番茄青枯病病原菌拮抗菌株的篩選及其田間防控作用研究

王麗麗, 周旭東, 李國(guó)安, 姚紅燕, 汪 峰

(1.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,寧波 315040; 2.寧波致富寶生物科技有限公司,寧波 315324)

番茄青枯病病原菌拮抗菌株的篩選及其田間防控作用研究

王麗麗1, 周旭東2, 李國(guó)安1, 姚紅燕1, 汪 峰1

(1.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,寧波 315040; 2.寧波致富寶生物科技有限公司,寧波 315324)

從番茄青枯病發(fā)病嚴(yán)重田塊的健康植株根際土壤中分離篩選得到2株高效拮抗菌株,命名為W12和W118,經(jīng)16S rDNA基因鑒定均屬芽胞桿菌屬;用PCR擴(kuò)增的方法擴(kuò)增脂肽類抗生素合成基因,結(jié)果表明W12和W118含有合成bacillomycin、iturin和fengycin三種抗生素的基因;將2株拮抗菌用于田間試驗(yàn),結(jié)果表明混合菌株防控效果最好,3次灌菌后防控效果達(dá)到62.3%,單獨(dú)施用菌株W118較單獨(dú)施用W12防控效果好,3次灌菌后防控效果達(dá)到56.7%。

番茄青枯病; 拮抗菌; 抗生素合成基因

青枯病是一種滅絕性的土傳細(xì)菌病害,它是由茄科勞爾氏菌Ralstoniasolanacearum入侵植株根部組織而引起的,其大規(guī)模分布于熱帶、亞熱帶以及溫帶地區(qū),在我國(guó)南方地區(qū)番茄上最為流行[1-2]。該病可造成被侵染作物大面積萎蔫直至死亡,發(fā)病嚴(yán)重的田塊青枯病的發(fā)病率高達(dá)80%以上,使得番茄產(chǎn)量急劇下降,嚴(yán)重制約了我國(guó)南方地區(qū)番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

目前防控番茄青枯病常用的方法主要有:施用化學(xué)農(nóng)藥、利用土壤改良劑、選育具有抗病性能的品種、嫁接及與禾本科作物輪作等,但效果均不穩(wěn)定[3-4]。此外,施用化學(xué)農(nóng)藥還會(huì)引起一系列的環(huán)境污染和食品安全問(wèn)題。因此生物防治將會(huì)是一條環(huán)保、經(jīng)濟(jì)、有效的防控途徑。

番茄青枯病的生物防治主要是應(yīng)用拮抗微生物及其代謝產(chǎn)物來(lái)控制病原菌。從土壤中分離篩選到高效拮抗病原微生物的拮抗菌是生物防治成功的前提。芽胞桿菌產(chǎn)生的芽孢具有耐高溫性,而且還能在輻射、高酸堿等逆境下存活,因此,篩選出高效拮抗芽胞桿菌備受重視。丁傳雨等[5]用篩選得到的2株芽胞桿菌的菌液防控馬鈴薯青枯病,防控效果分別為85.1%和82.1%。鄭新艷等[6]用篩選得到的拮抗菌株防控馬鈴薯青枯病,發(fā)現(xiàn)其不但能夠有效拮抗青枯菌,還能提高馬鈴薯根系土壤微生物的多樣性,有助于克服土壤連作障礙。本試驗(yàn)篩選和分離得到2株抑制番茄青枯病菌的高效芽胞桿菌菌株,并對(duì)其進(jìn)行了分子鑒定和拮抗基因的擴(kuò)增,檢測(cè)了拮抗菌的田間效果,旨在為番茄青枯病的生物防治工作提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試土壤

分別從寧波奉化、鄞州、江北、寧海、余姚、慈溪等青枯病發(fā)病嚴(yán)重地塊采集健康植株根際土壤35份。將植株連同根系一起連根拔起,輕輕地抖動(dòng),待植株根部大部分土壤被抖落后,將剩下緊貼根部的土壤連同須根一起收集起來(lái),用自封袋裝好,放入4℃冰箱保存。

