紅花黃萎病病原菌鑒定

王成成, 岳永亮, 任毓忠, 張 莉, 金恭璽, 李國(guó)英

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院,新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子 832003)

紅花黃萎病病原菌鑒定

王成成, 岳永亮, 任毓忠, 張 莉, 金恭璽, 李國(guó)英*

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院,新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子 832003)

2014年在石河子大學(xué)試驗(yàn)站和實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)種植的紅花出現(xiàn)了一種植株矮化,葉片發(fā)黃,枯死的病害,切開莖稈,維管束變成褐色。采用常規(guī)組織分離法對(duì)病組織莖稈進(jìn)行分離、純化獲得單孢純培養(yǎng)菌株;通過常規(guī)紙缽撕底沾根法對(duì)其進(jìn)行致病性測(cè)定;用形態(tài)學(xué)和rDNA-ITS序列分析對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明,分離菌株的菌落形態(tài)、分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)都與大麗輪枝菌Verticilliumdahliae一致;經(jīng)分子生物學(xué)鑒定,該菌的rDNA-ITS序列與中國(guó)棉花黃萎病菌V.dahliae的ITS序列(登錄號(hào)KT803074)同源性為99%以上 。故將引起新疆紅花黃萎病的病原菌鑒定為大麗輪枝菌V.dahliae。

紅花; 黃萎病; 病原鑒定

紅花CarthamustinctoriusL.屬于雙子葉植物,菊科,紅花屬。在新疆種植面積較大,是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的經(jīng)濟(jì)作物。其紅花油中含有較高的亞油酸,具有降血脂、軟化血管、增加血液循環(huán)的作用。其花不僅可作染料,同時(shí)也可藥用,具有活血通經(jīng)、化痰止痛的功效。紅花油不僅是良好的食用油,也是良好的工業(yè)和醫(yī)藥用油。紅花抗旱、抗寒,并且耐鹽堿,適于中國(guó)北方及西北地區(qū)栽培。

新疆維吾爾自治區(qū)是我國(guó)重要的紅花生產(chǎn)基地,無論種植面積、干花產(chǎn)量和紅花籽產(chǎn)量都占全國(guó)的80%左右[1]。在新疆紅花主要分布于塔城、伊犁和昌吉等地,是這些地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)和油料作物。自2013年以來,石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站和試驗(yàn)場(chǎng)種植的紅花經(jīng)常出現(xiàn)葉片發(fā)黃,植株矮化,甚至枯死,剖稈檢查維管束變褐色,嚴(yán)重時(shí)發(fā)病率達(dá)15%。尤其在前茬為棉花且黃萎病發(fā)病重的田塊,發(fā)病較重。在國(guó)外,Koike等[2]報(bào)道了美國(guó)加利福尼亞榨油紅花和觀賞紅花發(fā)生黃萎病,有的地塊發(fā)病率高達(dá)50%。植株由于品質(zhì)喪失或植株死亡而不能收獲。Koike等[2]將其病原鑒定為大麗輪枝菌Verticilliumdahliae。目前國(guó)內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)這方面的報(bào)道。賈菊生等[3]報(bào)道新疆棉花黃萎病菌Verticilliumdahliae人工接種可以侵染紅花,但沒有自然情況下導(dǎo)致紅花發(fā)病的直接證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的紅花病株于2014年和2015年采自石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站和大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)紅花地中。人工接種所用紅花種子為健康的‘裕民無刺’品種。通過田間病株和人工接種發(fā)病的病株進(jìn)行癥狀描述。

1.2 病原菌分離純化及致病性測(cè)定

2014年7月在田間采集癥狀典型的病株,棄去葉片，將莖稈切成小段,用1%的升汞表面消毒30 s,取出后連續(xù)用無菌水沖洗3次,之后置于馬鈴薯葡萄糖洋菜培養(yǎng)基上,27℃溫箱中黑暗培養(yǎng),待長(zhǎng)出菌絲并進(jìn)一步純化培養(yǎng)后,按常規(guī)方法進(jìn)行單孢分離,將單胞純化菌株轉(zhuǎn)接于試管斜面培養(yǎng)10 d后,4℃冰箱中保存,并以20%甘油孢子懸浮液保存于-70℃冰箱中備用。其致病性測(cè)定參照馬存的紙缽撕底蘸根接種法進(jìn)行[4],即選取直徑12 cm的營(yíng)養(yǎng)缽,其內(nèi)裝入無菌土,播入‘裕民無刺’紅花品種的種子,放入25℃的溫室,待幼苗長(zhǎng)到6片真葉時(shí),撕去營(yíng)養(yǎng)缽底部(傷部分幼根),放入盛有孢子濃度為1×107個(gè)/mL的15 mL新鮮菌液中,以接種15 mL無菌水為對(duì)照,每個(gè)處理3缽,每缽10株苗,試驗(yàn)重復(fù)3次。10 d后開始對(duì)發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查,并采集病樣對(duì)病原菌進(jìn)行再分離。

