溴蟲氟苯雙酰胺對小菜蛾的毒力及相關酶活性的影響

齊浩亮, 崔 麗, 王芹芹, 劉 峰, 芮昌輝*

(1. 山東農業(yè)大學植物保護學院,農藥毒理與應用技術重點實驗室,泰安 271018;2. 中國農業(yè)科學院植物保護研究所,農業(yè)部作物有害生物治理重點實驗室,北京 100193)

溴蟲氟苯雙酰胺對小菜蛾的毒力及相關酶活性的影響

齊浩亮1,2, 崔 麗2, 王芹芹2, 劉 峰1*, 芮昌輝2*

(1. 山東農業(yè)大學植物保護學院,農藥毒理與應用技術重點實驗室,泰安 271018;2. 中國農業(yè)科學院植物保護研究所,農業(yè)部作物有害生物治理重點實驗室,北京 100193)

溴蟲氟苯雙酰胺是一種全新的雙酰胺類殺蟲劑,主要用于防治鱗翅目、鞘翅目、白蟻以及蚊蠅等害蟲。為了明確溴蟲氟苯雙酰胺對小菜蛾的生物活性及解毒酶活性的影響,本研究選擇氯蟲苯甲酰胺為對照藥劑,采用葉片藥膜法測定了溴蟲氟苯雙酰胺對小菜蛾的生物活性,并測定了亞致死劑量(LC20、LC40)的溴蟲氟苯雙酰胺和氯蟲苯甲酰胺對小菜蛾多功能氧化酶、谷胱甘肽S-轉移酶和羧酸酯酶活性的影響。結果表明,溴蟲氟苯雙酰胺與氯蟲苯甲酰胺對小菜蛾的生物活性相當,兩者對小菜蛾的LC50分別為0.042和0.056 μg/mL。與氯蟲苯甲酰胺相似,亞致死劑量的溴蟲氟苯雙酰胺能夠誘導小菜蛾體內羧酸酯酶活性升高,但溴蟲氟苯雙酰胺對多功能氧化酶和谷胱甘肽S-轉移酶活性沒有顯著影響。

溴蟲氟苯雙酰胺; 小菜蛾; 毒力; 酶活性

小菜蛾PlutellaxylostellaLinnaeus屬于鱗翅目菜蛾科,是一種對十字花科蕓薹屬作物危害最嚴重的世界性害蟲[1]。小菜蛾主要通過幼蟲取食造成作物的減產甚至絕收。每年由小菜蛾造成的直接經濟損失以及用于防治小菜蛾的費用已經由20世紀90年代的10億美元[2]上升到如今的40～50億美元[3]。熱帶及亞熱帶單一寄主植物連續(xù)種植的地區(qū),小菜蛾一年最多可發(fā)生18～20代,高強度的殺蟲劑作為一種抗性選擇壓使小菜蛾在2～3年時間便會對一種新型殺蟲劑產生抗藥性[4]。根據2014年節(jié)肢動物殺蟲劑抗藥性數據庫(www.pesticideresistance.com)的數據顯示,小菜蛾已經對幾乎所有類型的用于防治其危害的殺蟲劑產生了抗藥性,包括有機磷類、有機氯類、氨基甲酸酯類、除蟲菊酯類、昆蟲生長調節(jié)劑類以及微生物制劑(如蘇云金芽胞桿菌)[5]。

氯蟲苯甲酰胺(chlorantraniliprole)是美國杜邦公司開發(fā)的高效、安全的雙酰胺類殺蟲劑,其作用方式新穎:通過與魚尼丁受體結合,激活鈣離子通道,引起細胞內鈣庫中的鈣離子過度釋放,使肌肉細胞喪失收縮功能[6],從而使害蟲迅速停止進食,出現乏力、反胃和肌肉癱瘓的癥狀,直至死亡[7-8]。氯蟲苯甲酰胺對幾乎所有的鱗翅目害蟲,部分鞘翅目、雙翅目和半翅目害蟲都有良好的防治效果[9]。氯蟲苯甲酰胺被廣泛用于小菜蛾的防治,但是短短幾年時間,在我國華南地區(qū),以及菲律賓、泰國和巴西均已發(fā)現對氯蟲苯甲酸胺產生高水平抗性的小菜蛾田間種群。據報道,我國廣東地區(qū)的小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺抗性已經達到2 140倍[10]。

