蘋果輪紋病菌對(duì)戊唑醇的敏感性及其抗性突變體的致病力

范 昆, 付 麗, 李曉軍, 翟 浩, 劉 璐, 曲健祿*

(1. 山東省果樹研究所,泰安 271000; 2. 山東省泰安市林業(yè)局,泰安 271000)

蘋果輪紋病菌對(duì)戊唑醇的敏感性及其抗性突變體的致病力

范 昆1, 付 麗1, 李曉軍1, 翟 浩1, 劉 璐2, 曲健祿1*

(1. 山東省果樹研究所,泰安 271000; 2. 山東省泰安市林業(yè)局,泰安 271000)

為明確蘋果輪紋病菌對(duì)戊唑醇的敏感性及其抗性突變體的致病力,采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了130株蘋果輪紋病菌菌株對(duì)戊唑醇的敏感性,采用藥劑馴化和紫外線誘導(dǎo)的方式獲得抗性突變體,并研究其生存適合度。結(jié)果表明,戊唑醇對(duì)130個(gè)菌株的EC50分布在0.051 6～1.925 4 μg/mL,均值為(0.799 6±0.039 1)μg/mL,表明蘋果輪紋病菌開始出現(xiàn)敏感性下降的亞群體。供試蘋果輪紋病菌菌株的抗性頻率為71.54%,各省份均未出現(xiàn)高抗菌株。藥劑馴化、紫外誘導(dǎo)共獲得3株抗性倍數(shù)分別為58.82倍、41.60倍、38.19倍的高抗菌株?？剐酝蛔凅w致病力、適合度指數(shù)與敏感菌株相比沒有顯著性差異。無藥培養(yǎng)9代后,各抗性突變體EC50逐漸下降,所獲抗性可能不能穩(wěn)定遺傳。表明蘋果輪紋病菌對(duì)戊唑醇的抗性在田間自然選擇壓力下可能會(huì)逐漸降低。

蘋果輪紋病菌; 戊唑醇; 敏感性; 突變體; 致病力

三唑類殺菌劑是20世紀(jì)70年代中后期開發(fā)的一類新型廣譜殺菌劑,是殺菌劑發(fā)展史上里程碑式的創(chuàng)新,歷經(jīng)幾十年的發(fā)展,在殺菌劑市場(chǎng)中的銷售份額位列第一[1-2]。戊唑醇的作用機(jī)理是抑制真菌麥角甾醇中間體的氧化脫甲基反應(yīng),具有內(nèi)吸、高效、廣譜、安全等特點(diǎn)[3],對(duì)鏈格孢屬Alternaria、疫霉屬Phytophthora、黑星菌屬Venturia、白粉菌屬Erysiphe、鐮刀菌屬Fusarium、柄銹菌屬Puccinia、喙孢屬Rhynchosporium、尾孢屬Cercospora、叢赤殼屬Nectria、核腔菌屬Pyrenophora、殼針孢菌屬Septoria、灰葡萄孢屬Botrytis引起的病害均有良好的防治效果[4-5]。該藥20世紀(jì)90年代中期正式在中國(guó)蘋果樹上登記使用[6],對(duì)蘋果輪紋病具有優(yōu)良的防治效果[5],近年來一直是防治蘋果輪紋病的首選藥劑。

戊唑醇因其強(qiáng)選擇性和作用位點(diǎn)專一性,使用中可能會(huì)導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性。據(jù)報(bào)道葡萄灰霉病菌Botrytiscinerea[7]、大麥云紋病菌Rhynchosporiumsecalis[8]、開心果枝枯病菌Botryosphaeriadothidea[9]、桃褐腐病菌Moniliniafructicola[10]、禾谷鐮刀菌Fusariumgraminearum[11]、紅球叢赤殼菌Nectriahaematococca[12]等病原菌均對(duì)戊唑醇產(chǎn)生了不同程度的抗性。目前,尚未見到關(guān)于蘋果輪紋病菌Botryosphaeriadothidea對(duì)戊唑醇產(chǎn)生抗性的報(bào)道,因此,本研究2013年采集了我國(guó)主要蘋果產(chǎn)區(qū)蘋果輪紋病菌，并測(cè)定了其對(duì)戊唑醇的敏感性,比較室內(nèi)誘導(dǎo)的抗藥性突變體與敏感菌株的適合度,以期預(yù)測(cè)該病原菌群體抗性發(fā)展趨勢(shì),為制定正確的防治策略及指導(dǎo)生產(chǎn)用藥提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

