不同禽蛋黃中卵磷脂的提取及其水解液成分的鑒定研究

· 技術(shù)方法 ·

不同禽蛋黃中卵磷脂的提取及其水解液成分的鑒定研究

趙思邈1,2任 悅1,2石 晨1邵建群1張 楓1*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院2013級(jí)臨床藥學(xué)專業(yè)本科生，北京 100069)

卵磷脂又名磷脂酰膽堿，是磷脂中的一種，廣泛分布于動(dòng)植物組織中。卵磷脂是構(gòu)成生物膜的基本物質(zhì)，生物膜的正常功能表達(dá)，以及人體衰老、動(dòng)脈硬化、心腦血管疾病等都與卵磷脂的變化有關(guān)系[1]。卵磷脂也是一種天然表面活性劑，并在醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域有著諸多的應(yīng)用[2]。卵磷脂主要存在于油料作物種子和蛋黃中, 尤其在蛋黃中含量可達(dá)10%左右[3]。

在卵磷脂的提取研究上，主要是有機(jī)溶劑提取法和超臨界CO2萃取法[4-5]。后者方法對(duì)設(shè)備要求較高，成本也高[6]。而有機(jī)溶劑提取法操作簡便，易于控制，是目前應(yīng)用研究較多的蛋黃卵磷脂提取方法[7-8]。根據(jù)卵磷脂不溶于丙酮，易溶于乙醇的性質(zhì)，實(shí)驗(yàn)中采用了乙醇為提取溶劑，同時(shí)比較研究了超聲提取和研磨提取兩種方法對(duì)提取不同蛋黃中卵磷脂提取率的影響。并對(duì)提取到的各種禽蛋卵磷脂進(jìn)行了完全水解，對(duì)水解產(chǎn)物中的脂肪酸、甘油、膽堿和磷酸進(jìn)行了相應(yīng)的鑒定實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

乙醇、乙醚、丙酮、乙酸鉛、硫酸銅、碘化鉍鉀、鉬酸銨、氨基萘酚磺酸、硫酸、硝酸、氫氧化鈉等均為分析純。

電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；減壓抽濾裝置、蒸餾裝置等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 卵磷脂的超聲提取

取熟蛋黃1個(gè)，在電子天平中稱質(zhì)量并記錄蛋黃的質(zhì)量(M1)。將蛋黃置于干凈的錐形瓶中并將其搗碎，然后加入95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇20 mL，放入超聲儀中超聲提取20 min。取出后，用布氏漏斗減壓過濾，充分?jǐn)D壓濾干后把蛋黃濾渣再移入錐形瓶中。在蛋黃濾渣中又加入95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇10 mL，并超聲提取10 min后減壓過濾，濾渣用2 mL無水乙醇洗3遍，抽干后，合并兩次濾液到100 mL蒸餾燒瓶中。

安裝蒸餾裝置，常壓蒸餾盡量除去提取液中的乙醇，燒瓶中得到黃色油狀物。冷卻后，加入5 mL乙醚，攪拌使油狀物溶解。然后攪拌下慢慢加入15 mL左右的丙酮，振搖，即有卵磷脂析出。除去其中丙酮，并使殘余的丙酮全部揮發(fā)掉后，電子天平稱質(zhì)量并記錄提取到的卵磷脂質(zhì)量(M2)。

1.2.2 卵磷脂的研磨提取

研磨提取方法所用提取溶劑乙醇的用量同超聲提取，只是在操作方法中把第一次超聲20 min，改為在研缽中研磨20 min；第二次超聲10 min，改為在研缽中研磨10 min，其他處理步驟同超聲提取。

