小兒腹痛草中獐牙菜苦苷與龍膽苦苷的含量測定

王 麗 陳 芬 符德歡* 高 麗 戚育芳 張曉南

1.云南省藥物研究所、云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心、云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650111； 2.云南中醫(yī)學(xué)院,云南 昆明 650500

小兒腹痛草中獐牙菜苦苷與龍膽苦苷的含量測定

王 麗1陳 芬2符德歡1*高 麗1戚育芳1張曉南1

1.云南省藥物研究所、云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心、云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650111； 2.云南中醫(yī)學(xué)院,云南 昆明 650500

目的：建立小兒腹痛草中獐牙菜苦苷與龍膽苦苷的含量測定方法。方法：色譜柱：Phenomenex luna C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇-水溶液(22：78)；流速：1.0mL/min；檢測波長239nm；柱溫：30℃。結(jié)果：獐牙菜苦苷的線性范圍0.0488～4.875μg(r=0.9998)，平均回收率為99.57%，RSD=3.30%；龍膽苦苷的線性范圍0.0215～2.150 μg(r=0.9995)，平均回收率為97.80%，RSD=2.04%。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，可以作為小兒腹痛草中獐牙菜苦苷與龍膽苦苷的含量測定方法。

小兒腹痛草；獐牙菜苦苷；龍膽苦苷；HPLC；含量測定

小兒腹痛草為龍膽科獐牙菜屬斜莖獐牙菜SwertiapatensBurk.的全草?！缎氯A本草綱要》以伸展獐牙菜之名載其：“全草，味苦，有解痙、止痛、安眠功能。用于小兒功能性腹痛”[1]，云南彝族用其全草治療消化不良、腹痛、牙痛等，且歷史已久[2]。小兒腹痛草生于海拔1100～2500m的石灰?guī)r松林下、石灰?guī)r腐殖質(zhì)土壤中及石灰?guī)r山坡草地，分布于云南中部、東北部及四川南部[3]。小兒腹痛草含獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、齊墩果酸等成分，獐牙菜苦苷主要具有解痙、鎮(zhèn)痛作用；龍膽苦苷具有利膽、抗炎、健胃、降壓等作用，具有較好的開發(fā)前景。為了進(jìn)一步評價(jià)該藥材，將以其所含獐牙菜苦苷及龍膽苦苷為目標(biāo)成分進(jìn)行定量分析研究。據(jù)查閱文獻(xiàn)，目前還未見用高效液相色譜法測定小兒腹痛草中獐牙菜苦苷及龍膽苦苷含量的文獻(xiàn)報(bào)道，本文建立了相應(yīng)的測定方法，為進(jìn)一步深入開發(fā)該藥材提供了一定的理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-2010AHT日本島津高效液相色譜儀，LCsolution工作站；FA2004N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)。

1.2 材料 獐牙菜苦苷(批號：0785-200203，純度98.6%)、龍膽苦苷對照品(批號：110770-200510，純度99%)等購自中國藥品生物制品檢定所。甲醇(色譜純，MERCK，批號：122250)；水為超純水。小兒腹痛草經(jīng)云南省藥物研究所高麗、戚育芳正高級工程師鑒定為斜莖獐牙菜SwertiaPatensBurk.，藥用部位為全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex luna C18(4.6mm×250mm，5m)；流動(dòng)相：甲醇-水溶液(22：78)；流速：1.0mL/min；檢測波長239nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL；理論塔板數(shù)按獐牙菜苦苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000、按龍膽苦苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取獐牙菜苦苷7.8 mg、龍膽苦苷2.15mg分別置于10mL容量瓶中，加甲醇制成0.78mg/L，0.215mg/L的溶液，搖勻，0.45m的微孔濾膜過濾后作為對照品儲(chǔ)備液。

2.3 樣品溶液的制備 取小兒腹痛草藥材細(xì)粉0.2g，精密稱定，加甲醇10mL/每次，超聲2次，每次30min，過濾，合并濾液后定容至25mL，搖勻，即得供試品溶液，0.45 m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液用于測定樣品中龍膽苦苷的含量。

精密移取供試品溶液1mL于10mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45m的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液用于測定樣品中獐牙菜苦苷的含量。

2.4 線性關(guān)系考察 依次精密吸取獐牙菜苦苷、龍膽苦苷對照品儲(chǔ)備液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0mL，分別置于10mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成系列質(zhì)量濃度的對照品溶液。在上述色譜條件下，分別進(jìn)樣10μL，記錄色譜圖以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程獐牙菜苦苷Y=774600X-21622(r=0.9998)，龍膽苦苷Y=1E+0.6X-7700.9(r=0.9995)，獐牙菜苦苷與龍膽苦苷分別在0.04875～4.875 μg(r=0.9998)、0.0215～2.15 μg(r=0.9995)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 分別取濃度為0.195 mg/mL的獐牙菜苦苷，0.086 mg/mL的龍膽苦苷對照品溶液，按選定色譜條件重復(fù)測定6次，結(jié)果獐牙菜苦苷、龍膽苦苷峰面積的RSD分別為0.09%、0.69%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取同一批小兒腹痛草樣品6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算獐牙菜苦苷和龍膽苦苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.63%、2.08%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批樣品，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫放置，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h測定峰面積，計(jì)算獐牙菜苦苷和龍膽苦苷峰面積的RSD分別為0.78%、3.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