2013年8-10月從我國(guó)主要蘋果產(chǎn)區(qū)(山東省、河北省、陜西省、河南省、遼寧省、山西省)的果園內(nèi), 隨機(jī)采集枝干輪紋病病瘤、病果 (每個(gè)病瘤、病果采自相距10 km以上的果園),分離、純化、鑒定,共獲得130個(gè)蘋果輪紋病菌菌株,其中山東26株、河北22株、陜西21株、河南18株、遼寧23株、山西20株。

1.1.2 供試藥劑

98%戊唑醇(tebuconazole)原藥,江蘇常隆化工有限公司生產(chǎn)。將其溶于丙酮,配制成1×104μg/mL的母液,放置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 含藥培養(yǎng)基的配制

將戊唑醇母液用體積分?jǐn)?shù)為0.05%吐溫-80溶液稀釋,稀釋液中丙酮的含量控制在0.1%以下。用微量移液器吸取1 mL不同濃度的藥劑稀釋液分別加入到49 mL冷卻至50℃左右PDA培養(yǎng)基中,充分搖勻,配制成戊唑醇終濃度分別為2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 μg/mL的含藥培養(yǎng)基,以添加相同濃度吐溫-80和丙酮溶液為空白對(duì)照。

1.3 蘋果輪紋病菌對(duì)戊唑醇的抗性測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)率法[13]測(cè)定。在26℃下培養(yǎng)5 d 的PDA平板的菌落邊緣打取d=7 mm 的菌餅,分別移到1.2制備的含藥PDA平板上,26℃培養(yǎng)4 d,每處理(每菌株每濃度水平)重復(fù)4 次。用十字交叉法測(cè)定各處理的菌落生長(zhǎng)直徑,測(cè)定菌落徑向線性生長(zhǎng)量,確定藥劑對(duì)菌落生長(zhǎng)的抑制率,通過菌絲生長(zhǎng)抑制率概率值和藥劑濃度對(duì)數(shù)值之間的線性回歸分析求出各藥劑對(duì)菌株的有效抑制中濃度(EC50),并依據(jù)范昆等[14]建立的蘋果輪紋病菌對(duì)戊唑醇的敏感基線,計(jì)算抗性倍數(shù)(Rf)和抗性頻率。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均由Microsoft Excel 2013、SPSS數(shù)據(jù)處理工作平臺(tái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

抗性倍數(shù)(Rf)=供試菌株的EC50/敏感基線值,其中:Rf<2為敏感菌株;2≤Rf<5為低抗菌株;5≤Rf<10為中抗菌株;Rf≥10為高抗菌株[15]。

抗性頻率(%)=抗性菌株/供試菌株數(shù)×100。

1.4 蘋果輪紋病菌抗藥性突變體的誘導(dǎo)

以山東泰山南天門未施用過戊唑醇的蘋果樹上分離的菌株TS1 (EC50=0.011 1 μg/mL)[14]作為野生相對(duì)敏感型菌株。將TS1菌株穩(wěn)定培養(yǎng)后,接種到含1 μg/mL戊唑醇的PDA培養(yǎng)基上,26℃培養(yǎng)10～15 d后,選擇生長(zhǎng)相對(duì)較快的菌落再轉(zhuǎn)移至含2 μg/mL戊唑醇的培養(yǎng)基上,以此類推逐漸增加戊唑醇的質(zhì)量濃度。每選擇3代測(cè)定EC50,比較菌株對(duì)戊唑醇的抗性變化,連續(xù)選擇30代,每代篩選時(shí)每個(gè)菌株均接種30皿,每皿5個(gè)d=7 mm的菌餅。以親本菌株為對(duì)照,計(jì)算抗藥性突變體的抗性倍數(shù)。

抗性倍數(shù)=抗性突變體菌株的EC50/親本菌株的EC50

1.4.2 紫外誘導(dǎo)