1.2.3 提取率計(jì)算

1.2.4 卵磷脂的水解

把提取到的卵磷脂裝入錐形瓶中，加入15 mL 20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氫氧化鈉溶液，放入沸水浴中加熱攪拌15 min，使卵磷脂充分水解。冷卻后，在玻璃漏斗中用雙層紗布過濾得水解液，水解液供組成鑒定用。過濾后留在紗布上的白色泡沫狀物，為水解后的脂肪酸鈉，供脂肪酸鑒定用。卵磷脂水解后應(yīng)生成高級(jí)脂肪酸、甘油、膽堿和磷酸，水解反應(yīng)如下[9]。

1.2.5 卵磷脂的水解液成分鑒定

把提取到的卵磷脂按本文“1.2.4”項(xiàng)方法充分水解以后，生成的水解產(chǎn)物含有高級(jí)脂肪酸、甘油、膽堿和磷酸，可按下方法依次進(jìn)行相應(yīng)的水解液成分鑒定。

1)脂肪酸的鑒定：取卵磷脂水解過濾時(shí)留在紗布上的白色泡沫狀物，即高級(jí)脂肪酸鈉鹽放入試管中，加1滴20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氫氧化鈉與5 mL蒸餾水，然后逐滴加入硝酸酸化，當(dāng)溶液出現(xiàn)混濁現(xiàn)象時(shí)停止滴加，此為脂肪酸的鈉鹽變?yōu)椴蝗苡谒闹舅?。然后在試管中逐滴加?0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))乙酸鉛溶液，有明顯的高級(jí)脂肪酸鉛鹽的白色沉淀產(chǎn)生，表明水解后產(chǎn)生了游離的高級(jí)脂肪酸。

2)甘油的鑒定：在試管中加入1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))硫酸銅溶液1 mL，20%氫氧化鈉溶液2滴，有氫氧化銅沉淀生成。再加入1 mL水解液，振搖，沉淀溶解生成絳藍(lán)色的甘油銅溶液[10]，表明水解液中有甘油產(chǎn)生。

3)膽堿的鑒定：在一支試管中加入水解液1 mL，加入硫酸使其酸化, 再逐滴加入約5～6滴碘化鉍鉀并振搖，漸漸形成渾濁的橘或磚紅色，此為膽堿的特性反應(yīng)[11]，表明水解液中有膽堿存在。

4)磷酸的鑒定：在一支試管中加入0.5 mL水解液，滴加硫酸使其酸化后，再滴加5滴鉬酸銨試劑， 1 mL氨基萘酚磺酸溶液，振搖后水浴加熱15 min，試管液體為藍(lán)色，此為磷鉬藍(lán)的顏色，表明水解液中存在磷酸鹽[12]。

2 結(jié)果

2.1 不同提取方法對(duì)蛋黃卵磷脂提取率的影響

根據(jù)卵磷脂溶于乙醇，而不溶于丙酮的特性，分別用烏雞蛋、鴨蛋和雞蛋的蛋黃，采用超聲提取方法和研磨提取方法，對(duì)烏雞蛋、鴨蛋和雞蛋的蛋黃進(jìn)行卵磷脂的提取方法對(duì)比研究，卵磷脂提取率的結(jié)果見圖1。

圖1 超聲和研磨提取蛋黃卵磷脂的提取率

2.2 不同禽蛋黃中卵磷脂的含量

由于超聲方法可以有效地從蛋黃中提取到卵磷脂，表1是不同禽蛋黃采用超聲方法提取卵磷脂得到的提取率結(jié)果。其中編號(hào)3采用的是未煮熟的生雞蛋黃，其他均采用煮熟的蛋黃。編號(hào)4為放置時(shí)間為2個(gè)月以上的雞蛋，標(biāo)記為過期雞蛋。

表1 不同禽蛋黃超聲提取卵磷脂的提取率

2.3 水解液鑒定結(jié)果

表2為采用超聲方法提取到的各種禽蛋黃的卵磷脂經(jīng)堿性水解后，按照本文“1.2.5”項(xiàng)所述的鑒定方法，對(duì)編號(hào)1～6各種蛋黃卵磷脂水解液的鑒定結(jié)果?！?”號(hào)表示實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象為正結(jié)果，其中“++”表示產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象明顯且快速。從鑒定結(jié)果可知，從烏雞蛋、雞蛋、鴨蛋和鵝蛋的蛋黃中提取到的卵磷脂都符合已知的卵磷脂的結(jié)構(gòu)特征。

