藍(lán)莓間座殼莖潰瘍病病原鑒定及生物學(xué)特性研究

李 媛, 石凌波, 費諾亞, 傅俊范, 嚴(yán)雪瑞

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,沈陽 110866)

藍(lán)莓間座殼莖潰瘍病病原鑒定及生物學(xué)特性研究

李 媛, 石凌波, 費諾亞, 傅俊范, 嚴(yán)雪瑞*

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,沈陽 110866)

在藍(lán)莓園進(jìn)行病樣采集時,發(fā)現(xiàn)一種藍(lán)莓莖部病害,病斑呈紅褐色,潰瘍狀,長橢圓形。為明確該病害的病原菌種類,對病枝進(jìn)行組織分離,經(jīng)單孢純化后得到菌落形態(tài)一致的7株致病菌,對供試菌株的ITS與EF1-α基因聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,供試菌株與Diaporthephaseolorum處于同一分支,結(jié)合形態(tài)學(xué)特征,鑒定該病原菌為Diaporthephaseolorum。對病原菌的生物學(xué)特性研究結(jié)果表明,該菌最適培養(yǎng)基為PDA,最適生長溫度為25℃,光照對菌絲生長無明顯影響。本文首次報道Diaporthephaseolorum引起藍(lán)莓莖潰瘍病。

藍(lán)莓; 間座殼屬; 莖潰瘍病; 鑒定

藍(lán)莓Vacciniumspp.,又名越橘、藍(lán)漿果,屬于杜鵑花科Ericaceae,越橘屬Vaccinium叢生灌木,果實營養(yǎng)豐富,20世紀(jì)80年代中期引進(jìn)國內(nèi)并開始大面積商業(yè)化種植栽培,隨著種植面積不斷擴(kuò)大,藍(lán)莓病害問題也日益嚴(yán)重[1-2]。

間座殼屬病原菌可引起藍(lán)莓莖潰瘍病、藍(lán)莓果腐病等多種病害,國外已報道該屬危害藍(lán)莓種有Diaporthevaccinii[3]、D.ambigua[4]、D.australafricana[4]、D.neotheicola[4]、D.passiflorae[4]、D.viticola[5]、D.asheicola[5]、D.baccae[5]和D.sterilis[5]。我國目前已報道可侵染藍(lán)莓的種有D.vaccinii[6]和D.eres[7]。

2013-2014年在遼寧莊河市、丹東市,黑龍江伊春市,福建長汀縣藍(lán)莓園進(jìn)行病樣采集時發(fā)現(xiàn)了一種藍(lán)莓莖部病害。病斑潰瘍狀,長橢圓形,紅褐色,后期呈灰白色。本研究對該病害進(jìn)行病原菌分離純化以及柯赫氏法則證病,將引起該病害的病原菌與已經(jīng)報道的間座殼屬病原菌在形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)以及發(fā)病癥狀上進(jìn)行比較,確定在我國可侵染藍(lán)莓的間座殼屬病原菌種類。

1 材料方法

1.1 病原菌分離

采用組織分離法和單孢分離法對病樣進(jìn)行病原菌分離和純化[8]。用無菌水沖洗病部枝條,在病健交界處切取5 mm×5 mm組織塊,用75%乙醇進(jìn)行表面消毒30 s后放入0.1%升汞溶液中浸泡30 s,無菌水沖洗3次后置于PDA(馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂粉20 g,水1 000 mL)培養(yǎng)基上,在25℃,12 h光暗交替條件下培養(yǎng)3～7 d,挑取尖端菌絲純化,培養(yǎng)菌株至產(chǎn)生分生孢子,進(jìn)行單孢純化,并將純化后的菌株保存在PDA斜面上,于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病原菌致病性測定

采取活體植株接種菌餅的方法對分離得到的7株菌進(jìn)行致病性測定,取兩年生健康藍(lán)莓植株,對藍(lán)莓枝條進(jìn)行表面消毒,用無菌解剖刀制造環(huán)狀傷口,將直徑5 mm菌餅接種到傷口上,用無菌脫脂棉進(jìn)行保濕處理,以無菌PDA塊作為對照,重復(fù)3次[4]。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(28℃,90%RH)。培養(yǎng)3 d后去掉菌餅,每隔3 d統(tǒng)計發(fā)病情況。