參照Bruin等[16]、葉滔等[17]的方法并加以改進(jìn)。選擇采自泰山南天門野生蘋果樹上的菌株TS2、TS3、TS7、TS9、TS11、TS12,26℃培養(yǎng)5 d后打取d=7 mm的菌餅,接入含2 μg/mL戊唑醇(經(jīng)預(yù)試驗(yàn),該濃度下供試菌株不能生長(zhǎng))的PDA培養(yǎng)基上,每個(gè)菌株50皿,每皿4個(gè)菌餅。開蓋狀態(tài)下,將菌落置于紫外燈(30 W、波長(zhǎng)254 nm)下方垂直距離25 cm處分別照射30、45、75、110、140、180 s后立即置于黑暗條件下培養(yǎng)10 d(26℃),能正常生長(zhǎng)的菌落為疑似抗性突變體。將該疑似抗性突變體轉(zhuǎn)移到含2 μg/mL戊唑醇的PDA平板上繼續(xù)活化培養(yǎng)7～10 d(黑暗),將能較好生長(zhǎng)的抗藥性突變體記為第1代,并測(cè)定EC50(戊唑醇濃度1、2、4、8、16、32 μg/mL),計(jì)算抗性倍數(shù)和突變頻率。每處理平行測(cè)定4次,試驗(yàn)重復(fù)2次。

突變頻率(%)=(出現(xiàn)突變的菌餅數(shù)/供試菌餅數(shù))×100。

1.5 抗藥性突變體的適合度測(cè)定

參照Tooley等[18]、Kadish等[19-20]和朱書生等[21]的方法進(jìn)行適合度測(cè)定。比較藥劑馴化、紫外誘變的抗藥性菌株和敏感菌株接種蘋果離體果實(shí)和田間枝條后的發(fā)病率、病斑面積(接菌后7 d)和病斑長(zhǎng)度(接菌后10 d),并計(jì)算菌株的適合度指數(shù)。

綜合適合度指數(shù)=發(fā)病率×病斑面積(病斑長(zhǎng)度)。

1.5.1 離體果實(shí)接種

不管是什么建筑工程，都需要滿足功能要求才能夠開始施工建設(shè)，以保證建筑工程的適用性，保證建筑工程的功能均能夠正常運(yùn)行。

參照J(rèn)ohnson等[22]的接種方法略作調(diào)整。健康‘富士’果實(shí)用75%的乙醇表面消毒,滅菌水沖洗晾干后,在蘋果上相對(duì)應(yīng)的位置打2個(gè)孔(3 mm×3 mm)并接種d=3 mm的菌餅,接種后的蘋果放入托盤中用保鮮膜保濕。以與菌餅相同大小的培養(yǎng)基接種傷口作為對(duì)照。每個(gè)菌株設(shè)5次重復(fù),26℃下培養(yǎng)7 d,觀察果實(shí)發(fā)病情況,測(cè)量病斑直徑。

1.5.2 田間活體枝條接種

參照劉保友等[23]的方法,2014年5月在山東省曲阜市吳村果園,選取當(dāng)年生‘富士’蘋果樹枝條進(jìn)行接種試驗(yàn)。每菌株接種20個(gè)枝條,每個(gè)枝條接種1個(gè)7 mm的菌餅,以不接種菌餅處理為對(duì)照,10 d后調(diào)查發(fā)病率、病斑長(zhǎng)度。

1.6 抗性突變體的遺傳穩(wěn)定性測(cè)定

將藥劑馴化、紫外誘變的抗藥性突變體在無藥PDA培養(yǎng)基上、26℃下連續(xù)培養(yǎng)9代,測(cè)定第1、3、5、7、9 代突變體的EC50,計(jì)算抗性倍數(shù),分析其抗藥性能否穩(wěn)定遺傳。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果輪紋病菌對(duì)戊唑醇的敏感性

戊唑醇對(duì)130個(gè)菌株的EC50分布在0.051 6～1.925 4 μg/mL,最高值是最低值的37.31倍,EC50均值為(0.799 6±0.039 1)μg/mL。與范昆等[14]測(cè)定的蘋果輪紋病菌對(duì)戊唑醇的敏感基線(0.254 1±0.015 1)μg/mL相比,抗性倍數(shù)整體提高3.15倍,雖然抗性倍數(shù)沒有顯著性變化,但通過SPSS 分析S-W法正態(tài)檢驗(yàn)得知: W=0.932,P=0.000<0.05,偏度Skew=0.586,頻次分布圖呈負(fù)偏態(tài)(圖1),對(duì)戊唑醇敏感性的頻次分布不符合正態(tài)分布,這表明蘋果輪紋病菌對(duì)戊唑醇的藥劑敏感性開始出現(xiàn)分化,且出現(xiàn)敏感性降低的亞群體。