溴蟲氟苯雙酰胺(broflanilide)是由日本三井農業(yè)化學公司和巴斯夫共同合作開發(fā)的新型雙酰胺類殺蟲劑,其化學結構如圖1所示。溴蟲氟苯雙酰胺主要用于防除綠葉蔬菜、多年生作物和谷物等作物上的鱗翅目、鞘翅目、白蟻以及蚊蠅等害蟲。目前還沒有該藥劑對小菜蛾的毒力報道,其作用機制也還未明確[11]。

圖1 溴蟲氟苯雙酰胺化學結構Fig.1 The chemical structure of broflanilide

本研究以氯蟲苯甲酰胺為對照藥劑,比較了溴蟲氟苯雙酰胺和氯蟲苯甲酰胺兩種藥劑對小菜蛾的毒力以及相關酶活性的影響,以期為溴蟲氟苯雙酰胺的推廣應用及其對小菜蛾的生化作用機理等研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試藥劑

99.59%溴蟲氟苯雙酰胺(broflanilide, MCI-8007)原藥,日本三井農業(yè)化學公司;98%氯蟲苯甲酰胺(chlorantraniliprole)原藥,美國杜邦公司。

1.1.2 化學試劑

乙二胺四乙酸(EDTA)、苯甲基磺酰氟(PMSF),Amresco公司;二硫代蘇糖醇(DTT)、還原性谷胱甘肽(GSH),Merck公司;苯基硫脲(PTU),Aladdin;對硝基苯甲醚(P-NA)、1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB),Aldrich公司;還原型輔酶Ⅱ(NADPHⅡ),Biotopped;考馬斯亮藍G-250,Fisher Scientific;β-醋酸萘酯(2-naphthyl acetate)、固藍B鹽(fast blue B),Sigma;十二烷基硫酸鈉(SDS),華美生物工程公司;牛血清蛋白(BSA),中國科學院東方儀器設備公司;毒扁豆堿(eserine),東京化成工業(yè)株式會社;磷酸、磷酸一氫鈉、磷酸二氫鈉、甘油,國藥集團化學試劑有限公司;丙酮、乙醇,北京化工廠。

1.1.3 主要儀器

1-16K微型離心機(美國Sigma公司);96孔酶標板(美國Corning公司);ELx800光吸收酶標儀(美國BioTek公司);IS-RDD3臺式恒溫振蕩器(美國精騏有限公司)。

1.1.4 供試蟲源

小菜蛾為室內逐代飼養(yǎng)的種群,不接觸任何藥劑,飼養(yǎng)方法參照楊峰山等[12]的方法,飼養(yǎng)及生測試驗條件:溫度(27±1)℃,濕度80%～90%,光周期L∥D=14 h∥10 h。

1.2 試驗方法

1.2.1 毒力測定

采用殺蟲劑抗性行動委員會(IRAC)推薦的葉片藥膜法[13],分別測定氯蟲苯甲酰胺和溴蟲氟苯雙酰胺對小菜蛾的毒力。將原藥溶于二甲基甲酰胺(DMF)中,分別配制成1%的氯蟲苯甲酰胺和溴蟲氟苯雙酰胺母液。在預試驗的基礎上,將母液用0.05%的曲拉通X-100稀釋,配制5～7個系列藥劑濃度。將油菜葉片洗凈晾干,在藥液中浸漬10 s,取出晾干放入直徑9 cm、底部墊有吸水濾紙的培養(yǎng)皿中,接入大小一致的3齡初幼蟲。每處理3次重復,每重復10頭試蟲。72 h后檢查死亡蟲數,計算各處理的校正死亡率。以解剖針輕觸蟲體,不能正常反應視為死亡。

1.2.2 酶活力測定

1.2.2.1 亞致死濃度處理

根據毒力測定結果,以各個藥劑72 h的LC20、LC40值作為亞致死劑量,以0.05%曲拉通X-100作為對照。取新鮮無農藥污染的油菜葉片,分別在0.05%曲拉通溶液和藥劑亞致死劑量藥液中浸漬10 s,取出晾干后放入直徑9 cm、底部墊有吸水濾紙的培養(yǎng)皿中,接入大小一致的3齡初幼蟲,飼喂72 h,計算各藥劑亞致死濃度下的校正死亡率。分別取不同處理后存活的幼蟲進行相關酶活性的測定。

