黃金香柳揮發(fā)油化學(xué)成分分析及其抗細(xì)菌活性

馮 皓, 祝一鳴, 王 偉, 劉 易, 賀 佳, 王 軍, 單體江

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院,廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點實驗室,廣州 510642)

黃金香柳揮發(fā)油化學(xué)成分分析及其抗細(xì)菌活性

馮 皓, 祝一鳴, 王 偉, 劉 易, 賀 佳, 王 軍, 單體江*

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院,廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點實驗室,廣州 510642)

采用水蒸氣蒸餾法提取黃金香柳枝葉中的揮發(fā)油,得率為0.972% (以鮮重為基礎(chǔ))。通過GC-MS分析,從黃金香柳枝葉中共鑒定出18種成分,占總相對含量的99.056%,其中主要成分是甲基丁香酚(92.185%)和肉桂酸甲酯(3.795%)。黃金香柳枝葉揮發(fā)油對6種供試細(xì)菌表現(xiàn)出一定的抑菌作用,其中對黃瓜角斑病菌和根癌農(nóng)桿菌的抑菌活性最好,抑菌圈直徑分別為(9.0±0.0)mm和(8.5±0.1)mm,但仍弱于陽性對照硫酸鏈霉素對黃瓜角斑病菌(18.0±1.0)mm和根癌農(nóng)桿菌(21.7±1.0)mm的活性。

黃金香柳; 揮發(fā)油; 化學(xué)成分分析; 抗細(xì)菌活性

黃金香柳Melaleucabracteata,又名千層金、黃金寶樹、黃金串錢柳,屬于桃金娘科白千層屬常綠小喬木或灌木[1-2]。原產(chǎn)于新西蘭、澳大利亞,20世紀(jì)90年代首次作為彩葉樹種從澳洲引種到我國[3]。黃金香柳樹體金黃,株形通直,適生范圍廣,不僅生長快,耐修剪,更具有強(qiáng)大的抗病蟲、抗旱、耐澇及抗風(fēng)特性,是現(xiàn)今世界上最流行、最具觀賞價值的色葉喬木新樹種之一。黃金香柳不僅能用于庭園景觀綠化,亦可用于林相改造[2],其大面積的推廣和種植對于豐富華南地區(qū)城市綠化樹種和提高城市景觀多樣性具有重要意義。

黃金香柳枝葉芳香宜人,目前關(guān)于其研究多集中于黃金香柳揮發(fā)油化學(xué)成分及其提取方法等方面[2, 4],黃金香柳芳香油是目前世界上珍貴的化妝品香料之一,且具有很強(qiáng)的殺螨活性和驅(qū)蟲性[5],然而對于其揮發(fā)油抗細(xì)菌活性以及在農(nóng)林業(yè)上的應(yīng)用卻鮮有報道。本研究采用水蒸氣蒸餾法提取黃金香柳的揮發(fā)油,通過GC-MS分析鑒定其主要成分,并通過濾紙片擴(kuò)散法測定了黃金香柳揮發(fā)油對6種供試細(xì)菌的抑菌活性,以期為黃金香柳推廣和種植以及揮發(fā)油在農(nóng)林病害生物防治上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

黃金香柳枝葉于2015年7月23日采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園,標(biāo)本由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院鄭明軒老師鑒定。

1.2 儀器與試劑

主要儀器: 水蒸氣蒸餾裝置(北京永光明醫(yī)療儀器廠);6890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)(Agilent Technologies,USA);主要試劑: 正構(gòu)烷烴C8～C40(美國Sigma公司);硫酸鏈霉素(美國Sigma公司);氯化鈉、無水乙醚、無水硫酸鈉等均為國產(chǎn)分析純(北京化學(xué)試劑公司)。

