牡荊子的化學成分與生物活性研究

李月婷等

[摘要] 研究牡荊Vitex negundo var. cannabifolia果實的化學成分及其生物活性。利用硅膠、Sephadex LH20柱色譜和半制備HPLC等色譜方法分離純化，結合其理化性質(zhì)和MS、NMR等波譜學數(shù)據(jù)鑒定化合物的結構。從牡荊子70%丙酮提取物的二氯甲烷萃取部位分離鑒定了19個化合物，包括13個木脂素和6個酚類化合物，分別鑒定為6羥基4（4羥基3甲氧基苯基）3羥甲基7甲氧基3，4二氫2萘醛（1），6羥基4（4羥基3甲氧基苯基）3羥甲基5甲氧基3，4二氫2萘醛（2），vitexdoin F（3），去四氫鐵杉脂素（4），vitexdoin E（5），4氧代芝麻素（6），L芝麻素（7），（+）beechenol（8），ligballinol（9），2（4hydroxyphenyl）6（3methoxy4hydroxyphenyl）3，7dioxabicyclo[3.3.0]octane（10），松脂素（11），balanophonin（12），theroguaiacylglycerolβconiferyl aldehyde ether（13），對羥基肉桂醛（14），松柏醛（15），5，7二羥基色原酮（16），反3，5二甲氧基4羥基肉桂醛（17），覆盆子酮（18）和alternariol 4methyl ether（19）?；衔?～10，14，18，19為首次從馬鞭草科植物中分離得到，化合物13為首次從牡荊屬植物中分離得到，化合物6，7，12，15～17為首次從該植物中分離得到。對分離得到的化合物進行了體外抗炎和細胞毒活性評價，8個化合物（3，5，7，10，11，14，15，17）能夠明顯抑制LPS誘導的RAW 264.7細胞釋放一氧化氮（NO），其IC50在7.8～81.1 μmol·L-1；4個化合物（1～4）對HepG2細胞具有明顯的細胞毒作用，IC50在5.2～24.2 μmol·L-1。

[關鍵詞] 牡荊子； 木脂素； 酚類化合物； 抗炎； 細胞毒

Chemical constituents from the fruits of Vitex negundo var. cannabifolia and

their biological activities in vitro

LI Yueting1，2， PANG Daoran1，2， ZHU Zhixiang1， HUO Huixia1，2， REN Yi1，2，

PENG Zhitian1，2， ZHENG Jiao1， ZHAO Yunfang1*， TU Pengfei1， LI Jun1*

（1. Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China；

2. School of Chinese Materia Medica， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

[Abstract] Chemical constituents from the fruits of Vitex negundo var. cannabifolia and their nitric oxide （NO） inhibitory and cytotoxic activities were investigated. The compounds were isolated and purified by various column chromatography， and their structures were identified by physiochemical properties and spectroscopic data. Thirteen lignans and six phenolic compounds were isolated from the CH2Cl2 extract of the fruits of V. negundo var. cannabifolia， respectively. Their structures were elucidated as 6hydroxy4（4hydroxy3methoxyphenyl）3hydroxymethyl7methoxy3，4dihydro2naphthaldehyde （1）， vitedoin A （2）， vitexdoin F （3）， detetrahydroconidendrin （4）， vitexdoin E （5）， 4oxosesamin （6）， Lsesamin （7）， （+）beechenol （8）， ligballinol （9）， 2（4hydroxyphenyl）6（3methoxy4hydroxyphenyl）3，7dioxabicyclo[3.3.0]octane （10）， （–）pinoresinol （11）， balanophonin （12）， theroguaiacylglycerolβconiferyl aldehyde ether （13）， transpcoumaryl aldehyde （14）， coniferyl aldehyde （15）， 5，7dihydroxychromone （16）， trans3，5dimethoxy4hydroxycinnamic aldehyde （17）， frambinone （18）， and alternariol 4methyl ether （19）. Compounds 810，14，18，19 were firstly isolated from Verbenaceae family， compound 13 was obtained from Vitex species， and 6，7，12，1517 from V. negundo var. cannabifolia for the first time， respectively. The isolated compounds were evaluated for their antiinflammatory and cytotoxic effects in vitro. Eight compounds （3，5，7，10，11，14，15，17） showed inhibition against NO production in LPSstimulated RAW 267.4 cells （IC50 in the range of 7.881.1 μmol·L-1） and four compounds （14） showed cytotoxicity on HepG2 cells （IC50 in the range of 5.224.2 μmol·L-1）.