1.2.2.2 酶液制備

取小菜蛾10頭(13～16 mg)加入2 mL pH 7.8、0.1 mol/L的PBS緩沖液(含1 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、1 mmol/L PTU、1 mmol/L PMSF和質量分數為10%的甘油)冰浴中整體研磨勻漿,勻漿液12 000 r/min、4℃離心15 min,上清液作為酶源。酶源作為多功能氧化酶(MFO)和谷胱甘肽S-轉移酶(GSTs)活性測定的酶液,將酶源用pH 7.0、0.04 mol/L的PBS緩沖液稀釋10倍作為羧酸酯酶(CarE)活性測定的酶液。每處理設6次生物學重復。

1.2.2.3 多功能氧化酶O-脫甲基活性測定

參考Yang等[14]的方法并略有改動。在96孔板中依次加入100 μL 2 mmol/L的P-NA,90 μL酶液和10 μL 9.6 mmol/L的NADPHⅡ。立即放入酶標儀,在405 nm下連續(xù)測定30 min內吸光度的變化。每個樣品設5次技術重復。

1.2.2.4 谷胱甘肽S-轉移酶(GSTs)活性測定

參考Oppenoorth等[15]的方法。在2 mL離心管中依次加入1.2 mL pH 7.4、66 mmol/L的PBS緩沖液(含2 mmol/L EDTA),0.15 mL 50 mmol/L的GSH, 0.05 mL 0.03 mol/L的CDNB和0.1 mL酶液,空白對照中加入1.3 mL pH 7.4、66 mmol/L的PBS緩沖液(含2 mmol/L EDTA)。在340 nm下連續(xù)測定5 min內吸光度的變化。每個樣品設3次技術重復。

1.2.2.5 羧酸酯酶(CarE)活性測定

參照van Asperen等[16]的方法,略有改動。每個待測酶液設置4個濃度,在2 mL離心管中分別加入0、0.028 5、0.057和0.085 5 mL酶液,以及相應的pH 7.0、0.04 mol/L的PBS緩沖液0.285、0.256 5、0.228和0.2 mL,然后在每個離心管中加入1.43 mL 3×10-4mol/L底物(含1×10-6mol/L的毒扁豆堿),混勻后置于30℃的搖床上反應30 min,最后加入0.285 mL顯色液(現配現用),搖勻后靜置30 min,用酶標儀測定600 nm下的吸光度。每個樣品設3次技術重復。

1.2.2.6 總蛋白含量測定

采用Bradfold等的考馬斯亮藍(G-250)[18]方法測定。

1.3 數據統(tǒng)計分析與處理

采用DPS 7.05軟件計算毒力回歸方程和致死中濃度,酶活力測定結果用SPSS軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 氯蟲苯甲酰胺和溴蟲氟苯雙酰胺對小菜蛾毒力

由表1可知,氯蟲苯甲酰胺和溴蟲氟苯雙酰胺對小菜蛾均有較高的毒力指數,兩種藥劑的LC50分別為0.056 μg/mL和0.042 μg/mL,都表現了良好的殺蟲活性,兩藥劑對小菜蛾的毒力沒有顯著差異。

氯蟲苯甲酰胺對小菜蛾的LC20和LC40分別為0.021 μg/mL和0.041 μg/mL,溴蟲氟苯雙酰胺對小菜蛾的LC20和LC40分別為0.020 μg/mL和0.034 μg/mL,分別以各藥劑LC20和LC40作為亞致死劑量處理3齡初小菜蛾幼蟲用于相關酶活性的測定。

經過反向驗證,即配制0.021 μg/mL和0.041 μg/mL的氯蟲苯甲酰胺溶液,處理小菜蛾3齡初幼蟲72 h后的校正死亡率分別為20.45%和40.27%;配制0.020 μg/mL和0.034 μg/mL的溴蟲氟苯雙酰胺溶液,處理小菜蛾3齡初幼蟲72 h后的校正死亡率分別為19.39%和40.82%,其死亡率分別接近20%和40%,因此以這幾個濃度分別作為兩種藥劑的LC20和LC40是合理的。

