茶多酚對百草枯中毒大鼠腎臟氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的影響

沈海濤，吳娜，趙宏宇，胡曉，郭峰，趙敏

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院1.急診科；2.內(nèi)分泌科，沈陽 110004）

茶多酚對百草枯中毒大鼠腎臟氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的影響

沈海濤1，吳娜2，趙宏宇1，胡曉1，郭峰1，趙敏1

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院1.急診科；2.內(nèi)分泌科，沈陽 110004）

目的 探討茶多酚對百草枯中毒大鼠腎臟氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的影響及可能機(jī)制。方法 將大鼠隨機(jī)分為對照組（A組）、百草枯染毒組（B組）、百草枯染毒+小劑量茶多酚組（C組）、百草枯染毒+大劑量茶多酚組（D組），每組10只。HE染色觀察腎臟組織，生化檢測儀檢測肌酐水平，ELISA法檢測血清中8?異前列腺素、白細(xì)胞介素6（IL?6）及腫瘤壞死因子α（TNF?α）水平，Western blotting檢測3?硝基酪氨酸（3?NT）蛋白水平，比色法檢測腎臟組織氧化應(yīng)激水平，實(shí)時(shí)PCR檢測腎臟組織TNF?αmRNA及IL?6mRNA水平。結(jié)果 B、C、D組大鼠在百草枯染毒后均出現(xiàn)腎臟受損，但C、D組在茶多酚干預(yù)下腎臟損傷較B組有所改善，且大劑量茶多酚干預(yù)下的D組腎臟損傷改善更為明顯。在茶多酚干預(yù)下的C、D組血清中肌酐、8?異前列腺素、IL?6及TNF?α水平以及腎臟組織的丙二醛、3?NT、TNF?αmRNA及IL?6mRNA水平較B組均降低，大劑量茶多酚干預(yù)下的D組降低更為顯著。結(jié)論 茶多酚干預(yù)對百草枯中毒大鼠腎臟有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與減輕腎臟中氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)有關(guān)。

茶多酚；百草枯；氧化應(yīng)激；炎癥反應(yīng)；腎臟

百草枯是針對雜草類殺傷效果極佳的除草劑，經(jīng)稀釋噴灑后可以達(dá)到較強(qiáng)的觸殺效果，并且具有在土壤催化下快速失活的特點(diǎn)，失活之后無毒素殘留，對環(huán)境影響極小。我國一直是農(nóng)業(yè)為本的大國，因此在我國性價(jià)比極高的百草枯是最為流行的除草劑。百草枯如按照指導(dǎo)正常使用罕見中毒反應(yīng)，但一旦經(jīng)口吞服則極易造成中毒。百草枯的毒性極強(qiáng)且無特效解毒劑，所以在臨床實(shí)踐中具有極高的病死率［1］。

百草枯在體內(nèi)經(jīng)過氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生大量氧自由基以及炎性細(xì)胞因子，而百草枯產(chǎn)生的氧自由基主要發(fā)生在線粒體基質(zhì)［2］?？寡趸瘎┮环矫婵梢砸种蒲跤苫漠a(chǎn)生，另一方面又可直接滅活氧化還原產(chǎn)生的氧自由基，從而減輕氧自由基損傷。深入研究氧化應(yīng)激與百草枯之間的相互關(guān)系，以及各種抗氧化劑的作用機(jī)制及效果，不但有助于了解百草枯中毒的致病機(jī)制，而且將為百草枯中毒的治療提供一個(gè)新的策略。近幾年，茶葉的提取物茶多酚因其安全無污染及強(qiáng)大的抗氧化作用日益受到大家的青睞。茶多酚結(jié)構(gòu)中的芳香環(huán)可以結(jié)合能夠中和氧自由基的羥基，從而表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗氧化能力［3］。并且茶多酚在氧化還原平衡中往往補(bǔ)償過度消耗的抗氧化系統(tǒng)，通常作為一種高效而又低毒的自由基清除劑來維持氧化還原平衡。

本研究采用腹腔一次性注射百草枯的方式建立百草枯中毒大鼠模型，通過給予不同劑量的茶多酚來研究茶多酚對百草枯中毒大鼠腎臟的保護(hù)作用。目前研究發(fā)現(xiàn)茶多酚能減輕百草枯中毒大鼠的肺損傷［4?6］及神經(jīng)損傷［7］，而對腎臟作用的動物體內(nèi)研究較少。目前僅有徐麗倩等［4］在大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)茶多酚能降低百草枯中毒大鼠的肌酐，然而其機(jī)制尚未明確。本研究通過檢測大鼠血清及腎臟的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，來探討茶多酚改善百草枯中毒大鼠腎臟損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