表2 卵磷脂水解液的鑒定結(jié)果

3 討論

乙醇作為卵磷脂的提取溶劑，采用超聲方法提取卵磷脂的提取率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于采用研磨的方法(圖1)。這可能是由于超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈震動(dòng)、高的加速度以及熱效應(yīng)，破壞了細(xì)胞壁，使溶劑易滲透到細(xì)胞中，從而提高了卵磷脂的提取率。故超聲提取方法是一種非常有效的從禽蛋中提取卵磷脂的方法。

卵磷脂因最早從蛋黃中提取出來而得名，在實(shí)驗(yàn)所研究的烏雞、雞、鴨、鵝蛋的蛋黃中，烏雞蛋黃的卵磷脂含量最高；其次是鴨蛋、雞蛋；鵝蛋黃雖然大，但它的卵磷脂的含量不高(表1)。新鮮的雞蛋比放置過久的雞蛋卵磷脂的含量高。按照本實(shí)驗(yàn)方法，采用煮熟了的雞蛋比生雞蛋更能有效地從蛋黃中提取到卵磷脂，這可能是由于生雞蛋黃本身黏稠，提取溶劑不能有效地浸潤到內(nèi)部，導(dǎo)致提取率低。

卵磷脂又名磷脂酰膽堿，是由磷脂酸與膽堿通過酯鍵結(jié)合生成。卵磷脂、磷脂酸的分子結(jié)構(gòu)如下：

由于磷脂酸本身也包含有多個(gè)酯鍵，卵磷脂結(jié)構(gòu)中的這些酯鍵，可以水解斷開。所以卵磷脂在堿性條件下，水解液中會(huì)產(chǎn)生脂肪酸、甘油、膽堿和磷酸這四種物質(zhì)。通過鑒定水解液中的這4種物質(zhì)的存在，可以說明提取到了卵磷脂。在本實(shí)驗(yàn)研究中，對(duì)提取到的禽蛋黃的卵磷脂進(jìn)行堿性水解，并依次鑒定了這些物質(zhì)(表2)。卵磷脂的水解產(chǎn)物鑒定實(shí)驗(yàn)表明，從烏雞、雞、鴨、鵝蛋的蛋黃中均可以提取到卵磷脂。這也說明采用乙醇為溶劑的超聲提取方法，可以有效地從一枚禽蛋的蛋黃中提取到卵磷脂。卵磷脂與我們?nèi)粘Ｉ盥?lián)系密切，希望本實(shí)驗(yàn)的研究方法和結(jié)果，能夠?qū)ι钪兴秤玫那莸坝兴私?，并能夠?qū)氖孪嚓P(guān)蛋黃卵磷脂的提取研究和實(shí)驗(yàn)教學(xué)工作提供參考。

致謝：在本論文完成過程中，得到了“首都醫(yī)科大學(xué)國家級(jí)基礎(chǔ)與專業(yè)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心”和“首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)化學(xué)與藥學(xué)示范性校內(nèi)創(chuàng)新實(shí)踐基地”兩大平臺(tái)的支持。

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編輯 慕 萌

中央支持地方專項(xiàng)-藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)(PXM2015_014226_000142)，首都醫(yī)科大學(xué)2015年度校長基金(2015JYY28)。This study was Supported by the Central Government to Support Local Units for the Development of Pharmaceutical Laboratory(PXM2015_014226_000142)， 2015 Principal Fund of Capital Medical University (2015JYY28).

時(shí)間：2017-01-17 23∶49

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20170117.2349.038.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.01.023]

2016-09-14)

*Corresponding author， E-mail：zhangf@ccmu.edu.cn