4種冠心病氣虛血瘀證大鼠模型建立方法的比較

黃爍　劉建勛　李磊　楊斌　許晴　王瓊

[摘要] 對(duì)單純結(jié)扎冠狀動(dòng)脈、控制飲食復(fù)合結(jié)扎冠狀動(dòng)脈、疲勞跑步復(fù)合結(jié)扎冠狀動(dòng)脈、控制飲食+疲勞跑步雙因素復(fù)合結(jié)扎冠狀動(dòng)脈4種方法建立的冠心病氣虛血瘀證病證結(jié)合大鼠模型進(jìn)行比較。該實(shí)驗(yàn)選用Wistar雄性大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組（SHAM）、單純結(jié)扎冠脈組（L）、控制飲食復(fù)合結(jié)扎冠狀動(dòng)脈組（DL）、疲勞跑步復(fù)合結(jié)扎冠狀動(dòng)脈組（EL）、控制飲食+疲勞跑步雙因素復(fù)合結(jié)扎冠脈組（DEL）。L組進(jìn)行單純冠脈結(jié)扎；DL組通過(guò)2周控制飲食造成脾胃氣虛為主的全身氣虛大鼠模型，在此基礎(chǔ)上結(jié)扎冠脈，術(shù)后繼續(xù)控制飲食；EL組通過(guò)2周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)造成大鼠全身氣虛模型，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行冠脈結(jié)扎，術(shù)后以1次/2 d的頻率維持力竭跑步；DEL組通過(guò)2周控制飲食、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)造成大鼠全身氣虛模型，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行冠脈結(jié)扎，術(shù)后繼續(xù)控制飲食并以1次/2 d的頻率維持力竭跑步；于術(shù)后4周觀察大鼠宏觀體征，分別采集大鼠超聲心動(dòng)檢測(cè)指標(biāo)、呼吸幅度對(duì)大鼠冠心病氣虛血瘀證的主癥進(jìn)行評(píng)價(jià)；采集空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)相關(guān)指標(biāo)、力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間、足底圖像色彩飽和度對(duì)兼癥進(jìn)行評(píng)價(jià)；采集舌面色彩飽和度對(duì)舌象進(jìn)行評(píng)價(jià)；采集脈搏搏動(dòng)幅度對(duì)脈象進(jìn)行評(píng)價(jià)。同時(shí)對(duì)腦鈉肽、內(nèi)皮素等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示術(shù)后4周，通過(guò)疲勞運(yùn)動(dòng)復(fù)合結(jié)扎冠脈方法建立的模型與其他3種方法建立的模型比較與臨床病因?qū)W基礎(chǔ)以及與中醫(yī)相關(guān)理論體系的聯(lián)系更密切，在完整體現(xiàn)中醫(yī)證候的特征方面具有一定的優(yōu)勢(shì)，更符合臨床實(shí)際發(fā)病的原因與特征，是一種條件可控、重復(fù)性好的冠心病氣虛血瘀證病證結(jié)合大鼠模型。

[關(guān)鍵詞] 冠心?。?病證結(jié)合； 氣虛血瘀證； 動(dòng)物模型

Comparison of 4 types of coronary heart disease model of

Qideficiency and bloodstasis syndrome in rats

HUANG Shuo1， LIU Jianxun1*， LI Lei1， YANG Bin1， XU Qing2， WANG Qiong3

（1. Institute of Basic Medical Sciences of Xiyuan Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences，

Beijing Key Laboratory of Pharmacology of Chinese Materia Medica， Beijing 100091， China；

2. Core Facilities for Electrophysiology， Core Facilities Center， Capital Medical University， Beijing 100069， China；

3. Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Science and Peking Union

Medical College， Beijing 100193， China）

[Abstract] This paper was aimed to establish a method for coronary heart disease in rats with Qideficiency and blood stasis of the stable by comparing different model establishment methods （L group： ligation of coronary artery， EL group： exercise fatigue combine ligation of coronary artery， DL group： diet combine ligation of coronary artery， DEL group： diet， exercise fatigue combine ligation of coronary artery）. After 6 weeks postoperatively， both the method of L （ligation of coronary artery） and DL， EL， DEL （multioriginated information complex） could be successfully established by coronary heart disease model of Qideficiency and bloodstasis syndrome type in rats. Model set up by using the compound factors （DL， EL， DEL）， and through simple ligation of coronary artery to build model （L） to compare the clinical etiology and linked， DL， EL and DEL were more closely with relevant theoretical system of traditional Chinese medicine （TCM） and have a certain advantage in complete reflect the characteristics of TCM syndrome. Among three kinds of compound factors model， EL model compared with other two models DL and DEL was more consistent with clinical practical reasons and characteristics of the disease. Through EL the CHD deficiency of blood stasis rat model of combined disease could be controlled and good repeated.