表1 氯蟲苯甲酰胺和溴蟲氟苯雙酰胺對小菜蛾的毒力

Table 1 Toxicity of chlorantraniliprole and broflanilide toPlutellaxylostella

藥劑InsecticideLC20(95%CL)/μg·mL-1LC40(95%CL)/μg·mL-1LC50(95%CL)/μg·mL-1回歸方程Regressionequation氯蟲苯甲酰胺Chlorantraniliprole0.021(0.011～0.038)0.041(0.028～0.060)0.056(0.042～0.075)y=1.94x+7.44r=0.984溴蟲氟苯雙酰胺Broflanilide0.020(0.015～0.029)0.034(0.026～0.045)0.042(0.032～0.056)y=2.66x+8.66r=0.976

2.2 氯蟲苯甲酰胺和溴蟲氟苯雙酰胺對小菜蛾體內相關酶活性的影響

經氯蟲苯甲酰胺和溴蟲氟苯雙酰胺不同濃度處理72 h后,小菜蛾體內多功能氧化酶活力如圖2所示。與對照相比,溴蟲氟苯雙酰胺LC20和LC40處理對多功能氧化酶沒有顯著影響;而氯蟲苯甲酰胺LC20和LC40處理后對多功能氧化酶表現出明顯的抑制作用,抑制率分別為28.86%和38.30%,兩濃度對小菜蛾多功能氧化酶活性影響沒有顯著差異。與對照相比,氯蟲苯甲酰胺和溴蟲氟苯雙酰胺不同處理對谷胱甘肽S-轉移酶活性均沒有顯著影響(圖3)。兩種藥劑不同處理對小菜蛾羧酸酯酶均有顯著的誘導作用。與對照相比,羧酸酯酶活力分別升高了26.77%、24.51%、27.29%和31.06%,各處理之間沒有明顯差異(圖4)。

圖2 亞致死劑量的溴蟲氟苯雙酰胺和氯蟲苯甲酰胺對小菜蛾多功能氧化酶活力的影響Fig.2 Effects of the sublethal concentrations of broflanilide and chlorantraniliprole on the activity of MFO of Plutella xylostella

兩種藥劑相比,氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量處理對多功能氧化酶表現出抑制作用,兩濃度之間差異不顯著,但溴蟲氟苯雙酰胺對多功能氧化酶沒有顯著影響。對羧酸酯酶的影響,兩種藥劑都有顯著的促進作用,且兩種藥劑不同處理之間無顯著差異。

3 討論

田間施用殺蟲劑后,害蟲大部分時間會處在藥劑的亞致死劑量環(huán)境下,殺蟲劑的亞致死效應提供了持續(xù)的選擇壓力,加快了害蟲抗藥性的產生[19]。近年來,藥劑的不合理施用使得害蟲抗藥性問題越來越突出。

圖3 亞致死劑量的溴蟲氟苯雙酰胺和氯蟲苯甲酰胺對小菜蛾谷胱甘肽S-轉移酶活力的影響Fig.3 Effects of the sublethal concentrations of broflanilide and chlorantraniliprole on the activity of GST of Plutella xylostella

圖4 亞致死劑量的溴蟲氟苯雙酰胺和氯蟲苯甲酰胺對小菜蛾羧酸酯酶活力的影響Fig.4 Effects of the sublethal concentrations of broflanilide and chlorantraniliprole on the activity of CarE of Plutella xylostella

氯蟲苯甲酰胺2008年在中國上市,由于其作用位點單一,若長期廣泛使用,有較高的抗性風險[9]。據報道,2010年廣東省田間小菜蛾就對氯蟲苯甲酰胺產生了抗性[20],2012年監(jiān)測數據顯示,廣東增城地區(qū)小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺的抗性已達2 140倍[10]。溴蟲氟苯雙酰胺作為一種全新的還未投入市場的雙酰胺類殺蟲劑,在室內試驗中對小菜蛾表現出了和氯蟲苯甲酰胺相當的優(yōu)異的殺蟲活性。但由于其殺蟲機理尚未明確,害蟲對其產生抗性的風險還不清楚。另外,溴蟲氟苯雙酰胺是否與氯蟲苯甲酰胺存在交互抗性也需要在以后的試驗中進行探索。

