腦缺血再灌注大鼠局灶性腦缺血預(yù)處理后Nogo-A及NgR的表達(dá)

焦義明 何健玲 何勝男

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院體檢中心，河南 鄭州 450014)

腦缺血再灌注大鼠局灶性腦缺血預(yù)處理后Nogo-A及NgR的表達(dá)

焦義明 何健玲 何勝男1

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院體檢中心，河南 鄭州 450014)

目的 觀察局灶性腦缺血預(yù)處理干預(yù)后大鼠腦內(nèi)Nogo-A、NgR表達(dá)的情況。方法 建立腦缺血再灌注及預(yù)處理模型，將健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組和缺血預(yù)處理組，每組又分為1、2、7 d 3個(gè)亞組，預(yù)處理時(shí)間為10 min，免疫組化法檢測(cè)大鼠缺血海馬區(qū)Nogo-A、NgR的表達(dá)，RT-PCR方法檢測(cè)大鼠缺血海馬區(qū)NgR mRNA的表達(dá)。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組在1、2、7 d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)Nogo-A及NgR表達(dá)均增高；腦缺血預(yù)處理干預(yù)后，Nogo-A及NgR在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)較缺血再灌注組均明顯降低(P<0.05)。結(jié)論 局灶性腦缺血預(yù)處理的干預(yù)可以降低大鼠腦內(nèi)Nogo-A及NgR的表達(dá)而提高腦缺血耐受的神經(jīng)保護(hù)作用。

局灶性腦缺血預(yù)處理；Nogo-A；NgR

給予一次或多次非致死量的腦缺血預(yù)預(yù)處理能夠誘導(dǎo)腦缺血耐受，從而可以減輕腦缺血再灌注引起的腦損傷。隨著對(duì)這一作用認(rèn)識(shí)的加深，其分子保護(hù)機(jī)制被提出許多種。但其通過何種具體的機(jī)制發(fā)揮作用，目前仍然不清楚〔1〕。Nogo-A是一種重要的神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子，其作用是抑制神經(jīng)元的再生，而腦缺血后功能損傷程度則與神經(jīng)元再生的難易存在一定關(guān)系。由此表明，腦缺血后功能損傷輕重一定程度上取決于Nogo-A的作用。NgR是Nogo-A的受體，而Nogo-A 往往通過與之結(jié)合來發(fā)揮作用。為此，本實(shí)驗(yàn)擬通過制備腦缺血預(yù)處理模型，觀察腦組織中Nogo-A、NgR表達(dá)的情況，來探討腦缺血耐受的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組 成年健康雄性SD大鼠，體重(250±30)g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為3組，假手術(shù)組；缺血再灌注組：假手術(shù)3 d后給予2 h大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)，再分別灌注1、2、7 d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)后處死；缺血預(yù)處理組：缺血預(yù)處理10 min再灌注3 d后給予2 h MCAO，再灌注1 d、2 d及7 d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)后處死。

1.2 缺血預(yù)處理及模型制作 本實(shí)驗(yàn)參照Longa等〔2〕線栓法并加以改進(jìn)進(jìn)行。在腹腔注射10%的水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉，采取頸正中部切口，鈍性依次分離右側(cè)頸總、頸外、頸內(nèi)動(dòng)脈，將右側(cè)頸外動(dòng)脈結(jié)扎并切斷，在殘端距分叉約5 mm處，剪一切口，插入約0.26 mm直徑的釣魚線，沿頸內(nèi)動(dòng)脈輕柔推進(jìn)距分叉處約19 mm遇有輕微阻力即行，結(jié)扎頸外動(dòng)脈殘端，10 min后抽出釣魚線至分叉處，形成第一次再灌注，縫合切口，完成腦缺血預(yù)處理。3 d后再次用同樣方法造成MCAO 2 h，各組分別再灌注1 d、2 d、7 d后檢測(cè)大鼠神經(jīng)功能情況，然后處死取出腦組織用于指標(biāo)測(cè)定。假手術(shù)組僅分離右側(cè)頸總動(dòng)脈及分叉處，不插入線栓阻斷MCAO。動(dòng)物蘇醒后爬行時(shí)向左劃圈，提尾時(shí)左前肢內(nèi)收屈曲為模型制備成功的標(biāo)志，術(shù)中用白熾燈使大鼠肛溫保持在37℃左右。