[Key words] coronary heart disease； diseasesyndrome combination； Qideficiency and bloodstasis； animal model

doi：10.4268/cjcmm20162222

冠心?。╟oronary heart disease，CHD）是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的簡(jiǎn)稱，亦稱為缺血性心臟病。心血管疾病是目前導(dǎo)致人類死亡與殘疾的三大主要疾病之首，嚴(yán)重危害人類健康。祖國(guó)醫(yī)學(xué)雖無(wú)冠心病的病名，但根據(jù)癥狀多屬于中醫(yī)學(xué)的“胸痹”、“真心痛”、“厥心痛”等范疇。冠心病中醫(yī)證型按虛實(shí)均可歸為本虛標(biāo)實(shí)、本虛和標(biāo)實(shí)三大類。本虛標(biāo)實(shí)屬常見(jiàn)證型，近年我國(guó)人民生活方式的改變導(dǎo)致氣虛、血瘀2種證候要素在冠心病證候要素中所占比例逐漸升高。

目前對(duì)于冠心病氣虛血瘀證動(dòng)物模型的研究已經(jīng)有了一些進(jìn)展，但在造模方法以及模型評(píng)價(jià)體系上仍然不夠成熟與臨床差距較大，尚無(wú)公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)范化的模型建立和評(píng)價(jià)方法。本文依據(jù)中醫(yī)對(duì)冠心病氣虛血瘀證的病機(jī)認(rèn)識(shí)，在既往實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)之上，通過(guò)比較4種模型建立方法嘗試得出一種穩(wěn)定性高、重復(fù)性好的動(dòng)物模型。

1 材料

正常雄性Wistar大鼠124只，體重（100±10） g，清潔級(jí)，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可編號(hào)SCXK（京）20120001。

高分辨率小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)Vevo 2100（加拿大VisualSonics公司探頭型號(hào)MS250）；MouseOx小動(dòng)物無(wú)創(chuàng)脈搏血氧儀（美國(guó)Starr Life Sciences Inc公司）；NikonD90單反相機(jī)；臺(tái)灣TES1330A數(shù)位式照度計(jì)；中國(guó)航天員訓(xùn)練中心和中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所聯(lián)合研制開(kāi)發(fā)的空?qǐng)鲇?jì)算機(jī)圖像實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分析系統(tǒng)； LHPT動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司）； VIP3000小動(dòng)物麻醉機(jī)（美國(guó)Matrx）； MS352型酶標(biāo)儀（芬蘭LabsystemsMultiskan）； AC8型洗板機(jī)（芬蘭Thermo Labsystems）。

腦鈉肽（BNP）含量檢測(cè)試劑盒（北京安迪華泰科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)HTLN30415）；N端腦鈉肽前體（NTproBNP）含量檢測(cè)試劑盒（北京安迪華泰科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)HTLN30413）；內(nèi)皮素（ET）含量檢測(cè)試劑盒（北京安迪華泰科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)HTLC30315）；一氧化氮（NO）含量檢測(cè)試劑盒（北京安迪華泰科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)HTLC30168）；血栓素B2（TXB2）含量檢測(cè)試劑盒（北京安迪華泰科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)HTLC30156）；6酮前列腺素F1α（6ketoprostaglandin F1 alpha）含量檢測(cè)試劑盒（北京安迪華泰科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)HTLN04206）。

異氟烷（100 mL/瓶，魯南貝特制藥有限公司，批號(hào)H20020267）；注射用青霉素鈉（400萬(wàn)U/支，華北制藥股份有限公司，批號(hào)F5128506）；鹽酸利多卡因注射液（5 mL，0.1 g/支，中國(guó)大冢制藥有限公司，批號(hào)5J88J1）。

2 方法

2.1 分組

實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)條件：溫度22～25 ℃，濕度40%～55%，大鼠隨意飲食飲水。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 d后，進(jìn)行2 d的適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練，每天1次，每次15～30 min。當(dāng)大鼠能夠以20 m·min-1持續(xù)跑30 min，開(kāi)始進(jìn)行模型的建立。淘汰不能完成上述運(yùn)動(dòng)的大鼠[1]。將動(dòng)物隨機(jī)分成6組：A.空白組（CON，n=8）；B.假手術(shù)組（SHAM，n=8）；C.單純結(jié)扎冠脈模型組（L，n=8）；D.多因素復(fù)合模型組，d1.疲勞運(yùn)動(dòng)復(fù)合結(jié)扎冠脈模型組（EL，n=15），d2.控食復(fù)合結(jié)扎冠脈模型組（DL，n=15），d3.控食、疲勞運(yùn)動(dòng)雙因素復(fù)合結(jié)扎冠脈模型組（DEL，n=15）。

2.2 模型制備

2.2.1 心肌梗死造模方法 參照文獻(xiàn)[2]方法，大鼠用小動(dòng)物麻醉機(jī)維持麻醉狀態(tài)（氧氣壓強(qiáng)0.1 MPa，氧氣流量300 mL·min-1，麻醉藥物濃度2%）。用止血鉗撐開(kāi)大鼠左側(cè)第3，4肋間隙，輕微按壓胸廓擠出心臟，用0號(hào)手術(shù)線結(jié)扎左冠脈前降支根部，結(jié)扎后心臟表面立刻給予利多卡因注射液2～3滴，立即將心臟放回胸腔，排出進(jìn)入胸腔空氣，縫合皮膚。關(guān)胸后立刻注射青霉素0.1～0.2 mL。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎，其余步驟同手術(shù)組。