圖1 2013年蘋果輪紋病菌菌株對(duì)戊唑醇的敏感性頻次分布圖Fig.1 Frequency distribution of susceptibility of Botryosphaeria dothidea isolates to tebuconazole in 2013

2.2 2013年山東、河北、陜西、河南、遼寧、山西輪紋病菌對(duì)戊唑醇的敏感性測(cè)定

不同省份菌株對(duì)戊唑醇敏感性見表1。結(jié)果表明,不同省份菌株的敏感性存在一定的差異,其中河南省的平均EC50最高, 達(dá)0.934 9 μg/mL,平均抗性水平為1.17倍;其次為山東省、河北省、陜西省、山西省,EC50分別為0.928 1、0.832 0、0.774 8、0.701 4 μg/mL,平均抗性水平依次是1.16、1.04、0.97、0.88倍。遼寧省的EC50最低,為0.627 8 μg/mL,平均抗性水平為0.79倍。同一省份不同地區(qū)菌株的敏感性也存在較大的差異,以遼寧省為例,EC50的最低值是0.051 6 μg/mL,最大值則達(dá)1.621 7 μg/mL。

2.3 2013年山東、河北、陜西、河南、遼寧、山西蘋果輪紋病菌對(duì)戊唑醇的抗性水平

不同省份蘋果輪紋病菌對(duì)戊唑醇的抗性頻率見表2。供試菌株的抗性頻率高達(dá)71.54%, 但各省份均未出現(xiàn)高抗菌株,抗性倍數(shù)最高的菌株出現(xiàn)在山東省,抗性倍數(shù)為8.12倍,其他省份菌株抗性水平差異不明顯,其中山西省、遼寧省抗性菌株頻率很低,分別為65.00%、56.52%,出現(xiàn)的中抗性水平菌株頻率最低,分別為10.00%、17.39%,與其EC50平均值(0.701 4、0.627 8 μg/mL)均較低相呼應(yīng)。從抗性水平的分布來看,51.54%的菌株對(duì)戊唑醇的抗性水平在2～5倍之間,表明菌株對(duì)戊唑醇雖然產(chǎn)生抗性,但大部分菌株的抗性為低抗性水平。

表1 2013年不同地理來源蘋果輪紋病菌對(duì)戊唑醇的敏感性1)

Table 1 Susceptibility ofBotryosphaeriadothideato tebuconazole from different regions in 2013

省份Province菌株數(shù)/株No.ofisolateEC50范圍/μg·mL-1RangeofEC50valueEC50均值/μg·mL-1Mean±SD變異系數(shù)(CV)Coefficientofvariation平均抗性水平Meanresistancefactor山東Shandong260.2524～1.9254(0.9281±0.0921)aA0.50591.16河南Henan180.2846～1.6242(0.9349±0.1002)aA0.45451.17河北Hebei220.1069～1.6172(0.8320±0.0938)bB0.52891.04陜西Shaanxi210.1216～1.5216(0.7748±0.0974)cC0.57600.97遼寧Liaoning230.0516～1.6217(0.6278±0.0918)eE0.70150.79山西Shanxi200.1304～1.4309(0.7014±0.0906)dD0.57740.88平均Average--(0.7996±0.0391)cBC0.55791.00

1) 表中EC50均值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。同列數(shù)據(jù)后標(biāo)相同小寫(大寫)字母者表示經(jīng) Duncan’s 新復(fù)極差測(cè)驗(yàn),在P=0.05 (P=0.01)水平上差異不顯著。下同。 EC50are given as mean±SD. Data in a column followed by the same small (capital) letters are not significantly different atP=0.05 (P=0.01) by Duncan’s new multiple range test, respectively.The same below.

表2 2013年不同地理來源蘋果輪紋病菌對(duì)戊唑醇的抗性頻率

Table 2 Resistance frequency ofBotryosphaeriadothideato tebuconazole from different regions in 2013

省份Province抗性分布/%FrequencyofisolateswithdifferentresistancefactorsRf<22≤Rf<55≤Rf<10Rf≥10最高抗性倍數(shù)Thehighestresistanceratio抗性頻率/%Frequencyofresistance山東Shandong23.0853.8523.08-8.1276.93河北Hebei22.7354.5422.73-6.8277.27山西Shanxi35.0055.0010.00-6.0465.00遼寧Liaoning43.4839.1317.39-6.8756.52陜西Shaanxi33.3338.1028.57-6.4266.67河南Henan11.1161.1127.78-6.8588.89總計(jì)Total28.4651.5420.00-8.1271.54