2.8.1 獐牙菜苦苷的加樣回收率試驗(yàn) 稱取已測定含量的小兒腹痛草藥材0.2g，3份，每次加甲醇10mL，超聲2次，每次30min，過濾，合并濾液后定容至25mL，搖勻，即得3個(gè)平行供試品溶液。分別移取每份供試品溶液1mL于25mL容量瓶中，每個(gè)供試品溶液3份，共9份，加入獐牙菜苦苷低、中、高3份對照品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算平均回收率為99.57%，RSD為3.30%。見表1。

表1 獐牙菜苦苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8.2 龍膽苦苷的加樣回收率試驗(yàn) 稱取已測定含量的小兒腹痛草藥材0.2g，共9份，加入龍膽苦苷低、中、高3份對照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算平均回收率為97.80%，RSD為2.04%。見表2。

表2 龍膽苦苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測定 精密稱取兩個(gè)產(chǎn)地小兒腹痛草藥材粉末0.2g，每個(gè)產(chǎn)地三份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依照上述色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見圖1～4，表3。

表3 樣品測定結(jié)果 (n=2)

3 討論

3.1 提取方法選擇 分別選擇了冷浸法(甲醇冷浸過夜)，超聲法(甲醇超聲30min)，熱浸法(甲醇回流30min)三種提取方法提取樣品，結(jié)果超聲提取時(shí)兩種苦苷的含量高于冷浸法和熱浸法，故選擇超聲提取。

3.2 提取溶劑選擇 分別選擇以甲醇、95%乙醇、75%乙醇為溶劑超聲提取樣品，結(jié)果甲醇提取時(shí)提取率較乙醇提取時(shí)高，故選擇甲醇為提取溶劑，這與獐牙菜屬常用提取溶劑相吻合。

3.3 提取時(shí)間考察 分別考察了甲醇超聲提取15、30、45min時(shí)對樣品中兩種苦苷含量的影響，結(jié)果與提取15min相比，提取30min時(shí)兩種苦苷的含量明顯增加，但與提取45min時(shí)相差不大，故選擇30min的提取時(shí)間。

3.4 提取次數(shù)考察 在甲醇超聲提取30min的前提下，考察其提取次數(shù)對兩種苦苷含量的影響，結(jié)果2次與3次相差不大，結(jié)果確定為2次。

通過對小兒腹痛草中獐牙菜苦苷和龍膽苦苷含量的測定，發(fā)現(xiàn)小兒腹痛草中獐牙菜苦苷的含量較高，高達(dá)24.175%。根據(jù)已報(bào)道文獻(xiàn)，該屬植物中獐牙菜苦苷含量在0.091%～13.137%之間不等。

獐牙菜苦苷能明顯抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有顯著的鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜作用，而獐牙菜的鎮(zhèn)痛和解痙作用是獐牙菜苦苷治療胃腸道疼痛的藥理基礎(chǔ)[4]。測定獐牙菜苦苷的含量，在一定程度上揭示小兒腹痛草是一味很好的止痛藥。目前，以小兒腹痛草為主成分的中藥制劑甚少，本文的研究可為以后更好的開發(fā)利用該藥材提供部分理論依據(jù)。

[1]吳征鎰.新華本草綱要(第二冊)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1991.

[2] 梁鉅忠，雷偉亞.云南民族藥斜莖獐牙菜的實(shí)驗(yàn)研究[J].云南醫(yī)藥，1984，5(2)：107-108 .

[3] 羅開均.彝族藥“落孺疴”原植物的研究[J].中藥通報(bào)，1984，9(5)：11-12.

[4] 郭愛華.龍膽科獐牙菜屬藥用植物化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展[J].山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，6(1)：57-59 .

(編輯：陶希睿)

Determination of the Content of National Medicine inSwertiapatensof Swertiamarin and Gentiopicroside

WANG Li1CHEN Fen2FU Dehuan1*GAO Li1QI Yufang1ZHANG Xiaonan1

1.Yunnan Institute of Materia Medica/ Yunnan Bai Yao Group Innovation and R&D Center Yunnan Province Company/Key Laboratory for TCM and Ethnic Drug of New Drug Creation,Kunming 650111,China;2.Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Kunming 650500,China

Objective To estebulish a HPLC method for the determination ofSwertiapatens.Methods The analysis was carried out on all analytical column C18(4.6mm×250mm, 5μm) .Mobile phase was methyl alcohol-water(22：78).The flow rate was 1.0 ml·min-1and the detective wavelength was set at 239nm with column temperature of 30℃．Rusults The linear range was 0.0488～4.875μg(r=0.9998)and the average recovery was 99.57% with theRSDof 3.30% for swertiamrin.The linear range was 0.0215～2.150μg(r=0.9995)and the average recovery was 97.80%with theRSDof 2.04% for Gentiopicroside.Conclution This method was accurate and reliable.It can be used for determination of swertiamrin and Gentiopicroside in the Swertia patens.

SwertiaPatens；Swertiamrin；Gentiopicroside；HPLC；Determination of Content

2016-10-31

王麗(1983-)，女，工程師，主要從事中藥材質(zhì)量評價(jià)研究，E-mail：liwangshengyao@163.com

符德歡(1976-)，男，高級工程師，主要從事天然藥物、民族藥資源調(diào)研與藥材鑒定。 E-mail：fudehuan@126.com

R283

A

1007-8517(2017)02-0035-03