1.3 形態(tài)學(xué)鑒定

分離菌的形態(tài)鑒定,包括不同溫度下菌落的生長(zhǎng)情況和形態(tài)特征、微菌核產(chǎn)生情況、分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)及其大小的顯微測(cè)量和拍照等均參照岳永亮等[5]的方法進(jìn)行。

1.4 分子生物學(xué)鑒定

1.4.1 基因組DNA提取

從分離純化的菌株中選3個(gè)代表性菌株在PDA平板上25℃培養(yǎng)7 d,收集菌絲,采用CTAB法提取菌體的基因組DNA[6]。

1.4.2 rDNA-ITS區(qū)的擴(kuò)增及測(cè)序

代表菌株rDNA-ITS區(qū)序列的PCR擴(kuò)增選用真核生物通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′);PCR反應(yīng)總體積25 μL,引物ITS1/ ITS4 0.4 μmol/L,dNTPs 0.2 mmol/L,10×PCR buffer 2.5 μL,TaqDNA聚合酶1U,DNA模板1 μL。用TECHNE TC-3000 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,94℃ 3 min預(yù)變性;94℃,30 s;55℃,30 s;72℃,40 s;30次循環(huán);72℃延伸10 min,擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè),然后將PCR產(chǎn)物送交生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.4.3 rDNA-ITS序列分析

將測(cè)得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/),并與GenBank已登錄的相似序列進(jìn)行同源性分析,利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

紅花黃萎病在田間一般于紅花開花后開始發(fā)生,并很快進(jìn)入發(fā)病盛期。植株葉片自下而上開始褪綠變黃,有些葉片褪綠不均,呈“花葉”狀,嚴(yán)重者整株枯死。剖稈檢查可見維管束變成褐色。室內(nèi)人工接種后,一般10～15 d開始發(fā)病,葉片自下而上出現(xiàn)黃化,有些葉脈也明顯變黃,發(fā)病后期常整個(gè)植株萎蔫,剖稈檢查可見維管束變褐色。其人工接種癥狀和田間癥狀一致(圖1)。

圖1 紅花黃萎病癥狀Fig.1 Symptoms of Verticillium wilt on safflower

2.2 致病性測(cè)定

室內(nèi)植株人工接種10～15 d后, 葉片開始出現(xiàn)褪綠發(fā)黃癥狀,一個(gè)月后進(jìn)入發(fā)病盛期,發(fā)病率在68%以上,未接種植株表現(xiàn)正常。從發(fā)病的紅花組織上再分離得到與接種菌株相同形態(tài)的真菌。

2.3 形態(tài)學(xué)鑒定

病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)16 d,其菌落均為圓形或近圓形。在10、15、20和25℃條件下培養(yǎng),均產(chǎn)生微菌核,氣生菌絲白色,不發(fā)達(dá);在25℃生長(zhǎng)最快,20℃次之;30℃不產(chǎn)生微菌核,菌落正面呈規(guī)則的放射狀乳白色,背面米黃色;35℃下不生長(zhǎng)(圖2a)。普通光學(xué)顯微鏡觀察,分生孢子梗無色透明,多由1～3層輪生小梗和一個(gè)頂枝小梗組成,每層有2～4個(gè)分枝(圖2b),頂枝長(zhǎng)度32.9～75.8 μm,平均長(zhǎng)度55.8 μm;輪枝小梗長(zhǎng)度10.4～87.2 μm,平均長(zhǎng)度23.9 μm;輪層間距28.5～67.5 μm,平均為50.9 μm。分生孢子無色透明,橢圓形、卵形等,大小為(5.0～12.4)μm×(2.5～6.9)μm。微菌核念珠狀、橢圓形、長(zhǎng)圓形或不規(guī)則形(圖2c),大小差別很大,一般(32.2～120.0)μm×(24.0～61.4)μm。與已報(bào)道的大麗輪枝菌(V.dahliae)一致。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