百草枯標(biāo)準(zhǔn)品及茶多酚購于美國Sigma?Aldrich公司；8?異前列腺素、白細(xì)胞介素6（interleukin?6，IL?6）及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF?α）的ELISA試劑盒均購于美國Uscnlife公司；檢測丙二醛（malondialdehyde，MDA）及谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH?Px）活性的比色法試劑盒購于中國南京建成公司；3?硝基酪氨酸（3?ni?trotyrosine，3?NT）抗體購于美國Abcam公司；β?actin抗體購于美國Santa Cruz公司；Trizol試劑盒、定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購于日本TaKaRa公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物：清潔級SD雄性大鼠，6～8周齡，體質(zhì)量200～250 g，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，飼養(yǎng)溫度控制在20～25℃，濕度控制在40%～70%，晝夜節(jié)律控制12 h，自由進(jìn)食水。該實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過中國醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)（倫理號2015PS302K）。

1.2.2 模型構(gòu)建及動物分組：將大鼠隨機(jī)平均分成4組：陰性對照組（A組）、百草枯染毒組（B組）、百草枯染毒+小劑量茶多酚組（C組）、百草枯染毒+大劑量茶多酚組（D組），每組10只。A組腹腔注射等量生理鹽水。B組腹腔注射20 mg/kg百草枯溶液（10 mg/mL溶于生理鹽水）。C組腹腔注射20 mg/kg百草枯溶液，6 h后給予小劑量茶多酚（200 mg·kg-1·d-1）灌胃。D組腹腔注射20 mg/kg百草枯溶液，6 h后給予大劑量茶多酚（400 mg·kg-1·d-1）灌胃。

1.2.3 標(biāo)本的采集及保存：百草枯腹腔注射后72 h，使用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉。待麻醉充分后，將大鼠仰臥于鼠臺上固定，常規(guī)消毒后打開胸腔，使用1 mL注射器刺入右心室，緩慢取血，避免溶血。將血放入1.5 mL離心管中，3 000 r/min、4℃離心10 min，取上清分裝至1.5 mL EP管中，每管放約0.2 mL，置-80℃冰箱保存。迅速取出腎臟，生理鹽水清洗后，一部分置于4%多聚甲醛中4℃固定，另一部分腎臟液氮速凍后置于-80℃冰箱保存，以備檢測。

1.2.4 腎組織HE染色：取固定好的腎臟組織，脫水后石蠟包埋，連續(xù)切片后備用HE染色。載玻片APES防脫片處理，組織切片在水浴箱中充分展片后用載玻片撈取組織，行HE染色。

1.2.5 血清中肌酐、氧化應(yīng)激及炎性細(xì)胞因子的測定：使用日立全自動生化分析儀檢測大鼠肌酐水平；采用ELISA法檢測血清中8?異前列腺素、IL?6及TNF?α水平，將凍存血清置于室溫中解凍，按ELISA試劑盒說明書中的方法測定。

1.2.6 腎臟氧化應(yīng)激的測定：采用比色法檢測腎臟MDA及GSH?Px活性，嚴(yán)格按照比色法試劑盒說明書步驟進(jìn)行。采用Western blotting檢測腎臟3?NT蛋白水平，腎臟樣本等量上樣，凝膠電泳分離后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉后，加入一抗3?NT 4℃搖床孵育過夜。加入二抗β?actin，用TBST沖洗，ECL顯影掃描，條帶灰度值以Image Pro Plus測定。

1.2.7 腎臟炎性細(xì)胞因子的測定：采用實(shí)時(shí)PCR檢測腎臟組織TNF?α及IL?6mRNA水平，勻漿提取總

RNA，反轉(zhuǎn)錄后行實(shí)時(shí)PCR檢測TNF?α、IL?6及β?actinmRNA，應(yīng)用7500熒光定量PCR儀上的分析軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。引物如下：IL?6，上游引物5’?TCGAGCCCACCGGGAACGAA?3’，下游引物5’?GCAACTGGACCGAAGGCGCT?3’；TNF?α，上游引物5’?CGAGTCTGGGCAGGTCTACTTT?3’，下游引物5’?AGAGGTTGAGGGTGTCTGAAGG?3’；β?actin，上游引物5’?GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA?3’，下游引物5’?GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG?3’。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以x±s表示，應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用方差分析比較4組間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎臟組織HE染色

A組腎小球無出血，腎小管管腔清晰無滲出，未見間質(zhì)水腫；B組腎小球可見出血，腎小管上皮細(xì)胞可見玻璃樣變性，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，管腔可見蛋白滲出物，間質(zhì)有炎癥浸潤，可見出血；C組腎小球無出血，腎小管上皮細(xì)胞偶見玻璃樣變性，管腔內(nèi)見少許滲出，間質(zhì)可見少量出血；D組腎小球無出血，腎小管上皮細(xì)胞略腫脹，管腔內(nèi)無滲出，間質(zhì)輕度水腫，無出血。見圖1。

2.2 血清中肌酐、氧化應(yīng)激及炎性細(xì)胞因子水平

圖1 大鼠腎臟組織HE染色 ×40Fig.1 HE staining of rat renal tissues ×40

B組血清中肌酐及8?異前列腺素水平明顯高于A組（P＜0.05）；C、D組與B組比較，肌酐及8?異前列腺素水平明顯降低（P＜0.05）；D組肌酐及8?異前列腺素水平較C組降低（P＜0.05）。與A組相比，B組血清中TNF?α及IL?6水平升高，給予茶多酚干預(yù)后其水平降低。D組血清中IL?6水平較C組降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。D組血清中TNF?α水平較C組明顯降低（P＜0.05）。見表1。