2.2.2 大鼠運(yùn)動(dòng)疲勞模型建立方法 參考文獻(xiàn)[34]使大鼠在跑臺(tái)水平狀態(tài)中進(jìn)行每天1次為期2周中等強(qiáng)度的跑步運(yùn)動(dòng)，造模實(shí)驗(yàn)方案見(jiàn)表1。

2.2.3 大鼠控制飲食方法 參考文獻(xiàn)[56]和前期預(yù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，給予大鼠每天正常進(jìn)食量的1/2（約為13 g·d-1），不限制飲水。

2.2.4 術(shù)后疲勞運(yùn)動(dòng)方法 手術(shù)恢復(fù)3 d后開(kāi)始讓大鼠進(jìn)行力竭運(yùn)動(dòng)（速度20 m·min-1，頻率1次/2 d）。

2.3 疾病特征的評(píng)價(jià)

2.3.1 超聲心動(dòng)圖檢測(cè) 6周造模結(jié)束后利用異氟烷維持大鼠麻醉狀態(tài)后[維持大鼠心率在（350±20） bpm]，對(duì)大鼠胸部左側(cè)鎖骨至肋骨下緣進(jìn)行備皮處理。在左室長(zhǎng)軸及胸骨旁短軸各切面進(jìn)行二維掃查，選用左室短軸切面M超測(cè)量計(jì)算左室收縮末內(nèi)徑（LVID；s），左室舒張末內(nèi)徑（LVID；d），左室收縮末容積（LV Vol；s），左室舒張末容積（LV Vol；d），射血分?jǐn)?shù)（EF），短軸縮短率（FS），各項(xiàng)指標(biāo)均連續(xù)測(cè)量5個(gè)周期，取平均值。

2.3.2 生物學(xué)標(biāo)志物腦鈉肽（BNP）和N端腦鈉肽前體（NTproBNP）含量測(cè)

定 6周造模結(jié)束后在大鼠麻醉狀態(tài)下進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，血液室溫放置20 min，1 800×g離心20 min，取上層血清備用。采用ELISA方法測(cè)定各組大鼠血清中BNP和NTproBNP含量。

2.4 證候評(píng)價(jià)

收集模型的四診信息，參照臨床證候評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，從模型的宏觀表現(xiàn)、疾病信息以及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)等多角度對(duì)模型進(jìn)行證候評(píng)價(jià)，增加了模型的可信度，從而避免了對(duì)模型進(jìn)行主觀認(rèn)證的缺陷。參照《中藥、天然藥物藥治療冠心病心絞痛的臨床研究指導(dǎo)原則》（2002年版）， 氣虛血瘀證中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)：胸痛胸悶，心悸氣短，身倦乏力，面色紫暗，舌淡紫，弱脈而澀。同時(shí)考慮到動(dòng)物本身特點(diǎn)，制定大鼠冠心病氣虛血瘀證中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)。

2.4.1 一般狀態(tài)觀察（毛發(fā)、精神狀態(tài)、體重等） 6周造模結(jié)束后在安靜環(huán)境下對(duì)動(dòng)物進(jìn)行觀察測(cè)量。

2.4.2 主癥（胸痛胸悶、心悸氣短） 超聲心動(dòng)圖指標(biāo)包括射血分?jǐn)?shù)（EF）、短軸縮短率（FS）、呼吸幅度。超聲心動(dòng)圖檢測(cè)方法同2.3.1項(xiàng)。呼吸幅度測(cè)定方法：6周造模結(jié)束后利用2%異氟烷維持大鼠麻醉狀態(tài)后，利用MouseOx小動(dòng)物無(wú)創(chuàng)脈搏血氧儀對(duì)大鼠呼吸幅度進(jìn)行檢測(cè)。記錄每只動(dòng)物連續(xù)30個(gè)有效數(shù)據(jù)，取平均值。

2.4.3 兼癥（身倦乏力、面色紫暗） 大鼠空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)：6周造模結(jié)束后進(jìn)行，空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)室保持安靜，室內(nèi)暗光，實(shí)驗(yàn)人員位置以操作角度無(wú)法觀測(cè)到箱中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為準(zhǔn)?？?qǐng)鰷y(cè)試箱直徑80 cm，高50 cm，內(nèi)壁與底部涂黑。實(shí)驗(yàn)前，將動(dòng)物在測(cè)定房間中適應(yīng)10 min。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)捏住大鼠尾巴距根部1/2處放入測(cè)試箱底部中心，顯示器中觀察動(dòng)物10 min內(nèi)活動(dòng)情況，每次測(cè)定結(jié)束后將動(dòng)物排泄物清理干凈，并用酒精擦拭箱底驅(qū)散氣味。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后利用軟件進(jìn)行錄像分析。描繪動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡，測(cè)量動(dòng)物運(yùn)動(dòng)距離、平均速度、運(yùn)動(dòng)時(shí)間。