2.4 抗藥性突變體的獲得及抗性水平測(cè)定

2.4.1 藥劑馴化誘導(dǎo)菌株的抗藥性

敏感菌株TS1在含藥培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)至30代,EC50由0.011 1 μg/mL(F0)增加到0.652 9 μg/mL(F30),F30代菌株為F0代的58.82倍,形成了較高水平的抗性菌株。蘋果輪紋病菌對(duì)戊唑醇抗性發(fā)展規(guī)律為(圖2):F0～F9為抗性緩慢發(fā)展階段,EC50由0.011 1 μg/mL增至0.073 4 μg/mL,抗性僅提高至F0的6.61倍;F9～F27為抗性快速發(fā)展階段,其EC50由0.073 4 μg/mL增至0.616 2 μg/mL,抗性由6.61倍增至55.51倍;F27～F30抗性發(fā)展較為平緩,進(jìn)入平臺(tái)期,抗性倍數(shù)由55.51倍增至58.82倍,形成了對(duì)戊唑醇具有較高抗性水平的菌株。

2.4.2 紫外馴化誘導(dǎo)菌株的抗藥性

采用紫外線對(duì)相對(duì)敏感菌株TS2、TS3、TS7、TS9、TS11、TS12進(jìn)行不同時(shí)間照射處理,75 s為最佳紫外線照射時(shí)間,共獲得15株疑似抗藥性突變體,其中能在含2 μg/mL戊唑醇的培養(yǎng)基上正常穩(wěn)定生長(zhǎng)的為5株抗性突變體,整體抗性突變頻率為0.417%,其親本菌株分別為TS7、TS11,抗性突變頻率分別為1.0%、1.5%。

圖2 蘋果輪紋病菌對(duì)戊唑醇的抗性發(fā)展規(guī)律Fig.2 Resistance development of Botryosphaeria dothidea to tebuconazole

測(cè)定抗性突變體對(duì)戊唑醇的敏感性,結(jié)果顯示EC50分布在0.300 6～0.911 1 μg/mL之間,對(duì)戊唑醇的敏感性均顯著下降(表3)。與敏感菌株相比,抗性突變體的抗性倍數(shù)在9.16～41.60之間,參照范昆[14]劃定的蘋果輪紋病菌對(duì)戊唑醇的抗性水平標(biāo)準(zhǔn),UV-TS7-3、UV-TS7-4、UV-TS11-6、UV-TS11-10為高抗突變體,UV-TS11-2為中抗突變體。

表3 抗藥性突變體及其親本菌株對(duì)戊唑醇的敏感性及其抗性水平

Table 3 Susceptibility and resistance level of parental isolates and resistant mutants to tebuconazole

菌株Isolate毒力回歸方程Regressionequation有效抑制中濃度/μg·mL-1EC50相關(guān)系數(shù)(r)Correlationcoefficient抗性倍數(shù)ResistanceratioTS7y=6.9869+1.1977x0.0219(0.0181～0.0266)0.99291.00UV-TS7-3y=5.8610+0.9372x0.8364(0.6091～1.0637)0.988938.19UV-TS7-4y=5.7868+0.9418x0.9111(0.6868～1.1354)0.989041.60TS11y=6.4841+1.0001x0.0328(0.0279～0.0386)0.99351.00UV-TS11-2y=5.5469+1.0476x0.3006(0.2526～0.3577)0.99359.16UV-TS11-6y=5.2126+1.1013x0.6412(0.5189～0.7923)0.989819.55UV-TS11-10y=5.0749+1.0217x0.8446(0.7160～0.9963)0.993825.75

2.5 抗藥性突變體適合度的測(cè)定

2.5.1 藥劑馴化抗藥性突變體的適合度

以藥劑馴化抗藥性突變體(F12、F21、F30)及敏感菌株TS1分別接種蘋果果實(shí)、枝條后,被接種的果實(shí)、枝條全部發(fā)病,且致病力未發(fā)生明顯變化,抗藥性突變體的適合度指數(shù)與敏感菌株相比沒有顯著性差異(表4),對(duì)病果、病枝條進(jìn)行再分離均可得到Botryosphaeriadothidea。

