舌癌細(xì)胞成像中的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料

徐亞娟 陳 蕊 金志巍 張艷秋 劉文書

(吉林省腫瘤醫(yī)院口腔頜面腫瘤外科，吉林 長春 130012)

舌癌細(xì)胞成像中的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料

徐亞娟 陳 蕊 金志巍 張艷秋 劉文書1

(吉林省腫瘤醫(yī)院口腔頜面腫瘤外科，吉林 長春 130012)

目的 探討上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料在舌癌細(xì)胞成像中的應(yīng)用價(jià)值。方法 采用 MTT 法對上轉(zhuǎn)換稀土發(fā)光納米探針進(jìn)行細(xì)胞毒性分析。將胺基修飾過的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針皮下注射到裸鼠腋下腫瘤處，對裸鼠進(jìn)行 CT 檢測。合成上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米分子探針，對其進(jìn)行表征及胺基修飾，并進(jìn)行紅外光譜分析。結(jié)果 采用水熱法制備得到粒子大小均一的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料NaYF4。上轉(zhuǎn)換納米材料能激發(fā)深層生物組織信號，具有很深的激發(fā)光穿透能力，避免了對組織、細(xì)胞的損傷。它具有的良好生物相容性，較小毒副作用，熒光壽命長，有多個(gè)發(fā)射峰且發(fā)射譜帶窄的特點(diǎn)，有利于進(jìn)行多重生物組織的標(biāo)記成像。結(jié)論 上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針能在癌細(xì)胞成像，為進(jìn)一步上轉(zhuǎn)換發(fā)光的納米探針的臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針；細(xì)胞成像；胺基修飾；CT檢測

早期預(yù)警對舌癌的診斷及治療至關(guān)重要，目前，常用的生物檢測手段有磁共振成像(MRI)、正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)、電子計(jì)算機(jī)、光學(xué)成像、CT、PETCT橫斷掃描等，但效果均不理想〔1〕。上轉(zhuǎn)換發(fā)光是一種在近紅外光激發(fā)下能發(fā)出可見光或紫外光,它可以吸收兩個(gè)或兩個(gè)以上低能光子而輻射一個(gè)高能光子的發(fā)光現(xiàn)象〔2〕。無機(jī)基質(zhì)材料的稀土離子上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料具有較長的能級壽命、較高的上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率，是目前研究較多且比較理想的上轉(zhuǎn)換材料。經(jīng)常使用Yb3+離子進(jìn)行共摻雜可提高其發(fā)光率。稀土離子Yb3+的吸收光譜峰值在980 nm，與Er3+第一激發(fā)態(tài)的吸收能量相一致，且吸收截面遠(yuǎn)>Er3+,吸收完能量后可直接傳遞給Er3+，因此是一種很有效的上轉(zhuǎn)換敏化劑〔3〕。

本研究合成了氨基修飾的納米材料上轉(zhuǎn)換納米材料，具有優(yōu)良的 UCL 性質(zhì)，氨基不僅極大地增強(qiáng)了上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子核的熒光強(qiáng)度，還能夠使納米探針更容易與目標(biāo)細(xì)胞結(jié)合，形成細(xì)胞成像。通過荷腫瘤裸鼠的活體實(shí)驗(yàn)，證明了氨基修飾的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子能在舌癌細(xì)胞中成像，為納米探針的臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人舌鱗癌細(xì)胞(Tca-8113)、稀土氧化物(氧化釔(Y2O3)、氧化鐿(Yb2O3)，氧化鉺(Er2O3)、氧化釓(Gd2O3)、DMEM、胎兒牛血清蛋白(FBS)、溴化噻唑藍(lán)四氮唑(MTT)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水，除特殊說明外，實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子的合成 將Y2O3、Yb2O3和Er2O3分別溶于過量的HCl中加熱蒸干，然后再加入適量水配制成1.6 mol/L YCl3，0.1 mol/L ErCl和30.6 mol/L YbCl3的水溶液作為儲備液。接著分別提取0.5 ml YCl3、30.3 ml YbCl3和0.2 L ErCl的儲備液加入到容量為100 ml的三口燒瓶中，攪拌均勻后逐漸加熱升溫至100℃后蒸干水分，再加入6 ml油酸和15 ml 1-十八烯，繼續(xù)升溫達(dá)到150℃。觀察反應(yīng)混合物形成均勻的淡黃色溶液后，再冷卻至室溫，并逐滴加入2.5 mmol NaOH 的甲醇溶液10 ml和含有 4 mmol NH4F，均勻攪拌1 h后升溫逐漸達(dá)到70℃，然后進(jìn)一步排盡甲醇，再升溫至100℃，緩慢升溫至300℃。在 300℃下孵育1 h后，再冷卻到室溫。最后以乙醇為洗滌液，在10 000 r/min離心洗滌3次；最后將所獲得的NaYF4∶Yb3+,Er3+納米粒子重新分散于5 ml環(huán)己烷中，待用。