1.1.2 供試菌株和培養(yǎng)基

青枯病菌菌株為由本實(shí)驗(yàn)室篩選、鑒定、保存的一株茄科勞爾氏菌。

牛肉膏蛋白胨改良培養(yǎng)基(NA):每1 000 mL培養(yǎng)基中加葡萄糖10 g,蛋白胨5 g,酵母粉0.5 g,牛肉膏3 g,瓊脂粉15 g,pH 7.0。

1.2 拮抗菌株的分離、篩選

10 g健康番茄植株根際土壤投入裝有90 mL ddH2O的錐形瓶中,在30℃搖床上劇烈振蕩30 min,靜置30 min。取上清液系列稀釋涂布于改良牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上,每個(gè)梯度設(shè)置3次重復(fù),放置于30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后,用喉頭噴霧器將濃度為1.0×108cfu/mL青枯菌菌懸液噴于其表面,待平板上顯現(xiàn)明顯的抑菌圈后,用接種針選取有抑菌圈,且形態(tài)不同的菌落,在新的平板上進(jìn)行畫線純化。

在改良牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上用滅菌牙簽接種純化后的菌株,放置于30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h,將1.0×108cfu/mL的青枯病菌菌液均勻噴灑于平板上,48 h后測(cè)定抑菌圈直徑,每個(gè)菌株設(shè)置3次重復(fù),選擇抑菌圈大于15 mm的菌株保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 菌株16S rDNA鑒定

用市售細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取拮抗菌株W12和W118的基因組DNA,采用細(xì)菌16S rDNA 基因的通用引物:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和3′-TACCTTGTTACGACTT-5′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序設(shè)置如下:94℃ 5 min;94℃ 60 s,53℃60 s,72℃ 2 min,設(shè)置35個(gè)循環(huán);72℃ 7 min;4℃保持10 min。PCR反應(yīng)后的凝膠產(chǎn)物經(jīng)試劑盒回收純化后進(jìn)行測(cè)序分析,測(cè)序工作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.4 拮抗菌株基因組DNA中脂肽類抗生素合成基因的PCR檢測(cè)

采用PCR法檢測(cè)拮抗菌株基因組DNA中編碼脂肽類抗生素合成的基因。檢測(cè)的抗生素基因名稱、引物及其片段大小詳見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系如下:10×Taqbuffer 2.5 μL,25 mmol/L Mg2+1.5 μL, 2.5 mmol/L dNTPs 1.5 μL,25 pmol/μL上下游引物各2 μL,細(xì)菌基因組DNA 1 μL, 5 U/μLTaqDNA 聚合酶0.5 μL,ddH2O 14 μL,總體積25 μL。反應(yīng)程序:95℃ 5 min;95℃ 60 s, 55℃ 30 s, 72℃ 105 s, 35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min, 4℃保持10 min。

1.5 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

田間試驗(yàn)在寧波市鄞州區(qū)橫溪基地內(nèi)進(jìn)行。以1.2小節(jié)篩選出的拮抗效果較好的菌株為供試菌株,菌株發(fā)酵液濃度為108cfu/mL。于番茄移栽后1個(gè)月(幼苗期)開(kāi)始施用拮抗菌株發(fā)酵液,每隔7 d施用1次,共計(jì)4次。每株番茄苗澆灌10 mL,其中混合菌澆灌總共為10 mL。每個(gè)處理3次重復(fù),以施用等量清水為對(duì)照。

1.6 病情調(diào)查

試驗(yàn)開(kāi)始前調(diào)查并記錄各處理番茄植株的發(fā)病情況,選擇病情大致相同的區(qū)域進(jìn)行試驗(yàn),之后每次灌菌后統(tǒng)計(jì)各處理的病情指數(shù)和防控效果。根據(jù)植株葉片萎蔫程度,將發(fā)病級(jí)別分5級(jí)[7]:0級(jí),植株正常;1級(jí),植株葉片萎蔫程度不超過(guò)25%;2級(jí),植株葉片萎蔫程度超過(guò)25%且不超過(guò)50%;3級(jí),植株葉片萎蔫程度超過(guò)50%且不超過(guò)75%;4級(jí),植株葉片萎蔫程度超過(guò)75%。