[Key words] Vitex negundo var. cannabifolia； lignan； phenolic constituent； antiinflammatory activity； cytotoxicity

doi：10.4268/cjcmm20162219

牡荊子為馬鞭草科牡荊屬植物牡荊Vitex negundo var. cannabifolia的干燥成熟果實，具有除濕祛痰，止咳平喘，理氣止痛的功效，主要用于咳嗽氣喘，胃痛，泄瀉，痢疾，疝氣痛，腳氣腫脹，白帶，白濁等[1]?；瘜W研究表明牡荊子主要含黃酮[24]、木脂素[3，5]、三萜[4]、環(huán)烯醚萜[3]等化合物?，F(xiàn)代藥理研究表明其具有平喘[6]、鎮(zhèn)痛[7]、抗菌[1]、抗炎[8]、抗氧化[5]和抗腫瘤[9]等作用。為進一步闡明牡荊子的有效成分，本課題組對牡荊子70%丙酮提取物的二氯甲烷萃取部位進行了系統(tǒng)的化學成分研究，共分離鑒定了19個化合物，包括13個木脂素（1～13）和6個酚類化合物（14～19）。其中化合物8～10，14，18，19為首次從馬鞭草科植物中分離得到，化合物13為首次從牡荊屬植物中分離得到，化合物6，7，12，15～17為首次從牡荊中分離得到。

1 材料

高效液相離子阱飛行時間質(zhì)譜儀（日本島津公司）；Varian 500 核磁共振儀（美國Varian公司）；半制備型高效液相色譜儀（日本島津公司）；半制備HPLC色譜柱（YMCPack ODSA， 10 mm×250 mm， 5 μm）。Sephadex LH20 填料（Amersham Biosciences，瑞典）；ODS（40～63 μm，德國Merck）；柱色譜用硅膠（200～300目）及薄層色譜用GF254硅膠預制板均為青島海洋化工廠生產(chǎn)。丙酮、二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯、正己烷等均為分析純。

牡荊子于2012年9月采自河南省信陽市，由北京大學藥學院天然藥物學系屠鵬飛教授鑒定為V. negundo var. cannabifolia的干燥成熟果實。標本存放于北京中醫(yī)藥大學中藥現(xiàn)代研究中心（JLIVNC201209）。

2 提取與分離

干燥并粉碎的牡荊子藥材（6.5 kg）在室溫下分別用70%丙酮浸泡提取3次（每次溶劑40 L，浸泡24 h），過濾，合并提取液，濃縮得浸膏（450 g）。取浸膏400 g，用90%甲醇溶解，依次用正己烷、二氯甲烷萃取，得到正己烷部位（180 g）、二氯甲烷部位（90 g）、水部位（110 g）3個萃取部位。

二氯甲烷萃取物（80 g）經(jīng)硅膠（200～300目）柱色譜分離，正己烷乙酸乙酯（3∶1～0∶1）、二氯甲烷甲醇（25∶1～0∶1）梯度洗脫得到11個流分（Fr.1～11），F(xiàn)r.11經(jīng)重結晶，得到1（8.0 g），F(xiàn)r.11的結晶母液經(jīng)半制備液相色譜純化得3（2.0 mg）。Fr.5經(jīng)Sephadex LH20柱色譜，二氯甲烷甲醇（1∶1）洗脫得到7個流分（Fr.5a～5g）。Fr.5e，5f合并后經(jīng)硅膠柱色譜和半制備液相色譜純化得7（2.0 mg）。Fr.6經(jīng)Sephadex LH20柱色譜，二氯甲烷甲醇（1∶1）洗脫得到4個流分（Fr.6a～6d）。Fr.6b經(jīng)硅膠柱色譜和半制備液相色譜純化得6（4.1 mg）和18（4.0 mg）。Fr.7經(jīng)Sephadex LH20柱色譜，二氯甲烷甲醇（1∶1）洗脫得到8個流分（Fr.7a～7h）。Fr.7e經(jīng)硅膠柱色譜和半制備液相色譜純化得14（2.0 mg），15（2.5 mg）和19（2.3 mg）。Fr.8經(jīng)Sephadex LH20柱色譜，二氯甲烷甲醇（1∶1）洗脫得到15個流分（Fr.8a～8o）。Fr.8i經(jīng)硅膠柱色譜和半制備液相色譜純化得5（4.5 mg）和8（3.6 mg）。Fr.8l經(jīng)硅膠柱色譜和半制備液相色譜純化得16（4.5 mg）。Fr.9經(jīng)Sephadex LH20柱色譜，以甲醇洗脫得到8個流分（Fr.9a～9h）。Fr.9d經(jīng)硅膠柱色譜和半制備液相色譜分離純化得17（2.5 mg）。Fr.9e經(jīng)硅膠柱色譜、ODS柱色譜和半制備液相色譜分離純化得9（3.4 mg），10（2.1 mg）和11（2.4 mg）。Fr.10經(jīng)硅膠柱色譜分離，正己烷乙酸乙酯（2∶1～0∶1）洗脫得到5個流分（Fr.10a～10e）。Fr.10c經(jīng)Sephadex LH20柱色譜得4（10 mg）。Fr.10d經(jīng)反復硅膠柱色譜、Sephadex LH20柱色譜、ODS柱色譜和半制備液相色譜純化得到2（5 g），12（2.3 mg）和13（2.6 mg）。