1.2.2 上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子的胺基修飾方法 將NaYF4納米粒子置于環(huán)己烷溶液中，與8 ml鹽酸溶液混合攪拌過夜，去掉納米粒子表面的配體，由-OH配位，加丙酮20 ml，8 000 r/min離心8 min，用水分散加丙酮沉化，11 500 r/min離心20 min，重復(fù)2次；加入到配置的750 mg聚丙烯酰胺(PAAM)20 wt%水溶液并分散于50 ml水的水溶液中，攪拌過夜；之后11 500 r/min離心15 min，重復(fù)3遍，得到的沉淀分散在8 ml二甲基甲酰胺(DMF)或者水中。

1.2.3 MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 用含10%FBS DMEM，5% CO2、37℃下培養(yǎng)人舌鱗癌細(xì)胞(Tca-8113細(xì)胞)。將細(xì)胞密度為1×105細(xì)胞/孔的Tca-8113細(xì)胞懸浮液接種到48孔板中培養(yǎng)，用 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH7.2)清洗細(xì)胞3次；分別加入 50 μl(0.31，0.63和1.25 g/L) 不同濃度的NaYF4∶Yb3+，ER3+納米探針和50 μl(0.31、0.63和1.25 g/L) 不同濃度的胺基修飾過的NaYF4∶Yb3+，ER3+納米探針，以及 100 μl新鮮 DMEM共孵育24 h。

1.2.4 CT造影成像實(shí)驗(yàn) 取1 ml(0，0.31，0.63，1.25 和2.50 g/L)不同濃度的胺基修飾的納米探針?biāo)芤悍謩e加入EP離心，利用螺旋CT(GE64排)對納米探針圖像采集(成像參數(shù)：Thickness=0.1 mm；Pitch=0.648；120 kVp，192 mA；Field of view=108 $108；Matrix=1 024 $1 024 pixels;Gantry rotation time=0.75 s；Table speed=16.7 mm/s)。

1.2.5 裸鼠的活體 CT 成像 先將150 μl水合氯醛溶液(10%，1∶1) 注入種植有腋下腫瘤的裸鼠，在腫瘤區(qū)皮下注射150 μl胺基修飾的納米探針溶液；在不同的時(shí)間點(diǎn)對裸鼠進(jìn)行 CT 成像(成像參數(shù):TR/TE=1 000，2 000，3 000，4 000/7.9 ms;Field of view=8 cm;Matrix=128 $128;number of excitations(NEX)=2;Slice thickness=2 mm;Space=0.5 mm;Coil=QUADKNEE)。

2 結(jié) 果

2.1 上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針的表征 上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子在原子力顯微鏡下觀察，納米粒子大小均一，平均粒徑為(240±1.2)nm。如圖1A 所顯示NaYF4∶Yb3+，Er3+納米粒子為球形。胺基修飾之后，納米粒子的粒徑相應(yīng)的增加到(400±3)nm (如圖1B所示)。