1.3 黃金香柳揮發(fā)油的提取

參照Lou等[6]的方法。采集黃金香柳枝葉,稱重后將其裝入水蒸氣蒸餾裝置內(nèi),加入適量蒸餾水,待溫度升至100℃,有液滴滴下時開始計時,連續(xù)蒸餾6 h,收集蒸出的揮發(fā)油,加入一定量的NaCl,用無水乙醚連續(xù)萃取3次,合并萃取液,加入無水硫酸鈉進(jìn)行干燥,濃縮萃取液或讓無水乙醚自然揮發(fā),待揮發(fā)干后計算得率,4℃密封保存,備用。

1.4 黃金香柳揮發(fā)油化學(xué)組分的GC-MS分析

黃金香柳揮發(fā)油化學(xué)組分的鑒定在6890N-5975C GC-MS上進(jìn)行,色譜柱為DB-5(30 m×250 μm×0.25 μm),無分流進(jìn)樣,進(jìn)樣量1 μL。升溫程序:進(jìn)樣口溫度230℃,起始溫度70℃,保持1 min,以8℃/min上升到120℃,保持1 min,以30℃/min上升到150℃,保持1 min,以5℃/min上升到175℃,保持0 min,再以1℃/min上升到180℃,保持0 min,最后以5℃/min上升到240℃,保持0 min。離子源溫度230℃,電離方式為EI,電離能量70 eV,載氣為He,流速1 mL/min,全掃描采集,質(zhì)譜檢測器(MSD)檢測。通過與標(biāo)準(zhǔn)化合物的保留時間和質(zhì)譜圖作對比,確定待測成分。

保留系數(shù)(retention index,RI)的測定[7-8]:系列正構(gòu)烷烴C8～C40用氯仿稀釋50倍,然后與上述GC條件一樣進(jìn)行分離,記錄C8～C40各正構(gòu)烷烴的保留時間。用線性升溫公式計算各成分的RI:RI=100n+100(lgtx-lgtn)/(lgtn+1-lgtn),其中tx、tn和tn+1分別為被分析的組分和碳原子數(shù)處于n和n+1之間的正烷烴(tn

1.5 黃金香柳揮發(fā)油抗菌活性的測定

供試細(xì)菌:均為革蘭氏陰性菌，包括枯草芽胞桿菌Bacillussubtilis、桉樹青枯菌Ralstoniasolanacearum、番茄瘡痂病菌Xanthomonasvesicatoria、黃瓜角斑病菌Pseudomonassyringaepv.lachrymans、大腸桿菌Escherichiacoli和根癌農(nóng)桿菌Agrobacteriumtumefaciens,以上菌株由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院森保教研室提供。

黃金香柳揮發(fā)油抗細(xì)菌活性的測定參照趙文越[9]和龔佑文[7]等的方法,略有改進(jìn)。供試細(xì)菌由于長期保存在-20℃下,在活性測定前,先用LB 平板進(jìn)行活化培養(yǎng)(28℃,暗)48 h,然后挑取單菌落,在LB液體培養(yǎng)基中搖培(28℃,暗,150 r/min)24 h,將菌液濃度稀釋到108cfu/mL備用。倒好平板后,用移液槍分別吸取50 μL菌液,用玻璃棒涂板。用鑷子夾取直徑6 mm的無菌濾紙片放在帶菌平板上,每皿放置3片,在濾紙片滴加8 μL的黃金香柳揮發(fā)油,每個菌種平行測定3次。陽性對照為8 μL的0.2%硫酸鏈霉素。然后將平板放在28℃,黑暗條件下培養(yǎng),24 h后測量抑菌圈直徑。采用SAS 8.2軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃金香柳揮發(fā)油化學(xué)成分分析