1.3 病原菌鑒定

(1) 形態(tài)學(xué)鑒定:取直徑5 mm的菌餅置于PDA上,在25℃、12 h光暗交替條件下培養(yǎng)5 ～7 d,觀察菌落形態(tài)。將菌餅放置于無菌苜蓿稈+WA培養(yǎng)基上[9]于25℃,黑暗培養(yǎng),誘導(dǎo)菌株產(chǎn)生分生孢子器,觀察菌株產(chǎn)孢情況并測量兩種類型分生孢子及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)大小,每種類型的孢子及分生孢子梗測量100個并取其平均值。

(2)分子生物學(xué)鑒定:用CTAB法提取菌株總DNA,以ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) /ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)以及EF1-728F(5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′)/EF1-986R(5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3′)為引物分別擴(kuò)增菌株ITS及EF1-α基因序列。反應(yīng)體系以及反應(yīng)程序參照Udayanga 等[10]的方法。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測后送至生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行純化,測序。

(3) 序列分析:測序結(jié)果在NCBI/GenBank中進(jìn)行比對,下載模式菌株及相關(guān)菌株序列以及藍(lán)莓上已經(jīng)報道的間座殼屬菌株序列[3-4,7,10-12](表1)。用Mafft-win軟件進(jìn)行序列比對后,對聯(lián)合基因分別采用最大簡約法(MP)及貝葉斯法(BI)進(jìn)行分析,以DiaporthellacorylinaCBS121124作為外群。MP分析采用PAUP4.0b10進(jìn)行,bootstrap重復(fù)值采用1 000,將供試序列導(dǎo)入MrMTgui軟件,預(yù)測出最佳進(jìn)化模型,用Mrbayes軟件對供試序列進(jìn)行BI分析。結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果,挑選與供試菌株親緣關(guān)系較近的代表菌株序列,分別進(jìn)行二次系統(tǒng)發(fā)育分析。

表1 用于ITS和EF1-α基因聯(lián)合構(gòu)建藍(lán)莓間座殼潰瘍病菌系統(tǒng)發(fā)育分析的相關(guān)模式菌株基因登錄號

Table 1 ITS and EF1-α accession numbers in GenBank ofDiaportheisolates used for phylogenetic analyses in this study

種Species菌株號Strain寄主Host采集地Location基因登錄號GenBankaccessionno.ITSEF1-αD.alleghaniensis CBS495.72加拿大黃樺Betulaalleghaniensis加拿大CanadaKC343007KC343733D.vacciniiCBS160.32大果蔓越莓Oxycoccusmacrocarpus美國USAKC343228KC343954D.eresLNSY003藍(lán)莓Vacciniumsp.中國ChinaKJ867089KJ867090AR5196榆屬Ulmussp.德國GermanyKJ210533KJ210554D.infecundaCBS133812巴西胡椒木Schinusterebinthifolius 巴西BrazilKC343126KC343852D.ambiguaCBS114015西洋梨Pyruscommunis南非SouthAfricaKC343010KC343736D.terebinthifoliiCBS133180巴西胡椒木Schinusterebinthifolius巴西BrazilKC343216KC343942D.cuppateaCBS117499南非茶Aspalathuslinearis南非SouthAfricaKC343057KC343783D.melonisCBS507.78甜瓜Cucumismelo美國USAKC343142KC343868D.angelicaeCBS111592獨活Heracleumsphondylium奧地利AustriaKC343027KC343753D.dauciCBS315.49 胡蘿卜Daucuscarota荷蘭NetherlandsFJ889451GQ250348D.stewartii CBS193.36波斯菊Cosmosbipinnatus—FJ889448GQ250324D.sclerotioidesCBS296.67黃瓜Cucumissativus荷蘭NetherlandsKC343193KC343919D.siamensisMFLUCC100573——JQ619879JX275393D.australafricanaCBS111886葡萄Vitisvinifera澳大利亞AustraliaKC343038KC343764D.foeniculaceaCBS123208小茴香Foeniculumvulgare葡萄牙PortugalKC343104KC343830