A：未修飾的納米粒子；B：胺基修飾的納米粒子圖1 上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒原子力顯微鏡圖

2.2 紅外光譜對上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針檢測 對上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針進(jìn)行胺基修飾，為檢測納米探針胺基的存在，通過紅外光譜對此法合成的胺基修飾前后的NaYF4納米粒子進(jìn)行表征。油相制備的NaYF4∶Yb3+,Er3+納米粒子譜線中2 754 cm-1和2 853 cm-1來自于C-H鍵的伸縮振動，利用PAAM(聚丙烯胺)相轉(zhuǎn)移之后的樣品中，同時(shí)1 157 cm-1的吸收峰來自C-H的伸縮振動，而1 472 cm-1和1 659 cm-1的吸收峰來自N-H的變形振動，出現(xiàn)這些新的振動峰足以證實(shí)PAAM配體對上轉(zhuǎn)換納米粒子的修飾是成功的，見圖2。胺基能與含有羧基的生物分子(如抗體，蛋白、氨基修飾等)反應(yīng)，為納米探針的進(jìn)一步生物應(yīng)用，如藥物負(fù)載、癌癥的靶向治療等提供可能性。

用980 nm波長的激光照射分散在血清細(xì)胞生長培養(yǎng)基的胺基修飾過的納米探針，在暗室內(nèi)，能觀察到穩(wěn)定均一的光束。實(shí)驗(yàn)表明胺基修飾的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針在DMEM細(xì)胞培基中具有良好的分散性和穩(wěn)定性。

2.3 上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針的細(xì)胞毒性檢測實(shí)驗(yàn) 利用體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)對納米探針進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測，評價(jià)上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針的在接觸細(xì)胞后所產(chǎn)生的生物學(xué)反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)立了三組濃度梯度，通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的成活數(shù)(圖3)。在三組實(shí)驗(yàn)濃度下Tca-8113存活率都在90%以上(見表1)。

圖2 胺基修飾的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒的紅外光譜圖

圖3 MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

利用獲得OD值計(jì)算三組實(shí)驗(yàn)濃度下Tca-8113存活率都在90%以上(見表1)。Tca-8113與濃度高達(dá) 2.5 g/L 的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針共培養(yǎng)24 h后仍保持高于90%的存活率，說明納米探針具有較低的細(xì)胞毒性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：不同濃度梯度的納米探針NaYF4∶Yb3+,Er3+,和胺基修飾過的NaYF4∶Yb3+,Er3+納米探針，對細(xì)胞的毒性都很小。

2.4 上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針的磁共振特性檢測 為了驗(yàn)證胺基修飾過的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針是否具有磁共振(MR)特性能，并夠提高 MRI的造影效果。以及胺基修飾的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針是否具能在細(xì)胞內(nèi)成像，利用GE64排螺旋CT系統(tǒng)對納米探針進(jìn)行CT圖像采集，檢測合成的探針在CT造影的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在kOe(1 Oe=41π103 A/m)的磁場下，胺基修飾的NaYF4∶Yb3+,Er3+納米探針具有CT信號，且CT信號與納米探針的濃度成正比。實(shí)驗(yàn)將10 g/L胺基修飾過的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針皮下注射到裸鼠腋下腫瘤處；分別在注射前和注射后30 min對裸鼠進(jìn)行CT 檢測，觀察發(fā)現(xiàn)納米探針對腫瘤區(qū)的信號有明顯的增強(qiáng)效果。在注射納米探針前腫瘤區(qū)的CT 信號值為42，而注射30 min后腫瘤區(qū)明顯變亮(見圖4)，其CT信號值增加到314，證明胺基修飾過的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針具有較強(qiáng)的 CT 造影能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：胺基修飾過的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針能夠作為納米探針應(yīng)用于CT活體成像。