表1 基因名稱及引物序列

Table1 Name of gene and primer sequence

基因名稱Nameofgene拮抗物質(zhì)Antibiotics引物名稱Primer引物序列(5'-3')Primersequence片段大小/bpLengthfenBfengycinFenB(正向)CTATAGTTTGTTGACGGGCTC1400FenB(反向)CAGCACTGGTTCTTGTCGCAituAiturinItuA(正向)ATGTATACCAGTCAATTCC1100ItuA(反向)GATCCGAAGCTGACAATAGituBiturinItuB(正向)TAAAGCAGCGGATAAAGCGT 874ItuB(反向)AATGGCGACTAACGTATCGGituCiturinItuC(正向)CCGTAATCAACCGTCTCGTT 640ItuC(反向)GGGTGAGCTGCAAACTTCTCituDiturinItuD(正向)GATGCGATCTCCTTGGATGT 647ItuD(反向)ATCGTCATGTGCTGCTTGAGbambacillomycinBam(正向)AAGAAGGCGTTTTTCAAGCA 508Bam(反向)CGACATACAGTTCTCCCGGT

病情指數(shù)=∑(病級(jí)數(shù)×該病級(jí)植株數(shù))/

(最大病級(jí)數(shù)×植株總株數(shù))×100;

防控效果(%)=(對(duì)照組病情指數(shù)-

處理組病情指數(shù))/對(duì)照組病情指數(shù)×100[7]。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用DPS 7.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的分離、篩選

從35份土樣中共分離篩選出121株平板菌落特征不同的拮抗菌株,其中28株有抑菌效果,經(jīng)過(guò)多次純化復(fù)篩,其中W118與W12菌株抑菌效果最好,且比較穩(wěn)定,W118拮抗圈直徑達(dá)到30 mm以上,W12菌株拮抗圈直徑為28 mm(圖1)。

圖1 拮抗菌株對(duì)茄科勞爾氏菌的平板抑制效果Fig.1 Inhibition of W12 and W118 against Ralstonia solanacearum on NA medium

2.2 拮抗菌株的16S rDNA鑒定

將菌株W12和W118的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)序列進(jìn)行BLAST比對(duì)與分析,然后通過(guò)MEGA 5.1軟件采用neighbour-joining繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。分析結(jié)果顯示,拮抗菌株W12和W118的16S rDNA基因序列與跟其比對(duì)的100株芽胞桿菌屬細(xì)菌的同源相似性均在99%以上。其中W12與枯草芽胞桿菌B.subtilisDSM10 (AJ276351)的同源性最高,W118與解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciensDSM7 (NC014551)的同源性最高,因此,初步鑒定菌株W12和W118均屬于芽胞桿菌屬。

圖2 W12(a)和W118(b)與芽胞桿菌屬相關(guān)菌株基于16S rDNA基因序列的進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Evolutionary tree based on 16S rDNAsequences of strain W12(a), W118(b) and related strains of Bacillus sp.

2.3 拮抗菌株脂肽類抗生素合成基因的檢測(cè)與分析

通過(guò)PCR擴(kuò)增法從拮抗菌株W12基因組序列中成功擴(kuò)增出6個(gè)脂肽類抗生素合成基因,分別為Bam、ItuD、ItuC、ItuB、ItuA和FenB,這些基因分別為抗生素bacillomycin、iturin和fengycin的基因組成片段,其中ItuC擴(kuò)增條帶較暗,可能與引物的保守性有關(guān)。菌株W118擴(kuò)增出5個(gè)抗生素合成基因,分別是Bam、ItuD、ItuB、ItuA和FenB,對(duì)應(yīng)的抗生素分別是bacillomycin、iturin和fengycin。由此可知,菌株W12和W118有合成bacillomycin、iturin和fengycin的潛力(圖3)。

2.4 拮抗菌株發(fā)酵液對(duì)番茄青枯病田間防控效果

通過(guò)表2知,在田間施用拮抗菌株發(fā)酵液能有效抑制番茄青枯病的發(fā)生。W12和W118能顯著降低番茄青枯病發(fā)病率,1次灌菌后的防效分別達(dá)到19.3%和34.3%,兩菌混合的防效達(dá)到37.7%,灌菌3次后的防控效果最好,其中兩菌混合防效為62.3%,W118的防控效果略低,為56.7%。

圖3 拮抗菌株W12和W118基因組DNA中部分脂肽類抗生素合成基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3 PCR amplification of antagonistic genes in W12 and W118