力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間測(cè)定：6周造模結(jié)束后將大鼠放進(jìn)小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)（跑臺(tái)速度25 m·min-1，電擊強(qiáng)度1.5 mA）進(jìn)行力竭跑步測(cè)試。以大鼠3 s內(nèi)被連續(xù)電擊5次仍無(wú)法跑步為標(biāo)準(zhǔn)判斷是否力竭。記錄時(shí)間。

足底圖像采集（統(tǒng)一右側(cè)后肢足底）及色彩飽和度分析：6周造模結(jié)束后參照文獻(xiàn)方法[7]，在動(dòng)物房利用色溫5500K柔光箱進(jìn)行布光，根據(jù)國(guó)際照明委員會(huì)CIE推薦的標(biāo)準(zhǔn)照明和觀測(cè)條件，采用45/0（照明/觀察）的照明幾何條件安排光路。光源照度測(cè)量采用臺(tái)灣泰仕TES1330A 照度計(jì)，舌面處照度范圍控制在1 500～2 000 lx（勒克斯）。圖片采集應(yīng)用尼康D90數(shù)碼單鏡反光相機(jī)，聯(lián)合尼康A(chǔ)FS微距尼克爾60 mm f/2.8GED鏡頭，相機(jī)用三腳架固定，鏡頭與足底距離15 cm。應(yīng)用灰卡手動(dòng)設(shè)定白平衡，圖像采集時(shí)選用相機(jī)手動(dòng)（M）檔，自動(dòng)對(duì)焦，以光圈F8，快門1/80 s，ISO 400 的條件采集足底圖像。拍照時(shí)保證比色卡與足底在同一平面，足底照片以JPG格式輸出。圖像采集后利用Adobe Photoshop CS5軟件選取足底區(qū)域3點(diǎn)，讀取像素區(qū)域R（紅色）、G（綠色）及B（藍(lán)色）分量值。

2.4.4 舌象（舌淡紫） 舌面色澤深淺（RGB值）舌面圖像采集及色彩飽和度分析方法同足底采集分析方法。

2.4.5 脈象（弱脈而澀） 脈搏幅度測(cè)定方法：6周造模結(jié)束后利用2%異氟烷維持大鼠麻醉狀態(tài)后，利用MouseOx小動(dòng)物無(wú)創(chuàng)脈搏血氧儀對(duì)大鼠脈搏幅度進(jìn)行檢測(cè)。記錄每只動(dòng)物連續(xù)30個(gè)有效數(shù)據(jù)，取平均值。

2.5 生物學(xué)相關(guān)指標(biāo)評(píng)價(jià)

內(nèi)皮素（ET）、一氧化氮（NO）、血栓素B2（TXB2）、6酮前列腺素F1α（6ketoPGF1α）含量測(cè)定：采用ELISA方法對(duì)各組大鼠血清中上述指標(biāo)含量進(jìn)行測(cè)定，操作方法按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2.6 心肌病理組織檢查

2.6.1 大鼠心肌MASSON染色 心臟切片脫蠟至水，經(jīng)過(guò)天青石藍(lán)，Mayer 氏蘇木素，麗春紅苦味酸，1% 淡綠等染色后，再脫水，樹膠封固。顯微鏡下觀察，膠原纖維染為藍(lán)色，胞核染為藍(lán)黑色，肌纖維染為紅色。

2.6.2 大鼠心肌HE染色 大鼠心肌組織放于4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，切片（5 μm），蘇木精伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌結(jié)構(gòu)。

2.6.3 電鏡觀察 取大鼠心肌梗死部位，以電鏡液固定，電鏡下觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)病理變化。

2.7 統(tǒng)計(jì)方法

統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)獲得的各數(shù)據(jù)以±s表示。若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布方差齊用LSD檢驗(yàn)，反之用Tamhane′s T2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般狀態(tài)變化情況

6周造模結(jié)束后，除CON和SHAM以外，其余各組大鼠精神萎靡，被毛枯黃失去光澤，活動(dòng)度降低，喜歡聚攏在一起，嗜睡，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，稀便，大鼠鼻尖、口唇、掌心、舌面與SHAM比較，均發(fā)生不同程度的變紫變暗；SHAM體重與CON比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 DL，EL，DEL與SHAM比較體重顯著下降（P<0.01），L與SHAM比較體重下降但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； DL，EL，DEL與L比較體重顯著下降（P<0.05，P<0.01），見(jiàn)表2。

3.2 大鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)

3.2.1 射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率 6周造模結(jié)束后，SHAM射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率與CON比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DL，EL，DEL，L與SHAM比較射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率顯著下降（P<0.01），DL，DEL與L比較短軸縮短率顯著下降（P<0.01），EL與L比較短軸縮短率下降但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，DL，EL，DEL與L比較射血分?jǐn)?shù)顯著下降（P<0.05，P<0.01），見(jiàn)表3。

