縫隙連接蛋白26基因修飾對人高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞增殖和侵襲能力的影響

羅超元 夏金堂 姜海平

(暨南大學附屬第一臨床學院 華僑醫(yī)院胃腸外科，廣東 廣州 510627)

縫隙連接蛋白26基因修飾對人高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞增殖和侵襲能力的影響

羅超元 夏金堂 姜海平

(暨南大學附屬第一臨床學院 華僑醫(yī)院胃腸外科，廣東 廣州 510627)

目的 探討縫隙連接蛋白(Cx)26基因?qū)θ烁咿D(zhuǎn)移性肝癌細胞株(HCCLM3)細胞增殖和侵襲能力的影響。方法 采用慢病毒載體(LV)轉(zhuǎn)染法將載體LV-Cx26轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移性HCCLM3細胞為研究組，僅轉(zhuǎn)染空載體LV-NC-Cx26為對照組，未轉(zhuǎn)染的HCCLM3細胞為空白組。RT-PCR和Western印跡測定轉(zhuǎn)染后Cx26 mRNA和蛋白表達；劃痕荷載染料傳輸實驗檢測細胞通訊功能；流式細胞術(shù)檢測細胞周期并通過CCK-8增殖實驗、Transwell細胞侵襲實驗檢測細胞增殖、侵襲能力。結(jié)果 研究組Cx26 mRNA和蛋白表達量均明顯高于對照組和空白組(P<0.05)。研究組轉(zhuǎn)染慢病毒載體LV-Cx26后的細胞通訊功能明顯強于對照組、空白組，即劃痕細胞中的熒光染料可傳遞到相鄰的3～4列細胞。研究組G0/G1期細胞數(shù)明顯多于對照組和空白組，S期細胞數(shù)明顯少于對照組和空白組(P<0.05)。M期三組細胞數(shù)無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。CCK-8法檢測顯示，72 h起研究組細胞增殖速度明顯低于同期對照組和空白組(P<0.05)；對照組和空白組各時間點細胞增殖情況無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。Transwell細胞侵襲實驗顯示，研究組穿膜細胞數(shù)明顯少于對照組和空白組(P<0.05)。結(jié)論 轉(zhuǎn)染Cx26基因可有效抑制HCCLM3細胞的增殖和侵襲能力，降低惡性生物學特征，可成為晚期肝癌治療的新思路。

縫隙連接蛋白26；肝癌細胞；增殖；侵襲

肝臟是終末期惡性腫瘤主要的轉(zhuǎn)移器官，轉(zhuǎn)移性肝癌具有惡性程度高、預(yù)后差的特點。近年研究發(fā)現(xiàn)，縫隙連接蛋白(Cx)可在胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤中異常表達，對癌癥的發(fā)生、發(fā)展起到重要作用〔1〕。目前研究表明，在Cx家族中的Cx26異常表達可能與惡性腫瘤活性關(guān)系最大〔2〕。本次研究采用慢病毒載體(LV)轉(zhuǎn)染法將載體LV-Cx26轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移性人肝癌細胞株(HCCLM3)細胞，探討Cx26基因修飾對HCCLM3細胞增殖、侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 HCCLM3細胞購于通派(上海)生物科技有限公司；噻唑藍(DMEM)細胞培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；MTT、鏈霉素、青霉素均購于上海浩然生物技術(shù)有限公司；Cx26病毒載體購于長沙愛科博生物科技有限公司；RNA提取試劑盒Trizol、RT-PCR兩步法試劑盒、cDNA合成試劑盒、DNA Marker均購于上海百研生物科技有限公司；PCR引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司化學合成；兔抗人Cx26多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗、鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體均購于美國Santa公司；Transwell小室、羅氏黃液、膽囊收縮素-8(CCK-8)均購于博通維德(北京)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Cx26基因修飾 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)HCCLM3細胞，置于CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育，取對數(shù)生長期細胞用于實驗，以2×103個/孔細胞濃度接種到6孔板中，觀察細胞融合率>90%時，以慢病毒進行轉(zhuǎn)染。本實驗分為三組：轉(zhuǎn)染慢病毒載體LV-Cx26為研究組，空載體LV-NC-Cx26為對照組，未轉(zhuǎn)染的HCCLM3細胞為空白組。在轉(zhuǎn)染后48 h后采用RT-PCR和Western印跡法分別測定Cx26 mRNA和蛋白表達情況。