續(xù)表1 Table 1(Continued)

種Species菌株號Strain寄主Host采集地Location基因登錄號GenBankaccessionno.ITSEF1-αCBS187.27茶樹Camelliasinensis意大利ItalyKC343107KC343833D.phaseolorumCBS116019Caperoniapalustris美國USAKC343175KC343901CBS116020Symphyotrichumsubulatum美國USAKC343176KC343902PS03大豆Glycinemax克羅地亞CroatiaHM347702HM347670Ar2牛蒡Arctiumlappa克羅地亞CroatiaHM347705HM347679D.sojaeCBS116023大豆G.max美國USAKC343198KC343440CBS127267大豆G.max克羅地亞CroatiaKC343199KC343925D.hongkongensisCBS115448常山Dichroafebrífuga中國香港HongKongKC343119KC343845D.novemCBS354.71玉竹Polygonatumodoratum羅馬尼亞RomaniaKC343158KC343884D.longicollaFAU644大豆G.max美國USAKJ590730KJ590769PL7大豆G.max克羅地亞CroatiaHM347699HM347683DiaporthearengaeCBS114979山棕Arengaengleri中國香港HongKongChinaKC343034KC343760Diaporthesp.CBS115595臺灣山桂花Maesaperlaria中國香港HongKongChinaKC343209KC343935CBS115584臺灣山桂花M.perlaria中國香港HongKongChinaKC343208KC343934D.passiflorae15.3.1r1大果蔓越莓Vacciniummacrocarpon智利ChileKC143196KC533444D.viticolaCBS113201葡萄Vitisvinifera葡萄牙PortugalKC343234KC343960D.asheicolaCBS136967兔眼藍(lán)莓Vacciniumashei智利ChileKJ160562KJ160594D.baccaeCBS136971高叢藍(lán)莓Vacciniumcorymbosum意大利ItalyKJ160564KJ160596D.sterilisCBS136969高叢藍(lán)莓V.corymbosum意大利ItalyKJ160579KJ160611Diaporthellacoryli-naCBS121124榛屬Corylussp.中國ChinaKC343004KC343730

1.4 病原菌生物學(xué)特性研究

將直徑5 mm的菌餅分別置于不同培養(yǎng)基 (PDA、Czapek培養(yǎng)基、WA,胡蘿卜培養(yǎng)基、藍(lán)莓莖煎汁培養(yǎng)基),不同光照條件(分別在全光照、全黑暗、12 h光暗交替、24 h光暗交替),在25℃下培養(yǎng),分別于5、7、9 d后測量菌落直徑,每個處理重復(fù)3次。

研究不同溫度對供試菌株生長狀況的影響,選用5 mm的菌餅作為出發(fā)菌落直徑,分別置于15、20、25、27和30℃的PDA 平板上培養(yǎng),培養(yǎng)5、7和9 d后分別測量菌落直徑,每個處理重復(fù)3次。采用軟件Excel 和SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析。

2 結(jié)果分析

2.1 病原菌分離

病樣經(jīng)過組織分離后得到菌落形態(tài)一致的7株白色菌株,菌株編號及序列登錄號見表 2。

表2 從藍(lán)莓上分離得到的莖潰瘍病病原菌株

Table 2 Isolates of the pathogen of the blueberry stem canker

菌株號Strainno.寄主Host采集地Location基因登錄號GenBankaccessionno.ITSEF1-αLNZH041藍(lán)莓Vacciniumsp.遼寧莊河Zhuanghe,LiaoningKU375746KU685380LNZH087B藍(lán)莓Vacciniumsp.遼寧莊河Zhuanghe,LiaoningKU375749KU685383LNZH076A藍(lán)莓Vacciniumsp.遼寧莊河Zhuanghe,LiaoningKU375748KU685382LNDD007藍(lán)莓Vacciniumsp.遼寧丹東Dandong,LiaoningKU375738KU685371LNDD011藍(lán)莓Vacciniumsp.遼寧丹東Dandong,LiaoningKU375740KU685373FZXM061A藍(lán)莓Vacciniumsp.福建長汀Changting,FujianKU375716KU685349HLJYC010藍(lán)莓Vacciniumsp.黑龍江伊春Yichun,HeilongjiangKU375717KU685350

