殖；③除外CML、PV、PMF、骨髓增生異常綜合征(MDS)或其他髓系腫瘤；④證實(shí)存在JAK2V617F或其他克隆標(biāo)記；或沒有反應(yīng)性血小板增多的證據(jù)。自診斷以來給予羥基脲聯(lián)合干擾素α治療，起初血小板控制較好，但在2年后血小板控制不佳，此時(shí)白細(xì)胞數(shù)值與初診時(shí)相當(dāng)，但骨髓巨核細(xì)胞由初診時(shí)的胞體大、多分葉核巨核細(xì)胞轉(zhuǎn)為單圓核小巨核細(xì)胞，同時(shí)骨髓細(xì)胞BCR/ABL P210融合基因定量檢測(cè)陽性，外周血細(xì)胞BCR/ABL熒光原位雜交FISH檢測(cè)陽性，此時(shí)患者不再符合ET，而轉(zhuǎn)化為CML。

CML和ET均是克隆性造血干細(xì)胞疾病，雖然通常在初期的臨床表現(xiàn)和臨床過程上是明顯不同的，但一些CML和ET病例有重疊的臨床特點(diǎn)，可能會(huì)出現(xiàn)ET和CML的共存〔1〕，也可能會(huì)出現(xiàn)ET和CML的交替〔2〕。Wahlin等〔2〕首次報(bào)道1例58歲的男性ET患者在羥基脲治療18年后轉(zhuǎn)化為CML，之后該患者進(jìn)行了異基因造血干細(xì)胞移植。隨后Curtin等〔7〕報(bào)道1例患者在診斷Ph陰性ET前存在長(zhǎng)時(shí)間的孤立血小板增高的病史，在ET診斷后4個(gè)月檢測(cè)到Ph染色體。Cesar等〔8〕報(bào)道1例65歲的女性ET患者，在羥基脲治療6年后，血小板數(shù)量不能控制，此時(shí)檢測(cè)到Ph染色體，之后應(yīng)用伊馬替尼治療，血小板數(shù)量得到控制。此后Mizutani等〔9〕報(bào)道1例72歲的男性ET患者在羥基脲治療9年后血小板逐漸降低，白細(xì)胞上升，此時(shí)通過染色體及基因?qū)W的檢查，證實(shí)交替為CML，之后改為伊馬替尼治療，4個(gè)月后因出現(xiàn)胸腔積液而調(diào)整為尼洛替尼治療，在治療5個(gè)月后CCyR，但此時(shí)血小板再次上升，之后需尼洛替尼和羥基脲共同應(yīng)用控制病情。Santos等〔10〕報(bào)道1例41歲男性ET患者2年后轉(zhuǎn)化為CML，在伊馬替尼治療后BCR-ABL1水平下降的同時(shí)血小板再次上升，之后需伊馬替尼和羥基脲共同應(yīng)用控制血小板數(shù)量。

Mizutani等〔9〕和Santos等〔10〕所報(bào)道的病例均出現(xiàn)一致的現(xiàn)象：起初臨床表現(xiàn)為Ph-ET，隨后交替為Ph+CML，在應(yīng)用對(duì)BCR-ABL靶向治療的酪氨酸激酶抑制劑后，在BCR-ABL1水平下降的同時(shí)血小板再次上升。上述現(xiàn)象我們推測(cè)可能有如下機(jī)制：Ph-和Ph+克隆可能在發(fā)病時(shí)即共同存在于患者體內(nèi)，只是在不同的時(shí)期不同的克隆占優(yōu)勢(shì)而導(dǎo)致臨床表現(xiàn)及檢測(cè)結(jié)果的不同，及應(yīng)用目前檢測(cè)手段表現(xiàn)為Ph-ET和Ph+CML的交替。Ph-和Ph+克隆間相互抑制，ET交替為CML患者，在發(fā)病時(shí)Ph-克隆占優(yōu)勢(shì)，表現(xiàn)為ET，隨著長(zhǎng)時(shí)間的治療，其被抑制，之后表現(xiàn)為Ph+克隆占優(yōu)勢(shì)，而表現(xiàn)為CML，隨著酪氨酸激酶抑制劑的應(yīng)用抑制了Ph+克隆的增殖，從而為Ph-克隆的增殖提供了空間，使得再次表現(xiàn)為ET。另外伊馬替尼對(duì)于c-kit的抑制作用強(qiáng)于尼洛替尼，導(dǎo)致尼洛替尼組Ph-克隆的相對(duì)弱抑制，推測(cè)可能應(yīng)用尼洛替尼發(fā)生ET復(fù)發(fā)的概率更大。

盡管Ph-MPN在治療過程中出現(xiàn)Ph+CML是非常少見的，兩者的臨床表現(xiàn)有時(shí)又相似，但它們需要不同的靶向治療，因此臨床醫(yī)生需要細(xì)致地將兩者進(jìn)行鑒別診斷，以便更好地治療。

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2 Wahlin A，Golovleva I.Emergence of Philadelphia positive chronic myeloid leukaemia during treatment with hydroxyurea for Philadelphia negative essential thrombocythaemia〔J〕.Eur J Haematol，2003；70(4)：240-1.

3 Michiels JJ，Berneman Z，Schroyens W，etal.Philadelphia(Ph)chromosome-positive thrombocythemia without features of chronic myeloid leukemia in peripheral blood：natural history and diagnostic differentiation from Ph-negative essential thrombocythemia〔J〕.Ann Hematol，2004；83(8)：504-12.

4 Daly K，Nandula SV，Murty VV，etal.Variant translocation with a deletion of derivative(9q)in a case of Philadelphia chromosome positive(Ph+)essential thrombocythemia(ET)，a variant of Chronic Myelogenous Leukemia(CML)with a poor prognosis〔J〕.Leukemia Lymphoma,2005;46(12)：1801-6.

5 Voican I，Vladareanu AM，Bumbea H，etal.CML patients in the molecular era-report of five years experience of diagnosis and treatment in a single center〔J〕.J Med Life,2013;6(3)：319-26.

6 Vardiman JW，Thiele J，Arber DA，etal.The 2008 revision of the world health organization(WHO)classification of myeloid neoplasms and acute leukemia：rationale and important changes〔J〕.Blood,2009;114(5)：937-51.

7 Curtin NJ，Campbell PJ，Green AR，etal.The Philadelphia translocation and pre-existing myeloproliferative disorders〔J〕.Br J Haematol,2005;128(5)：734-6.

8 Cesar JM，Cabello P，F(xiàn)erro T，etal.Emergence of chronic myelogenous leukemia in a patient with primary thrombocythemia and absence of BCR/ABL rearrangement〔J〕.Cancer Genet Cytogenet,2006;167(1)：74-7.

9 Mizutani S，Kuroda J，Shimizu D，etal.Emergence of chronic myelogenous leukemia during treatment for essential thrombocythemia〔J〕.Int J Hematol,2010;91(3)：516-21.

10 Santos FP，Verstovsek S.JAK2 inhibitors：what′s the true therapeutic potential〔J〕? Blood Rev,2011;25(2)：53-63.

〔2015-06-01修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

遼寧省科技計(jì)劃課題(No.2011225021;2013225089)

周 凡(1961-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事骨髓增殖性腫瘤的診治研究。

劉景華(1976-)，女，博士，副主任醫(yī)師，主要從事復(fù)發(fā)難治性多發(fā)性骨髓瘤機(jī)制研究。

R733

A

1005-9202(2017)02-0387-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.058