1.2.2 劃痕荷載染料傳輸實驗 分別取三組細胞接種于培養(yǎng)皿中，置于顯微鏡下觀察，當鏡下發(fā)現(xiàn)細胞匯合度達到100%后棄去培養(yǎng)液，之后再用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每組標本加入1 ml 0.05%的羅氏黃液，用無菌手術(shù)刀片在匯合的細胞上輕劃數(shù)條劃痕，靜置5 min，PBS洗去染液，熒光顯微鏡下觀察、拍照，采用Image pro plus圖像分析軟件測定熒光強度。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測 分別取三組細胞，消化離心后調(diào)整濃度為1×109/L，PBS預(yù)冷洗滌3次，70%冰乙醇沉淀細胞，4℃下保存?zhèn)溆茫琍BS洗滌細胞后調(diào)整濃度為1×109/L，與含50 mg/L RNA酶的Tris-HCl緩沖液共孵育40 min。加入10 μl磺化丙啶(PI)染色液，4℃避光反應(yīng)30 min，1 h內(nèi)放入流式細胞儀中檢測。

1.2.4 CCK-8增殖實驗 取指數(shù)生長期細胞，以4×103個/孔濃度接種在96孔細胞培養(yǎng)板，放入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液150 μl，每組設(shè)置5個復孔，對照采用空白培養(yǎng)液孔。于每孔中加入配好的CCK-8 40 μl，放入CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育6 h，放入酶標儀檢測450 nm波長處吸光度值。

1.2.5 Transwell細胞侵襲實驗 Matrigel膠與無血清DMEM培養(yǎng)基按1∶3比例配制基質(zhì)膠，取20 μl涂于Transwell小室，孵育2 h，消化細胞，培養(yǎng)基重懸細胞，上室加入100 μl含5×108個細胞的懸液，下室加入500 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，孵育24 h，用無菌棉簽擦去上室中的基質(zhì)膠和殘余細胞，光學顯微鏡下選取5個視野計數(shù)并拍照。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS15.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 三組Cx26 mRNA的表達情況 研究組條帶明顯增寬，Cx26 mRNA表達量(1.063±0.129)明顯高于對照組和空白組(0.618±0.065、0.602±0.041)(P<0.05)。見圖1。

2.2 三組Cx26 蛋白在細胞中的表達情況 研究組Cx26 蛋白表達條帶明顯增寬，Cx26蛋白表達量(2.631±0.193)明顯高于對照組和空白組(0.691±0.046、0.673±0.069；P<0.05)。見圖2。

2.3 三組細胞間連接通訊變化情況 研究組轉(zhuǎn)染LV-Cx26后的細胞通訊功能明顯強于對照組、空白組，即劃痕細胞中的熒光染料可傳遞到相鄰的3～4列細胞。見圖3。

圖1 RT-PCR檢測三組肝癌HCCLM3細胞中Cx26 mRNA的表達

圖2 Western印跡檢測三組肝癌HCCLM3細胞中Cx26蛋白的表達

圖3 三組肝癌HCCLM3細胞通訊功能情況(×400)

2.4 三組細胞周期檢測情況比較 研究組G0/G1期細胞數(shù)明顯多于對照組和空白組，S期細胞數(shù)明顯少于對照組和空白組(P<0.05)。M期三組細胞數(shù)無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表1。

2.5 三組細胞增殖情況比較 72 h起研究組細胞增殖速度明顯低于同期對照組和空白組(P<0.05)；對照組和空白組各時間點細胞增殖情況均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表2。