2.2 病原菌致病性測定

在28℃條件下,接種3 d后接種部位出現(xiàn)深褐色凹陷病斑,病斑長3～5 mm,病斑環(huán)莖,接種9 d后,病斑繼續(xù)擴(kuò)展,病斑長10～20 mm,病部中間深褐色,病斑周圍淡褐色,對照不發(fā)病。將回接發(fā)病的藍(lán)莓莖部進(jìn)行再次組織分離,得到與原接種菌株相同的菌株(圖1a,d)。

2.3 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定及生物學(xué)特性

菌株在PDA培養(yǎng)基上,25℃、12 h光暗條件下培養(yǎng)7 d。菌落直徑達(dá)到90 mm,菌落白色毛氈狀,菌絲較為致密,形成不規(guī)則的同心輪紋(圖1b)。在PDA上20 d左右可無規(guī)則散生或聚生球形或近球形黑色分生孢子器,分生孢子器頂部分泌不規(guī)則黃色分生孢子角。在苜蓿稈上培養(yǎng)15 d左右可以誘導(dǎo)出分生孢子器,通過誘導(dǎo)產(chǎn)生的分生孢子器形態(tài)與PDA上產(chǎn)生的分生孢子器相同(圖1e,f)。鏡檢分生孢子器及孢子,分生孢子梗(16.04～24.57)μm×(1.92～2.42)μm(圖1g),產(chǎn)生兩種類型分生孢子,α型孢子(5.95～7.92)μm×(1.64～2.59)μm,無色透明,單孢,橢圓形,含2個油球,β型孢子(6.69～19.79)μm×(0.62～1.18)μm無色透明,單胞,線形,一端較直,另一端稍彎,沒有觀察到γ型分生孢子(圖1c)。

在不同培養(yǎng)基、不同光照及不同溫度條件的試驗結(jié)果表明:供試菌株適宜在PDA上生長,在PDA上生長最快,7 d菌落直徑90 mm。在不同溫度條件下菌株生長速度快慢順序為25℃>30℃>27℃>20℃>15℃,菌株在25℃條件下生長快,7 d菌落直徑為90 mm,在15℃和20℃條件下菌絲生長速度最慢,培養(yǎng)9 d菌絲仍未長滿整個培養(yǎng)皿(90 mm)。光照對菌絲生長無明顯影響,在4種條件下菌絲均能正常生長。

圖1 藍(lán)莓莖潰瘍病癥狀及病原菌形態(tài)特征Fig.1 Symptoms of the blueberry stem canker and morphological characteristics of the pathogen

2.4 分子生物學(xué)鑒定

供試菌株的ITS序列長度為555～584 bp,EF1-α序列長度為323 bp,將其與GenBank下載的模式菌株的序列進(jìn)行單獨及聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹分析。基于聯(lián)合基因的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示,供試菌株與Ar2、PS03、CBS116019及CBS116020歸為一個類群(PP值1/BS值99),位于Diaporthephaseolorum種群內(nèi),與已報道的D.vaccinii、D.ambigua、D.australafricana、D.neotheicola(現(xiàn)已歸入D.foeniculacea)、D.viticola、D.asheicola、D.baccae、D.sterilis和D.passiflorae及D.eres處于不同的分支(圖2)。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征,鑒定該病原菌為Diaporthephaseolorum。

圖2 基于ITS和EF1-α基因聯(lián)合構(gòu)建的藍(lán)莓間座殼潰瘍病菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic analysis based on combined ITS and EF1-α gene sequences of the blueberry stem canker

3 結(jié)論與討論

間座殼屬真菌無性型為擬莖點霉屬Phomopsis,可作為植物的致病菌及內(nèi)生菌[10],也可侵染人類皮膚[13],具有廣泛的寄主范圍,間座殼屬真菌作為致病菌通常引起植物的潰瘍、枯死、根腐、果腐、葉斑病、枯萎病,可造成植物大面積枯萎[14]。