采用水蒸氣蒸餾法提取黃金香柳枝葉中的揮發(fā)油,得率為0.972% (以鮮重為基礎(chǔ))。黃金香柳揮發(fā)油總離子流色譜圖如圖1所示。通過GC-MS分析,各組分峰用NIST Library(2011版)質(zhì)譜庫進(jìn)行檢索,從黃金香柳枝葉中共鑒定出18個成分,占總相對含量的99.056%,采用GC峰面積歸一化法定量分析,計算出各成分的相對含量,黃金香柳枝葉揮發(fā)油組成成分及其相對含量見表1。從表中可以看出,黃金香柳揮發(fā)油主要是萜類化合物及其含氧衍生物,其中主要成分是甲基丁香酚,其相對含量高達(dá)92.185%;此外,肉桂酸甲酯的相對含量為3.795%,其余成分的相對含量均在0.4%以下。以上結(jié)果表明,黃金香柳枝葉中含有大量的揮發(fā)性成分,而揮發(fā)性油的成分主要是甲基丁香酚和肉桂酸甲酯,可作為觀賞樹種種植。

表1 黃金香柳揮發(fā)油成分及其含量測定結(jié)果

Table 1 Test results of the constituents and contents of volatile oils fromMelaleucabracteata

編號No.保留時間/minRetentiontime保留系數(shù)Retentionindex化合物Compound化學(xué)式Molecularformula分子量Molecularweight相對含量/%Relativecontent16.17310294-乙基鄰二甲苯4-Ethyl-o-xyleneC10H141340.12227.5851085D2-蒈烯D2-CareneC10H161360.16537.8901096α-葑烯α-FencheneC10H161360.315410.4471201茴香腦cis-AnetholC10H12O1480.261511.1471230香茅烯(-)-CitronelleneC10H181380.152613.1901306反式-肉桂酸甲酯(E)-3-PhenylacrylicacidmethylesterC10H10O21620.123714.49713585-丁子香酸5-AllylguaiacolC10H12O21640.178815.3411389肉桂酸甲酯MethylcinnamateC10H10O21623.795915.8751410甲基丁香酚MethyleugenolC11H14O217892.1851016.3031428(Z)-石竹烯(Z)-CaryophylleneC15H242040.1571117.84914901-isopropyl-7-methyl-4-methylene-1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahydronaphthaleneC15H242040.1681218.8061529δ-杜松烯δ-CadineneC15H242040.2761318.9031533l-卡拉烯l-CalameneneC15H222020.2601419.4321554欖香素ElemicinC12H16O32080.2641520.4221592δ-芹子烯δ-SelineneC15H242040.1571621.59316681,2,4a,5,6,8a-Hexahydro-4,7-dimethyl-1-(1-methylethyl)naphthaleneC15H242040.1961722.80717363,4,5-三甲氧基苯甲酸甲酯3,4,5-TrimethoxybenzoicacidmethylesterC11H14O52260.1221829.3542072葉綠醇PhytolC20H40O2960.160

圖1 黃金香柳揮發(fā)油總離子流色譜圖Fig.1 TLC of volatile oils from Melaleuca bracteata

2.2 黃金香柳揮發(fā)油的抗細(xì)菌活性

黃金香柳揮發(fā)油對6種細(xì)菌的抑制活性如圖2所示,從圖中看出,黃金香柳揮發(fā)油對6種供試細(xì)菌雖然表現(xiàn)出一定的抑菌作用,但抑菌效果不明顯;與陽性對照相比,黃金香柳揮發(fā)油對6種細(xì)菌的抑制活性均弱于硫酸鏈霉素。黃金香柳揮發(fā)油對不同細(xì)菌的抑制活性也略有不同,通過SAS分析發(fā)現(xiàn),對黃瓜角斑病菌和根癌農(nóng)桿菌的抑菌活性最好,抑菌圈直徑分別為(9.0±0.0)mm和(8.5±0.1)mm;而對大腸桿菌的抑菌效果最差,幾乎無抑制作用;對桉樹青枯病菌、番茄瘡痂病菌和枯草芽胞桿菌的抑制活性無顯著性差異,抑菌圈直徑在7.0～7.3 mm之間。