3.2.2 左室舒張（和收縮）末內(nèi)徑 6周造模結(jié)束后，SHAM左室舒張（和收縮）末內(nèi)徑與CON比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DL，EL，DEL，L與SHAM比較左室舒張末內(nèi)徑、左室收縮末內(nèi)徑顯著擴(kuò)大（P<0.01）；DL，EL，DEL與L比較左室舒張末內(nèi)徑、左室收縮末內(nèi)徑顯著擴(kuò)大（P<0.05，P<0.01），見(jiàn)表3。

3.2.3 左室舒張（和收縮） 末容積 6周造模結(jié)束后，SHAM左室舒張（和收縮）末容積與CON比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DL，EL，DEL，L與SHAM比較左室舒張末容積、左室收縮末容積顯著擴(kuò)張（P<0.01）；DL，EL，DEL與L比較左室舒張末容積顯著擴(kuò)張（P<0.05，P<0.01），左室收縮末容積擴(kuò)張但均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。

3.3 大鼠呼吸幅度檢測(cè)

6周造模結(jié)束后，SHAM呼吸幅度與CON比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DL，EL，DEL，L與SHAM比較，呼吸幅度顯著下降（P<0.01）；DL，EL，DEL與L比較，呼吸幅度顯著下降（P<0.01），見(jiàn)表4。

3.4 大鼠空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

3.4.1 平均速度 6周造模結(jié)束后，SHAM平均速度與CON比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DL，DEL與SHAM比較，平均速度顯著下降（P<0.05）；EL，L與SHAM比較，平均速度下降但均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DL，DEL與L比較，平均速度下降但均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，EL與L比較，平均速度上升但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表5。

3.4.2 運(yùn)動(dòng)路程 6周造模結(jié)束后，SHAM運(yùn)動(dòng)路程與CON比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DL，DEL與SHAM比較，運(yùn)動(dòng)路程顯著下降（P<0.05）；EL，L與SHAM比較，運(yùn)動(dòng)路程下降但均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DL，DEL與L比較，運(yùn)動(dòng)路程下降但均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，EL與L比較，運(yùn)動(dòng)路程上升但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表5。

3.4.3 運(yùn)動(dòng)時(shí)間 6周造模結(jié)束后，SHAM運(yùn)動(dòng)時(shí)間與CON比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DEL與SHAM比較，運(yùn)動(dòng)時(shí)間顯著下降（P<0.01）； DL，EL，L與SHAM比較，運(yùn)動(dòng)時(shí)間下降但均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； DL，EL，DEL與L比較運(yùn)動(dòng)時(shí)間下降但均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表5。

3.5 大鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間檢測(cè)

6周造模結(jié)束后，SHAM力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間與CON比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DL，EL，DEL，L與SHAM比較力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間顯著下降（P<0.01）；DL，DEL與L比較力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間顯著下降（P<0.01），EL與L比較力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間下降但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表6。

3.6 大鼠足底圖片分析

6周造模結(jié)束后，SHAM足底色彩飽和度與CON比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DL，EL，DEL，L與SHAM比較，足底R(shí)，G，B值顯著下降（P<0.01）；

DL與L比較足底R(shí)值顯著下降（P<0.05），足底G值下降但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； EL與L比較足底R(shí)，G值下降但均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DEL與L比較足底R(shí)，G值顯著下降（P<0.01），B值下降但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表7。

3.7 大鼠舌面圖片分析

6周造模結(jié)束后，SHAM舌面色彩飽和度與CON比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DL，EL，DEL，L與SHAM比較，舌面R，G，B值顯著下降（P<0.01，P<0.05）； DL與L比較，舌面R，G值下降但均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； EL與L比較，舌面G，B值下降但均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； DEL與L比較，舌面R，G，B值顯著下降（P<0.01，P<0.05），見(jiàn)表8。

3.8 大鼠脈搏幅度檢測(cè)

6周造模結(jié)束后，SHAM脈搏幅度與CON比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DL，EL，DEL，L與SHAM比較，脈搏幅度顯著下降（P<0.01）；DL，EL，DEL與L比較，脈搏幅度顯著下降（P<0.01），見(jiàn)表9。

3.9 血清腦鈉肽檢測(cè)

6周造模結(jié)束后，SHAM血清BNP含量與CON比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DL，EL，DEL，L與SHAM比較，血清BNP含量顯著升高（P<0.01）； DL，EL，DEL與L比較，血清BNP含量顯著升高（P<0.01），見(jiàn)表10。

3.10 血清N端腦鈉肽前體檢測(cè)

6周造模結(jié)束后，SHAM血清NTproBNP含量與CON比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DL，EL，DEL，L與SHAM比較，血清NTproBNP含量顯著升高（P<0.01）；DL，DEL與L比較，血清NTproBNP含量顯著降低（P<0.01），EL與L比較，血清NTproBNP含量上升但是不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表11。

3.11 血清內(nèi)皮素檢測(cè)

6周造模結(jié)束后，SHAM血清ET含量與CON比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DL，EL，DE，L與SHAM比

3.12 血清一氧化氮檢測(cè)