Diaporthephaseolorum可引起大豆莖潰瘍病[15],也是葡萄、菜豆等重要經(jīng)濟(jì)作物的病原菌[11],本研究首次在藍(lán)莓上分離到該種。現(xiàn)在對于間座殼屬真菌的鑒定通常采用分子生物學(xué)的方法,已經(jīng)有許多運用ITS序列結(jié)合形態(tài)學(xué)特征來鑒定間座殼屬真菌的研究:Murali等[16]研究來自柚木Tectonagrandis葉片內(nèi)的11個內(nèi)生菌株的ITS序列,支持來自柚木的間座殼屬菌株沒有寄主專化性這一結(jié)論。但I(xiàn)TS序列分析也在屬間顯示大量的交叉,多基因聯(lián)合分析比單個基因分析能夠更好地對菌株進(jìn)行區(qū)分。例如Santos等和van Rensburg等[14,17]運用ITS和EF1-α序列結(jié)合形態(tài)學(xué)和菌落特征將引起南非博士茶Aspalathuslinearis頂梢枯死的間座殼屬菌株分為5個種。本文選擇供試菌株以及相關(guān)菌株的ITS與EF1-α基因聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,能夠很好地將供試菌株與其近緣種(D.sojae、D.longicolla)及藍(lán)莓上已報道的間座殼屬其他種真菌進(jìn)行區(qū)分。

本研究系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示D.vaccinii與D.eres親緣關(guān)系較近,D.neotheicola(現(xiàn)已歸入D.foeniculacea)與D.baccae具有較近的親緣關(guān)系,而D.viticola和D.asheicola為D.australafricana的近緣種,此結(jié)果與Lorenzo等的研究結(jié)果一致[5]。本文報道的D.phaseolorum不僅在系統(tǒng)發(fā)育上與藍(lán)莓上已報道的間座殼屬菌株處于不同分支,在菌落形態(tài)、侵染癥狀上也存在差異,Diaporthevaccinii在PDA上生長的菌落形態(tài)具有非常明顯的環(huán)狀輪紋,分層明顯[3],本試驗菌株菌落邊緣平坦,無明顯分層現(xiàn)象。由D.ambigua,D.australafricana,D.neotheicola和D.passiflorae引起的莖部病害呈不規(guī)則病斑,病斑周圍紅色,病菌從嫩枝侵入造成嫩枝枯死[7]。我國報道的Diaportheeres從藍(lán)莓枝條芽眼侵入,造成藍(lán)莓芽枯病[7]。在國外Diaporthevaccinii主要危害藍(lán)莓[3],我國已經(jīng)報道D.vaccinii[6]和D.eres[7]兩個種侵染藍(lán)莓,造成藍(lán)莓枝枯病和芽枯病,對藍(lán)莓造成嚴(yán)重危害。本研究結(jié)果表明D.phaseolorum也可侵染藍(lán)莓,造成藍(lán)莓莖部潰瘍病,這是在我國新發(fā)現(xiàn)的可以引起藍(lán)莓病害的間座殼屬真菌。

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(責(zé)任編輯：田 喆)

Identification and biological characteristics of a blueberryDiaporthestem canker pathogen

Li Yuan， Shi Lingbo， Fei Nuoya， Fu Junfan， Yan Xuerui

(CollegeofPlantProtection,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110866，China)

A kind of blueberry stem canker was found in blueberry plantation and the symptoms consist of red-brown and elliptical stem canker. In order to identify the pathogen, seven isolates were obtained by isolation and purification. Phylogenetic analysis of combined ITS and EF1-α gene sequences showed that the isolates were located in the same clade withDiaporthephaseolorum. Compared with the morphological characteristics, the isolates were identified asD.phaseolorum. The biological characteristics test showed that 25℃, PDA were the best culture conditions, and it was not sensitive to light. This is the first report ofD.phaseolorumcausing diseases on blueberry.

blueberry;Diaporthe; stem canker; identification

2016-08-19

2016-09-19

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201103037)；沈陽市科技計劃項目(F15-167-4-00，F(xiàn)15-079-3-00)

S436.639

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.01.014

* 通信作者 E-mail: berrypest@126.com