3 結構鑒定

4 藥理活性篩選

4.1 體外抗炎活性測定[21] 取對數(shù)期生長的RAW 264.7細胞制備細胞數(shù)量為2×105個/mL細胞懸浮液，加入96孔板，每孔100 μL，于37 ℃在5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將待測化合物用完全培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的工作液，每個濃度設置3個復孔。作用于RAW 264.7細胞1 h后，加入終濃度0.5 mg·L-1的LPS刺激RAW 264.7細胞，37 ℃孵育24 h后，利用Griess法測定細胞培養(yǎng)上清中NO濃度，利用MTT法測定96孔板中的細胞活力，并計算各濃度天然化合物對RAW 264.7細胞分泌NO的抑制率和對RAW 264.7細胞生長的抑制率。結果顯示，化合物3，5，7，10，11，14，15，17能不同程度抑制LPS誘導的RAW 264.7細胞釋放NO，其IC50分別為（7.8±1.5），（51.0±2.2），（81.1±5.7），（27.9±17.5），（10.5±0.6），（9.4±0.2），（10.5±0.6），（21.4±1.0）μmol·L-1，陽性藥吲哚美辛的IC50為（44.1±5.8）μmol·L-1；其他化合物在100 μmol·L-1（最高實驗濃度）時的NO抑制率小于50%。所有化合物在100 μmol·L-1時對RAW 264.7細胞生長沒有明顯抑制作用。

4.2 MTT細胞增殖毒性測定 取對數(shù)期生長的HepG2人肝癌細胞制備細胞數(shù)量為3.5×104個/mL細胞懸浮液，加入96孔板，每孔100 μL，于37 ℃在5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使其完全貼壁，將待測化合物用完全培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的工作液，每個濃度設置5個復孔。于加藥后48 h，每孔加入10 μL MTT試劑，在37 ℃作用2 h。用酶標儀測定在570 nm處的吸光度，計算細胞存活率。結果顯示化合物1～4能不同程度抑制HepG2人肝癌細胞的生長，其IC50分別為（5.2±0.13），（19.7±1.44），（8.3±0.44）， （24.2±1.27） μmol·L-1。

5 討論

本研究從牡荊子70%丙酮提取物的二氯甲烷萃取部位分離鑒定了19個化合物，主要以木脂素類化合物為主，其中13個化合物為首次從牡荊子中分離得到。同時，對分離得到的化合物進行了體外抗炎活性和細胞毒活性篩選。結果表明，8個化合物能夠不同程度地抑制LPS誘導的RAW 264.7細胞釋放NO，具有一定的抗炎活性；4個化合物能顯著抑制HepG2人肝癌細胞的增殖，具有較強的細胞毒活性，這些活性成分主要以木脂素類化合物為主。實驗過程中發(fā)現(xiàn)，牡荊子中苯代萘型木脂素6羥基4（4羥基3甲氧基苯基）3羥甲基7甲氧基3，4二氫2萘醛（1）和6羥基4（4羥基3甲氧基苯基）3羥甲基5甲氧基3，4二氫2萘醛（2）含量很高，文獻報道此類木脂素具有多種藥理作用，如抗炎[8]、抗腫瘤[9]、神經(jīng)保護[22]等，根據(jù)本研究結果并結合文獻報道，推測牡荊子發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎可能是其中含量較大的苯代萘型木脂素類成分，其作用機制仍需進一步探討與研究。

[參考文獻]

[1] 國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會. 中華本草. 第6卷 [M]. 上海： 科學技術出版社， 1999： 599.