表1 不同濃度梯度的細(xì)胞活性

1：未注射上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針圖像；2：注射胺基修飾過的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針30 min 后圖像圖4 下腫瘤的裸鼠進(jìn)行 CT成像

3 討 論

上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料在生物成像方面具有巨大優(yōu)勢，這種材料具有很強(qiáng)的熒光效率，比較理想的光穩(wěn)定性和抗漂白性，和非常完美的性價(jià)比。上轉(zhuǎn)納米材料通常以近紅外光(一般為980 nm)為激發(fā)光源，這使得它具有很強(qiáng)的穿透能力，對組織的損傷較輕而且組織不會產(chǎn)生自發(fā)熒光。這些優(yōu)點(diǎn)使上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料成為繼量子點(diǎn)后，又一應(yīng)用性強(qiáng)熒光探針〔4〕。同時(shí)上轉(zhuǎn)換稀土納米材料也是一種理想應(yīng)用方向的納米造影劑，如果摻雜了適當(dāng)?shù)南⊥猎兀苁蛊渚邆渖限D(zhuǎn)換熒光(UCL)的特性和 CT造影的能力。采用980 nm 成像技術(shù)、近紅外激光激發(fā)的UCL，更具有強(qiáng)的穿透力且無任何干擾、背景低等優(yōu)點(diǎn)，能從紫外區(qū)跨度到紅外區(qū)，使成像的選擇能力有所提高〔5〕。1999年Zijlmans等在首次報(bào)道了上轉(zhuǎn)換熒光材料檢測人類前列腺組織中特異性抗原，使得上轉(zhuǎn)換納米材料廣泛應(yīng)用于各種生物檢測和分析〔6〕。有研究報(bào)道了一種新穎的上轉(zhuǎn)換納米材料檢測方法，用Yb3+，Er3+一同摻雜到上轉(zhuǎn)換納米顆粒做成生物探針對溶液中痕量進(jìn)行分析和檢測〔7〕。

上轉(zhuǎn)換納米稀土發(fā)光材料(UCNPs)是可發(fā)出反斯托克斯光、將光子能量轉(zhuǎn)換升高同時(shí)也可將近紅外光轉(zhuǎn)換成可見光的功能性材料〔8〕，其最大特點(diǎn)是在能量上吸收光要遠(yuǎn)小于發(fā)射光〔9〕。本論文采用水熱法制備得到粒子大小均一的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料NaYF4，對上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針進(jìn)行胺基修飾，為檢測納米探針胺基的存在，通過紅外光譜對此法合成的胺基修飾的NaYF4納米粒子進(jìn)行表征，通過胺基與含羧基的生物分子反應(yīng)為納米探針的進(jìn)一步生物應(yīng)用提供可能性。雖然有文章報(bào)道了 UCNPs 在細(xì)胞水平有限的毒性〔10〕，但是在合成上轉(zhuǎn)換納米稀土發(fā)光納米探針避開了有毒的成分，并通過MTT法進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測，沒有觀察到有明顯的抑制生長的現(xiàn)象。同時(shí)運(yùn)用上轉(zhuǎn)換稀土發(fā)光材料對裸鼠進(jìn)行 CT 檢測，證實(shí)納米探針具有識別舌癌細(xì)胞區(qū)的信號效果。綜上，實(shí)驗(yàn)證實(shí)上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料在生物診療方面獨(dú)特的性質(zhì)和優(yōu)勢，具有良好相容性，能夠作為一種舌癌腫瘤標(biāo)記、追蹤與檢測的材料，在未來的生物醫(yī)學(xué)腫瘤診治方面有著廣闊的應(yīng)用價(jià)值。

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〔2015-12-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

劉文書(1966-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事口腔頜面外科臨床研究。

徐亞娟(1965-)，女，主任醫(yī)師，主要從事口腔頜面腫瘤研究。

R73

A

1005-9202(2017)02-0301-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.018

1 吉林大學(xué)第一臨床醫(yī)院口腔科