表4 藥劑馴化抗藥性突變體適合度的測(cè)定

Table 4 Fitness parameters of resistant mutants by chemical screening

菌株Isolate離體果實(shí)接種Fruitinoculation發(fā)病率Diseaseincidence病斑直徑/cmLesiondiameter綜合適合度Fitnessparameter活體枝條接種Branchinoculation發(fā)病率Diseaseincidence病斑長(zhǎng)度/cmLesionlength綜合適合度FitnessparameterTS11.003.203.20aA1.004.504.50aAF121.003.403.40aA1.004.704.70aAF211.003.303.30aA1.004.404.40aAF301.003.203.20aA1.004.604.60aA

2.5.2 紫外誘導(dǎo)抗藥性突變體的適合度

紫外誘導(dǎo)抗藥性突變體(UV-TS7-3、UV-TS7-4、UV-TS11-2、UV-TS11-6、UV-TS11-10)及敏感菌株(TS7、TS11)分別接種蘋果果實(shí)、枝條后,被接種的果實(shí)、枝條全部發(fā)病,且致病力未發(fā)生明顯變化,病斑面積與敏感菌株差異不顯著。離體果實(shí)法測(cè)定中,除UV-TS11-2外,其他抗性突變體的綜合適合度指數(shù)均高于敏感菌株,活體枝條法測(cè)定的適合度也表現(xiàn)出類似的趨勢(shì),除UV-TS11-2外,其他抗性突變體的綜合適合度指數(shù)均高于敏感菌株(圖3)。

2.6 抗性突變體的遺傳穩(wěn)定性測(cè)定

將藥劑馴化、紫外線誘導(dǎo)獲得的8個(gè)抗戊唑醇突變體及其親本菌株在無藥PDA 培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)9代后,各抗性突變體EC50均呈逐漸下降趨勢(shì)(表5～6),表明所獲得的抗性可能不能穩(wěn)定遺傳。其中,UV-TS7-3、UV-TS7-4的EC50降幅相對(duì)緩慢,在轉(zhuǎn)接至第9代時(shí)相較于其親本菌株抗性倍數(shù)仍很高,F12、F21、F30、UV-TS11-2、UV-TS11-6、UV-TS11-10的EC50降幅相對(duì)較大可能不能穩(wěn)定遺傳。

3 討論

戊唑醇是高效、廣譜、內(nèi)吸、輸導(dǎo)性、高選擇性的C-14α-脫甲基化酶抑制劑(C-14α-demethylation inhibitors,DMIs)[24],作用機(jī)制是抑制病原真菌麥角甾醇的合成,導(dǎo)致真菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞和細(xì)胞死亡,對(duì)多種重要作物病害具有良好的防治效果[3],現(xiàn)已成為果樹、農(nóng)作物、蔬菜等真菌病害化學(xué)防治的主要藥劑之一[25-26]。

圖3 紫外誘導(dǎo)抗藥性突變體適合度的測(cè)定Fig.3 Fitness parameters of resistant mutants by UV irradiating

抗藥性突變體Resistantmutant親本菌株EC50/μg·mL-1EC50valueofparentalstrainsEC50/μg·mL-1(抗性倍數(shù)Resistanceratio)F1F3F5F7F9F120.01110.1705(15.36)0.1591(14.33)0.1238(11.15)0.0908(8.18)0.0573(5.16)F210.4102(36.95)0.3061(27.58)0.2579(23.23)0.1815(16.35)0.1664(14.99)F300.6428(57.91)0.4345(39.14)0.4105(36.98)0.2214(19.95)0.1618(14.58)

表6 紫外誘導(dǎo)抗藥性突變體的抗性遺傳穩(wěn)定性

Table 6 Resistance genetic stability ofBotryosphaeriadothideamutants by UV irradiation to tebuconazole

抗藥性突變體Resistantmutant親本菌株EC50/μg·mL-1EC50valueofparentalstrainsEC50/μg·mL-1(抗性倍數(shù)Resistanceratio)F1F3F5F7F9UV-TS7-30.02190.8364(38.19)0.8246(37.65)0.8042(36.72)0.7815(35.68)0.7105(32.44)UV-TS7-40.9111(41.60)0.9046(41.31)0.9115(41.62)0.9041(41.28)0.8749(39.95)UV-TS11-20.03280.8446(25.75)0.7164(21.84)0.5034(15.35)0.4531(13.81)0.3284(10.01)UV-TS11-60.6412(19.55)0.5817(17.73)0.5163(15.74)0.4394(13.40)0.3857(11.76)UV-TS11-100.3006(9.16)0.2648(8.07)0.2135(6.51)0.1846(5.63)0.1507(4.59)