2.6 三組細胞體外侵襲力比較 研究組穿膜細胞數(shù)(46.72±5.96)明顯少于對照組和空白組(76.36±5.36、77.85±5.69)(P<0.05)，Cx26基因修飾可明顯降低肝癌HCCLM3細胞的侵襲力。見圖4。

表1 Cx26基因修飾對肝癌HCCLM3細胞周期的影響±s)

與空白組和對照組比較：1)P<0.05；下表同

表2 各時間點三組細胞增殖情況比較±s)

圖4 三組Transwell實驗48 h后結(jié)果(×400)

3 討 論

肝癌多發(fā)于50歲之后的中老年人群，臨床惡性程度很高且預(yù)后極差。研究已發(fā)現(xiàn)，Cx在維持細胞內(nèi)環(huán)境和細胞活動調(diào)控方面發(fā)揮重要作用〔3〕。在多數(shù)腫瘤進展中，常伴隨Cx表達下降，恢復其表達水平有助于抑制腫瘤細胞生長、促進凋亡〔4〕。近年來研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種胃腸道腫瘤中恢復Cx32表達可有效降低病灶的轉(zhuǎn)移和侵襲力〔5〕；肝癌細胞中，過表達Cx32可恢復細胞間隙功能并減弱其侵襲力〔6〕?？梢奀x作為抑癌因素已得到廣泛認可。

本研究提示Cx26基因修飾可有效降低高轉(zhuǎn)移性肝癌組織的惡性生物學行為。但腫瘤的發(fā)病機制十分復雜且處于發(fā)展變化中，因此Cx在腫瘤不同階段的作用可能存在差異。在腫瘤發(fā)展早期，Cx表達可能起到促進病情發(fā)展的作用，但在腫瘤晚期，恢復或出現(xiàn)Cx可能起到重要的腫瘤抑制因子作用。本次研究中選用的HCCLM3細胞屬于晚期肝癌細胞，因此可認為Cx基因修飾是抑制晚期肝癌病情進展的一個有效手段。

綜上所述，Cx26基因表達減少或缺失導致的間隙連接功能喪失在促進腫瘤細胞增殖方面發(fā)揮明顯作用，同時可影響HCCLM3細胞的遷移和侵襲能力。通過LV-Cx26轉(zhuǎn)染HCCLM3細胞可有效降低其惡性生物學行為，為晚期肝癌的治療提供了新的思路。

1 夏照明.間隙連接蛋白26、32、43在原發(fā)性腎上腺腫瘤的表達及其臨床意義〔D〕.廣州：南方醫(yī)科大學，2012.

2 張吉林，常哲興，宋 宇，等.腫瘤患者外周血CD4+和CD8+T淋巴細胞TCR Vβ基因克隆化分析〔J〕.北華大學學報(自然科學版)，2015；16(5)：593-6.

3 Drygin D，Lin A，Bliesath J，etal.Targeting RNA polymerase I with an oral small molecule CX-5461 inhibits ribosomal RNA synthesis and solid tumor growth.〔J〕.Cancer Res，2011；71(4)：1418-30.

4 韓 濤.Shp2調(diào)控肝癌進展的信號網(wǎng)絡(luò)及臨床意義研究〔D〕.上海:第二軍醫(yī)大學，2013.

5 Watanabe E，Buchman TG，Hirasawa H.Association between lymphotoxin-α(tumor necrosis factor-β) intron polymorphism and predisposition to severe sepsis is modified by gender and age〔J〕.Crit Care Med，2010；38(1)：181-93.

6 Zhang J，Grindstaff RD，Thai SFetal.Chloral hydrate decreases gap junction communication in rat liver epithelial cells〔J〕.Cell Biol Toxic，2011；27(3)：207-16.

〔2016-10-22修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

廣東省科學技術(shù)廳計劃項目(No.2016ZC0142)

姜海平(1960-)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，主要從事普通外科研究。

羅超元(1973-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事普通外科研究。

R73

A

1005-9202(2017)02-0284-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.011