[2] 宋妍， 楊雪， 葛紅娟， 等. 牡荊子的化學成分 [J]. 中國實驗方劑學雜志， 2014， 20 （19）： 116.

[3] Yamasaki T， Kawabata T， Masuoka C， et al. Two new lignan glucosides from the fruit of Vitex cannabifolia [J]. J Nat Med， 2008， 62： 47.

[4] 顧湘， 楊雪， 葛紅娟， 等. 牡荊子的化學成分研究Ⅱ [J]. 西北藥學雜志， 2015， 30 （2）： 114.

[5] Lou Z H， Li H M， Gao L H， et al. Antioxidant lignans from the seeds of Vitex negundo var. cannabifolia [J]. J Asian Nat Prod Res， 2014， 16（9）： 963.

[6] 劉懋生， 劉昌林， 顧剛妹， 等. 牡荊子脂質(zhì)對實驗動物氣道平滑肌的影響 [J]. 中國藥理學通報， 1993， 9 （4）：307.

[7] 鐘世同， 邱光鐸， 劉元帛， 等. 單葉蔓荊子、蔓荊子、黃荊子和牡荊子的藥理活性比較 [J]. 中藥藥理與臨床， 1996 （1）： 37.

[8] Zheng C J， Huang B K， Han T， et al. Nitric oxide scavenging lignans from Vitex negundo seeds [J]. J Nat Prod， 2009， 72： 1627.

[9] Zhou Y J， Liu Y E， Cao J G， et al. Vitexins， naturederived lignan compounds， induce apoptosis and suppress tumor growth [J]. Clin Cancer Res， 2009， 15： 5161.

[10] Ono M， Nishida Y， Masuoka C， et al. Lignan derivatives and a norditerpene from the seeds of Vitex negundo [J]. J Nat Prod， 2004， 67： 2073.

[11] Anjaneyulu A S R， Rao A M， Rao V K， et al. Novel hydroxyl lignans from the heartwood of Gmelina arborea [J]. Tetrahedron， 1977， 33： 133.

[12] 青山， 曾光堯， 譚健兵， 等. 黃荊子親脂性化學成分研究 [J]. 中南藥學， 2011， 9（7）： 492.

[13] Cheng M J， Wu C C， Tsai I L， et al. Chemical and antiplatelet constituents from the stem of Zanthoxylum beecheyanum [J]. J Chin Chem Soc， 2004， 51（5A）：1065.

[14] Chau V M， Nguyen X N， Hoang T Y， et al. Chemical constituents of Trichosanthes kirilowii and their cytotoxic activities [J]. Arch Pharm Res， 2015， 38： 1443.

[15] Luo Y， Dai H F， Wang H， et al. Chemical constituents from dragon′s blood of Dracaena cambodiana [J]. Chin J Nat Med， 2011， 9（2）： 112.

[16] 任鳳芝， 陳書紅， 李麗紅， 等. 橡膠籽種殼的化學成分研究 [J]. 中國新藥雜志， 2012， 21（19）： 2311.

[17] Richard R， Stange J， James J S， et al. Isolation of a phytoalexin， transpcoumaryl aldehyde， from Cucurbita maxima， Cucurbitaceae [J]. Phytochemistry， 1999， 52： 41.

[18] 趙湘湘， 鄭承劍， 秦路平. 黃荊子的化學成分研究 [J]. 中草藥， 2012， 43（12）： 2346.

[19] 呂靜， 賈凌云， 袁久志， 等. 紅松松針化學成分的分離與鑒定 [J]. 沈陽藥科大學學報， 2011， 28（1）： 21.

[20] Tan N， Tao Y W， Pan J H， et al. Isolation， structure elucidation， and mutagenicity of four alternariol derivatives produced by the mangerove endophytic fungus No.2240 [J]. Chem Nat Compd， 2008， 44（3）： 296.

[21] Huang Z， Zhu Z X， Li Y T， et al. Antiinflammatory labdane diterpenoids from Leonurus macranthus [J]. J Nat Prod， 2015， 78：2276.

[22] Yang Z B， Tan B， Li T B， et al. Protective effect of vitexin compound B1 against hypoxia/reoxygenationinduced injury in differentiated PC 12 cells via NADPH oxidase inhibition [J]. NS Arch Pharmacol， 2014， doi： 10.1007/s0021001410060.

[責任編輯 丁廣治]