昆蟲通過提高其體內解毒酶活性將進入其體內的有毒化合物氧化、還原、水解或結合,以增強其水溶性,將其轉變成低毒或無毒的物質,使之排出體外,從而達到解毒的目的[21]。昆蟲體內的解毒酶主要包括多功能氧化酶(MFO)、羧酸酯酶(CarE)和谷胱甘肽S-轉移酶等[22-23]。MFO是殺蟲劑解毒代謝的最重要的酶系之一,對包括擬除蟲菊酯、氨基甲酸酯、有機磷等在內的多種殺蟲劑都有不同水平的解毒代謝作用[24]。酯酶在昆蟲對氨基甲酸酯類和有機磷類殺蟲劑產生抗性中具有重要作用[25]。谷胱甘肽S-轉移酶與小菜蛾對有機磷類、阿維菌素、擬除蟲菊酯類和Bt的抗性有關[26]。邢靜等研究發(fā)現,經亞致死濃度的氯蟲苯甲酰胺短期處理(72 h)后,對小菜蛾CarE 活性具有明顯的誘導作用,但對GSTs和MFO的活性則均表現出明顯的抑制作用[9];Cao等的研究表明:經0.1 μg/mL的氯蟲苯甲酰胺處理可誘導棉鈴蟲敏感品系酯酶和GSTs活性升高[27];Sial等的研究表明,酯酶活性升高是稻縱卷葉螟對氯蟲苯甲酰胺產生低倍抗性的主要原因[28]。

本研究從昆蟲對溴蟲氟苯雙酰胺和氯蟲苯甲酰胺的解毒代謝機制出發(fā),比較了兩種藥劑亞致死劑量對小菜蛾體內3種解毒酶活性的影響。結果表明,溴蟲氟苯雙酰胺和氯蟲苯甲酰胺兩種藥劑亞致死劑量均能引起小菜蛾體內的生理代謝反應。其中兩藥劑亞致死劑量處理均能誘導羧酸酯酶活性提高,但對谷胱甘肽S-轉移酶沒有影響。兩者對多功能氧化酶的影響不同,氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量處理顯著抑制了多功能氧化酶的活力,而溴蟲氟苯雙酰胺對多功能氧化酶活力無明顯影響。因此羧酸酯酶可能參與了對兩種藥劑的解毒代謝作用,這與邢靜等[9]和Sial等[28]的研究結果一致。

本研究中對小菜蛾體內解毒酶活性的測定均是在兩種藥劑短期脅迫下進行的,要明確某種解毒酶是否確實參與了小菜蛾對溴蟲氟苯雙酰胺的代謝還需要進一步的系統(tǒng)研究。本研究結果對于溴蟲氟苯雙酰胺合理使用、減少其不良副作用及延緩其抗藥性的產生具有一定的指導作用。

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(責任編輯：田 喆)

Toxicity of broflanilide toPlutellaxylostellaand its influence on the activities of related enzymes inP.xylostella

Qi Haoliang1,2, Cui Li2, Wang Qinqin2, Liu Feng1, Rui Changhui2

(1.KeyLaboratoryofPesticideToxicology&ApplicationTechnique,DepartmentofPlantProtection,ShandongAgriculturalUniversity,Tai’an271018,China; 2.InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,KeyLaboratoryofIntegratedPestManagementinCrops,MinistryofAgriculture,Beijing100193,China)

Broflanilide is a new diamide insecticide. It is mainly used for the control of lepidopteran and coleopteran pests as well as termites, mosquitoes, houseflies and so on. In order to determine the insecticidal activity and the effects of broflanilide on the activity of related enzymes inPlutellaxylostella, chlorantraniliprole was chosen as the control agent and leaf-dip method was used. The effect of sublethal concentrations (LC20and LC40) of broflanilide and chlorantraniliprole on multifunctional oxidase (MFO), glutathioneS-transferase (GSTs) and carboxylesterase (CarE) were investigated. The results showed that broflanilide had high insecticidal activity againstP.xylostella. The LC50value of broflanilide was 0.042 μg/mL, while that of chlorantraniliprole was 0.056 μg/mL. The treatment of LC20and LC40of broflanilide increased the activity of CarE, but had no significant effects on GSTs and MFO.

chlorantraniliprole; diamondback moth; toxicity; activity of enzyme

2016-03-24

2016-04-15

公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(201203038)

S 481.1

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.01.018

* 通信作者 E-mail:fliu@sdau.edu.cn;chrui@ippcaas.cn