6周造模結(jié)束后，SHAM血清NO含量與CON比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DL，EL，DEL，L與SHAM比較，血清NO含量顯著下降（P<0.01）； DL，DEL與L比較，血清NO含量顯著下降（P<0.01），EL與L比較，血清NO含量上升但是不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表13。

3.13 血清6酮前列腺素F1α/血栓素B2比值

6周造模結(jié)束后，SHAM血清6KetoPGF1α/TXB2比值與CON比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DL，EL，DEL與SHAM比較，血清6KetoPGF1α/TXB2比值顯著下降（P<0.05，P<0.01）；L與CON比較血清6KetoPGF1α/TXB2比值下降但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DL，EL，DEL與L比較，血清6KetoPGF1α/TXB2比值顯著下降（P<0.01），見(jiàn)表14。

3.14 心肌病理組織檢查

3.14.1 心肌MASSON染色 CON，SHAM心肌染色以紅色的心肌細(xì)胞為主， 心肌組織分布均勻，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列整齊，心肌細(xì)胞間質(zhì)和周圍血管無(wú)明顯藍(lán)色膠原纖維；其余各模型組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂、肥大，大量心肌細(xì)胞被膠原纖維代替，心肌纖維化嚴(yán)重，見(jiàn)圖1。

3.14.2 心肌HE染色 CON，SHAM心肌細(xì)胞形態(tài)及間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常；其余各模型組大鼠心肌橫紋消失，肌束斷裂，大部分細(xì)胞膜不完整，胞漿混濁，間質(zhì)內(nèi)炎性滲出明顯，心肌纖維間有大量結(jié)締組織增生，見(jiàn)圖2。

3.14.3 電鏡觀察 CON，SHAM心肌結(jié)構(gòu)正常，肌絲排列有序且比較整齊；其余各模型組肌絲部分溶合，肌節(jié)排列不完整，肌纖維間大量膠原纖維增生，線粒體水腫、嵴膜溶合，見(jiàn)圖3。

4 討論

4.1 4種建立模型方法的比較

本研究應(yīng)用4種不同的方法，探討影響建立冠心病氣虛血瘀證大鼠模型的干預(yù)因素和控制方法。結(jié)果顯示單純通過(guò)結(jié)扎冠脈方法（L）建立的模型在心臟功能、運(yùn)動(dòng)功能、脈搏幅度、呼吸幅度、舌面與足底色彩飽和度、血管活性物質(zhì)釋放均有明顯的影響，使心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，射血能力減弱，力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間縮短，活動(dòng)能力下降，呼吸及脈搏幅度減弱，舌面與足底色彩飽和度降低，血管內(nèi)皮功能發(fā)生障礙，心肌組織發(fā)生病理性改變，而對(duì)體重有影響但是不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)復(fù)合因素（DL，EL，DEL）建立的模型對(duì)上述主要指標(biāo)均有更為明顯的影響。利用單純高位結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支建立的冠心病氣虛血瘀證大鼠模型雖然在證候上表現(xiàn)出了心氣虛證與血瘀證的相關(guān)特點(diǎn)比如心功能下降，運(yùn)動(dòng)能力變差，掌心色彩飽和度下降等。但這種模型的建立方法均與特異的病理變化關(guān)聯(lián)，只能夠反映臨床病理表現(xiàn)的一個(gè)方面，缺少臨床病因?qū)W基礎(chǔ)，與中醫(yī)相關(guān)理論體系缺乏聯(lián)系，很難完整體現(xiàn)出中醫(yī)證候的特征，出現(xiàn)的病理狀態(tài)并不能夠與特定的中醫(yī)證候?qū)Φ?。相比較之下本研究利用復(fù)合因素方法建立的冠心病氣虛血瘀證大鼠模型則更具有優(yōu)勢(shì)，模型在冠心病氣虛血瘀中醫(yī)證候的表現(xiàn)上更加顯著。在3種復(fù)合因素（疲勞運(yùn)動(dòng)+結(jié)扎冠脈，控食+結(jié)扎冠脈，疲勞運(yùn)動(dòng)、控食雙因素+結(jié)扎冠脈）建立模型的方法當(dāng)中，雖然通過(guò)疲勞運(yùn)動(dòng)、控食雙因素復(fù)合結(jié)扎冠脈（DEL）這種方法建立的模型與疲勞運(yùn)動(dòng)復(fù)合結(jié)扎冠脈（EL）、控食復(fù)合結(jié)扎冠脈（DL）這2種方法建立的模型在一些相關(guān)指標(biāo)以及證候特征上比較表現(xiàn)更為顯著，但是考慮到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的耐受性有限，干預(yù)因素刺激過(guò)于強(qiáng)烈的時(shí)候會(huì)造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡，模型成活率偏低，不利于相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究的展開(kāi)。疲勞運(yùn)動(dòng)復(fù)合結(jié)扎冠脈（EL）的方法遵循中醫(yī)病因病機(jī)