3個(gè)代表性菌株(xj-1,xj-2,xj-3)的 rDNA-ITS區(qū)序列大小均為516 bp,將擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與GenBank中已登錄的輪枝菌屬不同來源分離物的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì),并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示,來自新疆紅花上的分離物的rDNA-ITS序列與已登錄的大麗輪枝菌Verticilliumdahliae棉花、茄子、葡萄及芒果樹分離物(登錄號(hào)分別為EU835817.1、KJ696553.1、FJ475122.1和KF878396.1)的序列同源性達(dá)100%～99.77%,結(jié)合病菌的形態(tài)特征,將引起新疆紅花黃萎病的病原鑒定為大麗輪枝菌Verticilliumdahliae。

圖2 紅花黃萎病病原菌的形態(tài)Fig.2 Morphology of the pathogen causing Verticillium wilt on safflower

3 結(jié)論與討論

通過病害田間癥狀的系統(tǒng)觀察,病菌的形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀和ITS序列的分析,以及致病性試驗(yàn),結(jié)合國(guó)外有關(guān)資料,將引起新疆紅花CarthamustinctoriusL.黃萎病的病原確定為大麗輪枝菌Verticilliumdahliae。

大麗輪枝菌所引起的黃萎病是一種典型的土傳病害,具有寄主多、分布廣、防治難的特點(diǎn),常引起多種植物黃萎病[7]。作為重要的藥用和油料作物,國(guó)內(nèi)尚未見紅花黃萎病的報(bào)道。目前新疆棉花黃萎病發(fā)生較重[8-9],為此在棉花黃萎病重病田輪作倒茬時(shí)不要種植紅花,以免引起不必要的經(jīng)濟(jì)損失。

圖3 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the ITS sequences

[1] 王兆木, 陳躍華. 紅花及其開發(fā)利用[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué), 1995(5): 203-205.

[2] Koike S T.Baameur A, Maruthachalam K, et al.Verticilliumwilt of spineless safflower caused byVerticilliumdahliaein California [J]. Plant Disease, 2012, 96(9): 1383.

[3] 賈菊生,郭輝.新疆幾株黃萎輪枝菌株的形態(tài)學(xué)鑒定與生物學(xué)特征特性比較研究[J].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,29(3):73-77.

[4] 馬存. 棉花枯萎病與黃萎病[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2007: 61-106.

[5] 岳永亮,任毓忠,張莉,等.新疆榆樹黃萎病的鑒定 [J].植物保護(hù),2016,42(2):251-253.

[6] 沈萍, 陳向棟. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].第四版.北京: 高等教育出版社, 2010: 149-151.

[7] Pegg G F, Brady B L.Verticilliumwilts [M]. UK: CABI Publishing, 2002.

[8] 韓宏偉, 劉培源, 吉麗麗, 等. 新疆北部棉區(qū)棉花黃萎病菌病原種群致病性分化及變異[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2011, 38(2): 121-126.

[9] 韓宏偉, 任毓忠, 劉培源, 等. 新疆南部棉區(qū)黃萎病菌種群致病性分化及變異[J]. 棉花學(xué)報(bào), 2012, 24(2): 147-152.

(責(zé)任編輯：楊明麗)

Identification of the pathogen causingVerticilliumwilt on safflower

Wang Chengcheng, Yue Yongliang, Ren Yuzhong, Zhang Li, Jin Gongxi, Li Guoying

(AgriculturalCollegeofShiheziUniversity,KeyLaboratoryofXinjiangUygurAutonomousRegionforOasisAgriculturalPestManagementandUtilizationofPlantProtectionResource,Shihezi832003,China)

A disease causing leaf yellowing, stunting, and death on safflower was found at the Shihezi University Agricultural Experimental Station and Farm, Xinjiang Uygur Autonomous Region in 2014. Vascular bundles in the stem also became brown. The pathogenicity of the isolates was tested by using the root-dipping method in paper cups with the bottom torn out. The colony morphology, conidiophores, and conidia of the isolates were identical to those ofVerticilliumdahliae. Its rDNA-ITS sequence showed 99% homology with that of China cotton isolate ofV.dahliae(KT803074). It is supposed that this safflower disease was caused byV.dahliae.

safflower;Verticilliumwilt; pathogen identification

2016-01-16

2016-03-25

中小企業(yè)創(chuàng)新項(xiàng)目(14C26216513812);石河子科技局項(xiàng)目(2012NY04)

S435.67

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.01.044

* 通信作者 E-mail: lgyshzu@163.com.