1.3 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 采用Longa等〔2〕的神經(jīng)功能標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分：無任何神經(jīng)功能障礙為0分；不能伸展左側(cè)前肢為1分；向左側(cè)劃圈為2分；向左側(cè)傾倒為3分；無自主活動(dòng)且伴有意識(shí)障礙為4分。

1.4 免疫組化分別檢測(cè)大鼠大腦缺血海馬區(qū)Nogo-A 和NgR的表達(dá) 每個(gè)亞組大鼠處死后斷頭取腦，固定、石蠟包埋后切片，取前鹵后6 mm部分進(jìn)行連續(xù)性冠狀切片，片厚5 μm，分別按Nogo-A和NgR的免疫組化說明書依次進(jìn)行染色、 DAB顯色、封片，光鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈棕色者為Nogo-A和NgR陽性細(xì)胞。每張切片分別選取10個(gè)具有代表性的高倍視野，平均計(jì)算Nogo-A和NgR陽性細(xì)胞數(shù)。

1.5 RT-PCR檢測(cè)大鼠缺血海馬區(qū)NgR mRNA的表達(dá) 每個(gè)亞組在右側(cè)腦缺血組織區(qū)取100 g研磨粉碎，加入1.4 ml Trizol 試劑勻漿，經(jīng)過分離、沉淀、洗滌、溶解后即可提取總RNA。用瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA 質(zhì)量，用Transgene 公司提供的RT試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用 NgR上游引物(5'CAGTGACTTAGAGGGTTGTGCT3')及下游引物(5'CCATTGCCTGGTGGAGTGT3')建立PCR 反應(yīng)體系，擴(kuò)增DNA長(zhǎng)度為210 bp；然后對(duì)產(chǎn)物DNA進(jìn)行電泳，用D-140 圖像記錄系統(tǒng)對(duì)目的條帶分析，以NgR 的DNA 條帶和內(nèi)參GPADH(上游引物5'CAGTGCCAGCCTCGTCTCAT3'，下游引物5'AGGGGCCATCCACAGTCTTC3'，擴(kuò)增片段595 bp)的DNA 條帶灰度值比值計(jì)算目的基因NgR mRNA的表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)及多因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 假手術(shù)組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無神經(jīng)功能缺損，缺血再灌注組均有不同程度的神經(jīng)功能缺損，而缺血預(yù)處理組神經(jīng)功能評(píng)分在各時(shí)間點(diǎn)均明顯低于缺血再灌注組(P<0.05)。見表1。

2.2 免疫組化方法檢測(cè)大鼠右側(cè)海馬區(qū)Nogo-A表達(dá) 缺血再灌注組在右側(cè)海馬區(qū)可見較多的胞質(zhì)染色深的Nogo-A陽性細(xì)胞，與假手術(shù)組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較差異顯著(P<0.05)；實(shí)施預(yù)處理干預(yù)后，右側(cè)海馬區(qū)Nogo-A陽性細(xì)胞數(shù)有所降低，與缺血再灌注組比較差異顯著(P<0.05)。見表2。

2.3 免疫組化方法檢測(cè)大鼠右側(cè)海馬區(qū)NgR表達(dá) 缺血再灌注組右側(cè)海馬區(qū)可見有較多的胞質(zhì)染色深的NgR陽性細(xì)胞，與假手術(shù)組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較差異顯著(P<0.05)；實(shí)施預(yù)處理干預(yù)后，右側(cè)海馬區(qū) NgR陽性細(xì)胞有所降低，與缺血再灌注組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較差異顯著(P<0.05)。見表3。

2.4 RT-PCR檢測(cè)大鼠右側(cè)海馬區(qū)NgR mRNA表達(dá) 缺血再灌注組右側(cè)海馬區(qū)可見有較多的NgR mRNA表達(dá)，與假手術(shù)組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較差異顯著(P<0.05)；實(shí)施預(yù)處理干預(yù)后，右側(cè)海馬區(qū)NgR mRNA表達(dá)有所降低，與缺血再灌注組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較差異顯著(P<0.05)。見表4。