本實(shí)驗(yàn)室從2007年起就我國(guó)蘋果主產(chǎn)區(qū)輪紋病菌對(duì)戊唑醇的敏感性進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè),2007年采集的51株菌株EC50平均值為(0.254 1±0.015 1)μg/mL,田間沒有出現(xiàn)敏感性下降的亞群體[14]。2013年測(cè)定130個(gè)供試菌株的EC50均值為(0.799 6±0.039 1)mg/L,表明對(duì)戊唑醇的敏感性顯著降低且敏感性開始出現(xiàn)分化,出現(xiàn)敏感性降低的亞群體,這是因?yàn)槲爝虼奸L(zhǎng)期大面積使用導(dǎo)致病原菌對(duì)戊唑醇產(chǎn)生抗性,但整體抗性倍數(shù)比2007年僅提高3.15倍,抗性未出現(xiàn)顯著性提高,田間也未監(jiān)測(cè)到高抗性水平菌株,這可能與果園施藥方式、藥劑輪換使用、果實(shí)套袋及枝干對(duì)藥劑吸收程度差等因素有關(guān),同時(shí)與戊唑醇防治范圍廣泛密切相關(guān)。除蘋果輪紋病外,戊唑醇對(duì)蘋果斑點(diǎn)落葉病、炭疽病、褐斑病等蘋果主要病害均有良好的防治效果,使用范圍和次數(shù)越來越頻繁,已經(jīng)成為防治蘋果病害的主要藥劑,在DMIs類殺菌劑的選擇壓力下,田間病原菌都會(huì)相應(yīng)提高自己的適應(yīng)水平,于是敏感菌株的數(shù)量逐漸減少,抗性菌株的數(shù)量逐漸增多,而且這種情況會(huì)一直持續(xù)下去,直到抗性經(jīng)常發(fā)生從而變成一種常態(tài),藥劑就失去了防控作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明,供試菌株的抗性頻率高達(dá)71.54%,從抗性水平的分布來看,20%的菌株對(duì)戊唑醇的抗性水平在5倍以上,屬中抗藥性水平,抗藥性綜合治理工作依然形勢(shì)嚴(yán)峻。

20世紀(jì)70年代研究認(rèn)為,真菌對(duì)DMIs類殺菌劑產(chǎn)生抗性受多基因控制,抗性突變體的適應(yīng)性差,在自然界中難以形成抗性群體,因此認(rèn)為病原菌對(duì)DMIs類殺菌劑在田間產(chǎn)生抗性的風(fēng)險(xiǎn)很低[27-28]。但近幾十年來因?yàn)镈MIs殺菌劑大量推廣使用,目前如葡萄灰霉病菌Botrytiscinerea[7]、大麥云紋病菌Rhynchosporiumsecalis[8]、開心果枝枯病菌Botryosphaeriadothidea[9]、大麥白粉病菌Erysiphegraminis[29]、葡萄白粉病菌Uncinulanecator[30]、甜菜葉斑病菌Cercosporabeticola[31]、番茄葉霉病菌Fluviafulva[32]、草莓枯萎病菌Fusariumoxysporum[33]等病原菌均對(duì)DMIs殺菌劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性。因此,定時(shí)監(jiān)測(cè)蘋果輪紋病菌對(duì)戊唑醇的抗藥性對(duì)于今后田間抗藥性監(jiān)測(cè)和治理至關(guān)重要。