“血瘀多由日久氣虛所致，血瘀進(jìn)一步阻滯氣機(jī)致虛”，先通過(guò)呈梯度遞增強(qiáng)度的跑步運(yùn)動(dòng)使大鼠處于疲勞狀態(tài)，模擬人體生理上呈現(xiàn)出的疲勞狀態(tài)，正氣消耗開(kāi)始出現(xiàn)氣虛證的表現(xiàn)；在此基礎(chǔ)上結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈前降支，模擬人體心肌梗死的發(fā)生，日久氣虛導(dǎo)致心脈瘀阻；術(shù)后維持一定強(qiáng)度的跑步運(yùn)動(dòng)，繼續(xù)模擬人類正氣的消耗，由心肌梗死導(dǎo)致心力衰竭過(guò)程的發(fā)生，伴隨氣虛血瘀癥候的出現(xiàn)，與控食復(fù)合結(jié)扎冠脈（DL）的方法相比更符合臨床實(shí)際發(fā)病的原因與特征。

在建立大鼠運(yùn)動(dòng)型疲勞狀態(tài)的方法上常用的有跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)[8]、游泳[9]、轉(zhuǎn)籠運(yùn)動(dòng)[10]、轉(zhuǎn)棒運(yùn)動(dòng)[11]、曠野運(yùn)動(dòng)[12]、爬繩運(yùn)動(dòng)[13]等方法。本研究選用跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)主要是由于跑步是大鼠本能的一種運(yùn)動(dòng)方式，符合哺乳類動(dòng)物的特點(diǎn)，而且在運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的控制上可以量化把握。大鼠初次在跑臺(tái)上進(jìn)行跑步運(yùn)動(dòng)時(shí)，會(huì)由于空間密閉，電流刺激出現(xiàn)恐慌、驚亂等情況，影響運(yùn)動(dòng)過(guò)程，因此在疲勞運(yùn)動(dòng)模型開(kāi)始建立之前，要對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，淘汰掉不能正常完成跑步運(yùn)動(dòng)的大鼠。此外，在對(duì)跑臺(tái)速度進(jìn)行設(shè)置時(shí)，不要一次性調(diào)節(jié)到最大速度值，不然會(huì)對(duì)大鼠造成驚嚇從而無(wú)法順利完成跑步，應(yīng)該使跑臺(tái)速度呈梯度升高，使大鼠逐漸適應(yīng)速度的提升。在采集大鼠足底和舌面圖像時(shí)，需要盡量保持客觀條件的穩(wěn)定性，比如采集環(huán)境安靜、采集時(shí)間固定、采集光源固定，控制好圖像拍攝時(shí)的角度以及距離，而且在采集圖像時(shí)使用標(biāo)準(zhǔn)比色卡，這樣在后期對(duì)圖片資料進(jìn)行處理時(shí)能保證均一化。

4.2 動(dòng)物疾病證候診斷研究

本研究收集模型的四診信息，參照臨床證候評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，從模型的宏觀表現(xiàn)、疾病信息以及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)等多角度對(duì)模型進(jìn)行證候評(píng)價(jià)，增加了模型的可信度，從而避免了對(duì)模型進(jìn)行主觀認(rèn)證的缺陷。參照《中藥、天然藥物藥治療冠心病心絞痛的臨床研究指導(dǎo)原則》（2002年版）， 氣虛血瘀證中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)：胸痛胸悶，心悸氣短，身倦乏力，面色紫暗，舌淡紫，弱脈而澀；同時(shí)考慮到動(dòng)物本身特點(diǎn)，制定大鼠冠心病氣虛血瘀證中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)如下。主癥（胸痛胸悶，心悸氣短）：用反映心臟功能的超聲心動(dòng)圖指標(biāo)診斷是否胸痛胸悶；用呼吸幅度診斷是否心悸氣短。兼癥（身倦乏力、面色紫暗）：用反映大鼠運(yùn)動(dòng)能力的空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)指標(biāo)、力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間診斷是否身倦乏力；由于大鼠面部圖像采集以及分析存在一定困難，而大鼠足底圖像方便采集且色澤變化較為明顯所以用足底圖像色彩飽和度來(lái)診斷是否面色紫暗。舌象（舌淡紫）：用舌面色彩飽和度變化來(lái)診斷是否舌色淡紫。脈象（脈弱而澀）：用反映大鼠脈搏搏動(dòng)強(qiáng)度的指標(biāo)來(lái)診斷是否脈弱而澀。同時(shí)結(jié)合相關(guān)病理指標(biāo)，能夠?qū)谛牟馓撗鲎C大鼠模型進(jìn)行一個(gè)較為完整的疾病以及證候診斷。

本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)單純結(jié)扎冠脈方法建立的模型以及復(fù)合因素（疲勞運(yùn)動(dòng)+結(jié)扎冠脈，控食+結(jié)扎冠脈，疲勞運(yùn)動(dòng)、控食雙因素+結(jié)扎冠脈）方法建立的模型與空白組對(duì)比射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率顯著下降，呼吸幅度減弱體現(xiàn)了主癥（胸痛胸悶，心悸氣短）的出現(xiàn)；空?qǐng)鱿嚓P(guān)指標(biāo)發(fā)生改變、力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間縮短、足底色彩飽和度降低體現(xiàn)了兼癥（身倦乏力、面色紫暗）的出現(xiàn)；舌面色彩飽和度降低體現(xiàn)了舌象（舌淡紫）的改變；脈搏搏動(dòng)強(qiáng)度減弱則體現(xiàn)了脈象（脈弱而澀）的改變。說(shuō)明以上4種方法建立的模型能夠在建模開(kāi)始6周后辨證為氣虛血瘀證。