處理Treatment1次灌菌后The1stapplicationofstrains病情指數(shù)Diseaseindex防控效果/%Controleffect2次灌菌后The2ndapplicationofstrains病情指數(shù)Diseaseindex防控效果/%Controleffect3次灌菌后The3rdapplicationofstrains病情指數(shù)Diseaseindex防控效果/%ControleffectW118(7.3±1.5)a(34.3±5.1)a(8.7±0.6)bc(49.0±8.6)a(9.3±1.5)b(56.7±4.1)aW12(9.0±1.7)a(19.3±7.8)b(12.0±1.0)b(29.7±9.1)b(13.0±2.7)b(39.7±3.1)bW12+W118(7.0±1.7)a(37.7±3.8)a(7.7±2.1)c(56.0±5.6)a(8.3±3.2)b(62.3±4.8)aCK(11.3±3.2)a-(17.3±3.2)a-(21.7±5.5)a-

1) 表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。同列中不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。 Data in the table are mean±SD.Different small letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level.

3 討論

茄科勞爾氏菌寄主廣泛,可以侵染200多種植物,涉及50多個(gè)科屬,其中以南方地區(qū)番茄、馬鈴薯以及煙草等作物受害最為嚴(yán)重[8]。生物防治是防控青枯病最為有效的途徑,目前主要是利用微生物對(duì)其進(jìn)行防控。本試驗(yàn)從寧波本地番茄青枯病發(fā)病嚴(yán)重田塊的健康植株根際土壤中通過(guò)平板對(duì)峙試驗(yàn)分離篩選到2株拮抗菌株W12和W118,對(duì)番茄青枯菌都具有高效且穩(wěn)定的抑菌作用。2個(gè)拮抗菌株是從植株根際處直接篩選而獲得的,對(duì)植物本身具有很強(qiáng)的親和能力,在植株根部接種后更易于在根際定殖存活。

利用生物防治手段防控番茄青枯病主要是利用生防菌在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生多種類型的具有拮抗性的代謝產(chǎn)物,其與植物通過(guò)直接或者間接作用達(dá)到抑制甚至殺死病原微生物的效果[9]。本試驗(yàn)從W12和W118菌株中均能擴(kuò)增得到bacillomycin、iturin和fengycin抗生素合成基因,說(shuō)明其均有產(chǎn)生多種拮抗性代謝產(chǎn)物的潛力,能夠有效地抑制病原菌的生長(zhǎng)。

有效控制田間番茄青枯病的發(fā)生是生物防治的最終目的,本試驗(yàn)將篩選出的兩株高效拮抗菌經(jīng)發(fā)酵后用于田間,其中單一菌株W118和W12在3次灌菌后的防控效果分別達(dá)到56.7%和39.7%,混合菌株在3次灌菌后的防控效果達(dá)到62.3%,說(shuō)明在田間施用拮抗菌對(duì)番茄青枯病有較好的防控效果。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Screening and identifying of antagonistic bacteria againstRalstoniasolanacearumand the control effects on tomato bacterial wilt in the field

Wang Lili1, Zhou Xudong2, Li Guoan1, Yao Hongyan1, Wang Feng1

(1.NingboAcademyofAgriculturalSciences,Ningbo315040,China; 2.NingboZhifubaoBiologicalScienceandTechnologyCo.,Ltd,Ningbo315324,China)

Bacterial strains W12 and W118, isolated from the rhizosphere soil of tomato in Ningbo，could antagonize againstRalstoniasolanacearum. Based on the 16S rDNA sequence analysis, W12 and W118 were preliminarily identified asBacillusspp. The genes responsible for biosynthesis of bacillomycin, iturin and fengycin were identified in both W12 and W118 strains by PCR amplification. The field trials showed that the control effect of mixed bacterial suspension of W12 and W118 reached 62.3% after irrigations for three times, while when used alone,the control effect of strain W118 was 56.7%, which was better than that of strain W12.

tomato bacterial wilt; antagonist bacteria; antibiotic biosynthesis genes

2016-01-28

2016-03-23

寧波市科技局一般攻關(guān)項(xiàng)目(2014C10051)

S 144.9

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.01.033

聯(lián)系方式 E-mail: wanglili531@163.com