評(píng)價(jià)病原菌對(duì)殺菌劑的抗性風(fēng)險(xiǎn),國(guó)內(nèi)外一般采用藥劑馴化、紫外誘導(dǎo)菌絲或孢子突變的方法獲得抗性菌株[34-37]。經(jīng)過36代連續(xù)戊唑醇藥劑誘導(dǎo),獲得的抗性倍數(shù)為34.22倍的草莓枯萎病菌抗性菌株,與同類藥劑具有較高水平的交互抗性,抗性遺傳穩(wěn)定[33];利用戊唑醇進(jìn)行室內(nèi)誘導(dǎo),獲得了抗性倍數(shù)達(dá)33.4 倍的禾谷絲核菌抗性菌株[24];Akallal等[12]室內(nèi)誘導(dǎo)獲得了紅球叢赤殼菌的戊唑醇抗性菌株,與其他三唑類殺菌劑具有明顯的交互抗性。本研究對(duì)蘋果輪紋病菌進(jìn)行藥劑馴化和紫外誘導(dǎo),獲得抗性突變體的抗性倍數(shù)明顯高于田間采集菌株,藥劑馴化30代后獲得抗性倍數(shù)達(dá)58.82倍的較高水平的抗性菌株;紫外誘導(dǎo)抗性突變頻率較高,且能獲得抗性倍數(shù)達(dá)41.60倍的較高水平的抗性菌株。繼代培養(yǎng)9代后,各抗性突變體EC50均呈逐漸下降趨勢(shì),藥劑馴化突變體均不能穩(wěn)定遺傳,部分紫外誘導(dǎo)抗性突變體抗藥性能夠穩(wěn)定遺傳;但所有抗性突變體的適合度與敏感菌株之間無顯著性差異,由此說明,蘋果輪紋病菌抗性突變體與敏感菌株之間具有相似的生存適合度,在田間產(chǎn)生抗性突變種群的風(fēng)險(xiǎn)很大,在以后的病害防治中,應(yīng)注意藥劑的輪換使用或藥劑混配,以延緩田間蘋果輪紋病菌抗藥性的產(chǎn)生,但這一結(jié)論與田間菌株抗性發(fā)展緩慢不相符合,這可能與室內(nèi)誘導(dǎo)抗性突變體、田間自然抗性突變體及敏感菌株在自然環(huán)境下群體生存時(shí)競(jìng)爭(zhēng)力強(qiáng)弱有關(guān),本課題組會(huì)對(duì)敏、抗菌株生存競(jìng)爭(zhēng)力進(jìn)行后續(xù)研究。

4 結(jié)論

2013年測(cè)定130個(gè)供試菌株的EC50均值為(0.799 6±0.039 1)mg/L,與2007年相比出現(xiàn)對(duì)戊唑醇敏感性降低的亞群體;供試菌株的抗性頻率高達(dá)71.54%,20%的菌株對(duì)戊唑醇的抗性水平在5倍以上,屬中抗藥性水平,田間未監(jiān)測(cè)到高抗性水平菌株。藥劑馴化和紫外誘導(dǎo)獲得的部分較高水平的菌株抗藥性無法穩(wěn)定遺傳;抗性突變體的抗性倍數(shù)明顯高于田間采集菌株,但適合度無顯著性差異,在田間產(chǎn)生抗性突變種群的風(fēng)險(xiǎn)很大。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Susceptibility ofBotryosphaeriadothideato tebuconazole and virulence of its resistant mutants

Fan Kun1, Fu Li1, Li Xiaojun1, Zhai Hao1, Liu Lu2, Qu Jianlu1

(1.ShandongInstituteofPomology,Tai’an271000,China; 2.Tai’anCityForestryBureau,Tai’an271000,China)

130Botryosphaeriadothideaisolates were collected from major apple-produced regions to assess the susceptibility to tebuconazole by mycelium growth rate method and to test the virulence of resistance mutants. Resistant mutants were obtained by chemical screening and UV irradiation in the laboratory, and the fitness parameters of resistant and susceptible isolates were measured. The results showed that the EC50values of 130 isolates varied from 0.051 6-1.925 4 μg/mL with the mean of (0.799 6±0.039 1)μg/mL and low resistant subcolony has been discovered. The resistant ratio of tested isolates was 71.54% and high-resistant strains has not discovered in major apple-produced regions. The resistance level of three resistant mutants was high with the resistant ratio of 58.82, 41.60 and 38.19 times, respectively. The fitness and virulence of resistant mutants had no significant difference between resistant and susceptible isolates. The resistance ratio of mutants decreased gradually after 9 generations of subcultures in the absence of fungicides and the resistance could not inherit stably. The results indicated that the resistance ofB.dothideato tebuconazole could gradually decline when the field selection pressure became lower.

Botryosphaeriadothidea; tebuconazole; susceptibility; mutant; pathogenicity

2016-02-16

2016-04-26

山東省自然科學(xué)基金(ZR2013CQ040);國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-28);泰安市科技攻關(guān)項(xiàng)目(201540699)；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程(CXGC2016B07);山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科研基金(2016YQN32);山東省果樹研究所所長(zhǎng)基金(2013ky02)

S482.2

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.01.024

* 通信作者 E-mail:qujianlu@sina.com