在動(dòng)物疾病診斷時(shí)對(duì)腦鈉鈦和N端腦鈉鈦前體進(jìn)行檢測(cè)[1415]，是因?yàn)槟X鈉鈦是心力衰竭的病理生理的重要調(diào)節(jié)因子，對(duì)心力衰竭診斷及預(yù)后評(píng)估有很高價(jià)值。近年發(fā)現(xiàn)N端腦鈉鈦前體在心力衰竭無(wú)癥狀階段已開(kāi)始升高，血清濃度比腦鈉鈦高，是評(píng)價(jià)心力衰竭患者預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立因素。有研究表明，心力衰竭的發(fā)生與一氧化氮的代謝紊亂有關(guān)[16]，而內(nèi)皮素在誘發(fā)和加重心力衰竭過(guò)程中起著重要作用[1718]。由于大鼠與人存在著種屬差異，臨床有關(guān)病證的特異性指標(biāo)未必能在動(dòng)物身上完全重現(xiàn)，因此在病證確定的前提下，探索大鼠專屬性的病證指標(biāo)對(duì)于建立一種特異性模型具有重要的意義，在之后的實(shí)驗(yàn)中將會(huì)著重進(jìn)行研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 劉曉莉，羅勇，喬德才. 大鼠一次性力竭跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)模型的建立及動(dòng)態(tài)評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2012（3）：25.

[2] 黃爍，任建勛，王少辰，等.冠心病氣虛血瘀證大鼠模型的建立[J].中國(guó)中藥雜志，2016， 41（9）：1699.

[3] 汶希，潘華山，馮毅翀. 大鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞模型的建立[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2009（5）：368.

[4] Bedford T G， Tipton C M， Wilson N C， et al. Maximal oxygen consumption of rats and its changes with various experimental produces[J].J Appl Physiol， 1979， 7：1278.

[5] 肖成榮，譚洪玲，馬增春，等. Wistar大鼠二年喂養(yǎng)對(duì)其生存、體質(zhì)量、進(jìn)食量及自發(fā)性腫瘤發(fā)生率的觀察與分析[J]. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2014（1）：34.

[6] 陳巍，侯粉霞，楊慧芳. 兩年喂飼試驗(yàn)中Wistar大鼠的攝食量[J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2013（11）：18.

[7] 李磊，林成仁，任建勛，等. 小型豬痰瘀互結(jié)證冠心病證侯診斷研究[J]. 世界中醫(yī)藥，2013（10）：1132.

[8] 宋李亞，石君杰，梅詩(shī)雪，等. 仙鶴草對(duì)抗大鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011（35）：4481.

[9] 楊濤，黃慶愿. 低壓艙內(nèi)大鼠游泳運(yùn)動(dòng)模型的建立[J]. 高原醫(yī)學(xué)雜志，2012（1）：4.

[10] 張世明，葉銳彬，虞亞明，等. 運(yùn)動(dòng)性疲勞的中醫(yī)分型和診斷標(biāo)準(zhǔn)的研究[J]. 中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2003（1）：47.

[11] 楊則宜. 運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)生物化學(xué)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2004（2）：158.

[12] 陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：513.

[13] 謝偉，楊永亮，鄭紅英. 銀杏葉提取物對(duì)小鼠抗運(yùn)動(dòng)性疲勞能力影響的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 山東體育學(xué)院學(xué)報(bào)，2004（5）：51.

[14] 蔡大煒. 腦鈉肽、內(nèi)皮素和超敏C反應(yīng)蛋白檢測(cè)在心力衰竭患者中的應(yīng)用[J]. 中華全科醫(yī)學(xué)，2014（1）：70.

[15] 李建珍，劉春江，府偉靈. 腦鈉肽在慢性心力衰竭中的應(yīng)用[J]. 國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2014（11）：1458.

[16] D Querleu，E Leblanc，B Castelain. Nitric oxide inhibits the positive inotropic response to betaadrenergic stimulation in humans with left ventricular dysfunction[J].Circulation， 1995， 92（8）：2198.

[17] Hilal Dandan R， Ramirez M T， Villegas S， et al. Endothelin ETA receptor regulates signaling and ANF gene expression via multiple G proteinlinked pathways[J].Am J Physiol， 1997， 272（1Pt2）：H130.

[18] P Sventek，A Turgeon，E L Schiffrin. Vascular endothelin1 gene expression and effect on blood pressure of chronic ETA endothelin receptor antagonism after nitric oxide synthase inhibition with LNAME in normal rats[J].Circulation， 1997， 95（1）：240.

[責(zé)任編輯 張燕]