表1 各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分的比較±s,n=10)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與缺血再灌注組比較：2)P<0.05，下表同

表2 各組右側(cè)海馬區(qū)Nogo-A表達(dá)的比較

表3 各組右側(cè)海馬區(qū)NgR表達(dá)的比較

表4 各組右側(cè)海馬區(qū)NgR mRNA表達(dá)的比較

3 討 論

缺血預(yù)處理后的腦組織可對(duì)隨后發(fā)生的缺血產(chǎn)生保護(hù)性的耐受現(xiàn)象〔3〕。腦缺血耐受的保護(hù)機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的多機(jī)制參與的過程，包括細(xì)胞因子的參與、興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡的改變等，但其具體的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制仍不明確。Moncayo等〔4〕對(duì)2 492例腦梗死患者研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生過短暫性腦缺血(TIA)的腦梗死患者預(yù)后較好，未發(fā)生過TIA的患者預(yù)后較差，且神經(jīng)功能缺損較重。由此可知，TIA一定程度上類似于腦缺血預(yù)處理，因而研究腦缺血預(yù)處理的分子保護(hù)機(jī)制又具有一定的臨床意義。有研究表明，缺血10 min作為預(yù)處理，再灌注3 d后產(chǎn)生的腦保護(hù)作用最強(qiáng)，且時(shí)間持續(xù)約為7 d〔5〕。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用缺血10 min作為預(yù)處理時(shí)間，3 d作為再灌注時(shí)間，同時(shí)設(shè)置了1 d、2 d、7 d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，其符合預(yù)處理腦保護(hù)作用的持續(xù)時(shí)間。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，局灶性腦缺血預(yù)處理可通過降低Nogo-A的表達(dá)來起到神經(jīng)保護(hù)作用。也有研究證實(shí)，應(yīng)用Nogo-A抗體IN-1可使腦缺血損傷后的神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)和功能恢復(fù)〔6〕。由此可見，腦缺血損傷后的受損程度和功能恢復(fù)情況與Nogo-A有很大關(guān)系。本文結(jié)果推測(cè)Nogo-A與NgR相結(jié)合來發(fā)揮腦損傷作用，而至于二者如何結(jié)合的，還有待進(jìn)一步研究。通過腦缺血預(yù)處理后，二者表達(dá)較缺血再灌注組而言均降低，大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分也是降低的，因此我們進(jìn)一步推測(cè)腦缺血預(yù)處理可能通過降低Nogo-A與NgR的表達(dá)這一途徑來提高腦缺血耐受的，從而對(duì)腦缺血損傷起保護(hù)作用。這對(duì)缺血性腦血管疾病的防治作用具有一定的臨床意義。

1 Durukan K,Tatlisumak T.Preconditioning-induced ischemic tolerance:a window into endogenous gearing for cerebroprotection〔J〕.Exp Transl Stroke Med,2010;2(1):2．

2 Longa EI,Weinstein PR,Carlson S,etal.Reversible middle cerebral artery:occlusion without craniotomy in rats〔J〕.Stroke,1989;20(1):84-91.

3 Murry CE,Jennings RB,Reimer KA.Preconditioning with ischemia:a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium〔J〕.Circulation,1986;74(5):1124-36．

4 Moncayo J,de Freitas GR,Bogousslaky J,etal.Do transient ischemic attacks have a neural protective effect〔J〕?Neurology,2000;54(11):2089-90.

5 Zhou C,Li Y,Nanda A,etal.HBO suppresses Nogo-A,NgR,or RhoA expression in the cerebral cortex after global ischemia〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2003;309(2):368-76.

6 趙 紅,高曉玉,王得新.腦缺血再灌注模型大鼠神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子Nogo-A的表達(dá)變化〔J〕.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2009;26(1):4-7.

〔2015-08-12修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)

焦義明(1984-)，男，碩士，醫(yī)師，主要從事腦血管疾病的基礎(chǔ)研究。

R743.3

A

1005-9202(2017)02-0299-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.017

1 河南中醫(yī)藥大學(xué)肝膽脾胃二科