3 討論

黃金香柳作為園林景觀和綠化樹種,在我國南方尤其是華南地區(qū)種植廣泛。鐘昌勇等[4]采用水蒸氣蒸餾法測得黃金香柳揮發(fā)油的得率為1.13%,其中甲基丁香酚的相對含量達(dá)到95.45%;葉征美等[2]測得黃金香柳揮發(fā)油甲基丁香酚的相對含量為83.55%;秦榮秀等[10]研究發(fā)現(xiàn)黃金香柳芳香水和黃金香柳揮發(fā)油的主要化學(xué)成分基本一致,黃金香柳揮發(fā)油的主要成分為甲基丁香酚,含量達(dá)90%。本研究的結(jié)果表明,黃金香柳揮發(fā)油的得率為0.972%,其主要成分甲基丁香酚的相對含量為92.185%,這與前人的研究基本一致,但在化合物的數(shù)量以及相對含量上有所差異。一方面與黃金香柳的品種和生長地點等有關(guān),另一方面也與采集時間和提取方式有關(guān)。

圖2 黃金香柳揮發(fā)油的抗細(xì)菌活性Fig.2 Antibacterial activity of the volatile oils from Melaleuca bracteata

黃金香柳揮發(fā)油對6種供試細(xì)菌的生長表現(xiàn)出一定的抑制活性,但抑菌效果不明顯,可能與黃金香柳揮發(fā)油的主要成分有關(guān),甲基丁香酚廣泛存在于多種植物揮發(fā)油中,如細(xì)辛、肉豆蔻、辣椒、檸檬草、龍蒿、羅勒、八角茴香和茴香等[2],目前尚未見關(guān)于甲基丁香酚抑菌作用的研究。但甲基丁香酚作為橘小實蠅的引誘劑對性成熟的雄蟲具有強(qiáng)烈的引誘作用,引誘效果明顯且持效期長[2, 11-13],在生物防治上具有潛在的利用價值。肉桂酸甲酯又稱β-苯基丙烯酸甲酯,具有果香膏香,可作為制造香水香精、皂用香精的定香劑,也可作為食用香精。從黃金香柳枝葉中提取到的肉桂酸甲酯已被廣泛應(yīng)用于香料和防曬護(hù)膚品中[14],在食品、日用化妝品、制皂等方面有著廣泛的用途[15-16]。黃金香柳作為高產(chǎn)甲基丁香酚和肉桂酸甲酯揮發(fā)油的樹種具有潛在的研究前景和應(yīng)用價值,其本身能否作為生防樹種應(yīng)用于園林病蟲害的防治還有待于更深入的研究。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Chemical composition and antibacterial activity of the volatile oils fromMelaleucabracteata

Feng Hao, Zhu Yiming, Wang Wei, Liu Yi, He Jia, Wang Jun, Shan Tijiang

(GuangdongKeyLaboratoryforInnovativeDevelopmentandUtilizationofForestPlantGermplasms,CollegeofForestryandLandscapeArchitecture,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China)

Using hydro-distillation method, the volatile oil was extracted with a yield of 0.972% from fresh branches and leaves ofMelaleucabracteata. The chemical composition of the volatile oil was analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Totally eighteen components were identified from the volatile oil, which accounted for 99.056% of total volatile substances. Methyl eugenol (92.185%) and methyl cinnamate (3.795%) were the major compounds of the volatile oil. The essential oil showed a certain antibacterial activity on all six tested bacteria, and had better inhibition toPseudomonaslachrymansandAgrobacteriumtumefaciens, with the diameters of inhibition zone of (9.0±0.0) mm and (8.5±0.1) mm, respectively, which was weaker than that of streptomycin sulfate. The diameters of inhibition zone treated with streptomycin sulfate was (18.0±1.0) mm and (21.7±1.0) mm, respectively.

Melaleucabracteata； volatile oil； chemical constituent analysis； antibacterial activity

2016-01-06

2016-02-21

廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項目(2015KJCH043);廣東省普通高校青年創(chuàng)新人才項目(2014KQNCX034)。

S 482.292, TQ 455

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.01.035

* 通信作者 E-mail:tjshan@scau.edu.cn