表1 血清中肌酐、氧化應(yīng)激及炎性細(xì)胞因子水平Tab.1 Serum creatinine，oxidative stress，and inflammatory cytokines levels

2.3 腎臟組織氧化應(yīng)激指標(biāo)及炎性細(xì)胞因子的mRNA水平

B組腎臟組織中MDA及3?NT蛋白水平較A組明顯升高（P＜0.05），C、D組較B組明顯降低（P＜0.05），D組降低更顯著（P＜0.05）。B組與A組比較GSH?Px活性明顯降低（P＜0.05），而C、D組較B組明顯升高（P＜0.05）。B組腎臟TNF?α及IL?6的mRNA水平明顯高于A組（P＜0.05），C、D組較B組明顯降低（P＜0.05），且D組TNF?α及IL?6的mRNA水平比C組更低（P＜0.05）。見表2。

3 討論

本研究采用腹腔一次性注射20 mg/kg百草枯的方式建立了百草枯中毒大鼠模型。在本課題組前期研究中，分別給予大鼠腹腔一次性注射10、20、30、40及50 mg/kg的百草枯，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10 mg/kg百草枯處理的大鼠中毒率較低；20 mg/kg能獲得滿意的中毒率而死亡率極低；30、40及50 mg/kg百草枯處理后的大鼠雖然中毒率較高，但死亡率也較高［8］。因此在本研究給予大鼠20 mg/kg百草枯一次性腹腔注射來建立大鼠中毒模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)200和400 mg·kg-1·d-1的茶多酚干預(yù)均使百草枯中毒大鼠的肌酐降低。同時(shí)，茶多酚的干預(yù)減輕了大鼠血清中氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，也減輕了腎臟中的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激。

表2 腎臟組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)及炎性細(xì)胞因子的mRNA水平Tab.2 Oxidative stress indicator and mRNA level of inflammatory cytokines in renal tissue

本研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚的干預(yù)使百草枯引起的腎臟損害明顯改善，這與徐麗倩等［4］的研究一致。本研究還發(fā)現(xiàn)百草枯中毒大鼠給予大劑量茶多酚后，其肌酐水平比給予小劑量茶多酚更低。這說明茶多酚干預(yù)對百草枯中毒大鼠腎臟有保護(hù)作用，并且在一定濃度范圍內(nèi)這種保護(hù)作用隨劑量的增加而增強(qiáng)。茶多酚改善百草枯大鼠腎損傷安全有效的劑量范圍及具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。

目前認(rèn)為，百草枯的中毒機(jī)制與氧化還原反應(yīng)失衡及細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激有關(guān)［9］。氧化應(yīng)激作為機(jī)體修復(fù)系統(tǒng)機(jī)能過程中產(chǎn)生的活性氧簇和活性氮簇造成的氧化損傷，是正常氧化還原反應(yīng)中的主要應(yīng)激反應(yīng)。百草枯所致的靶器官損傷依賴于氧化還原失衡，肺作為氧濃度最高的部位而成為最容易受累的器官。但近年發(fā)現(xiàn)，急性腎損傷也是百草枯中毒患者的常見死因［10?11］。百草枯中毒后主要通過腎臟清除，腎臟是除肺組織外百草枯濃度最高的器官，因此急性腎損傷是百草枯中毒常見的并發(fā)癥，本研究中腹腔注射20 mg/kg的茶多酚即造成了大鼠急性腎損傷。為了評估血清中氧化應(yīng)激水平，本研究采用了8?異前列腺素，8?異前列腺素是體現(xiàn)不飽和脂肪酸被自由基催化而脂質(zhì)過氧化后的氧化反應(yīng)終產(chǎn)物，因?yàn)槠洚a(chǎn)生機(jī)制及過程與過氧化損傷息息相關(guān)，故而近年來人們經(jīng)常使用其來研究和評估過氧化損傷［12］。本研究發(fā)現(xiàn)茶多酚減輕了百草枯中毒大鼠血清中的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，這與既往研究一致［4?6］。既往研究［13］發(fā)現(xiàn)百草枯中毒大鼠的腎臟氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，茶多酚能減輕百草枯中毒引起的肺臟氧化應(yīng)激［5?6］。而茶多酚能否減輕腎臟的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)尚未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)茶多酚能降低腎臟IL?6及TNF?αmRNA水平，降低腎臟3?NT蛋白水平。說明茶多酚可能是通過減輕腎臟中氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)來降低百草枯引起的急性腎損傷。

茶多酚是從茶葉中提取的含有多酚類化合物的混合物。研究表明，茶多酚具有抗菌、防癌抗癌、降血脂、保護(hù)心腦血管、護(hù)肝和抗氧化等作用［4，14?15］。我國是茶葉生產(chǎn)大國，茶葉資源非常豐富。充分而有效地利用這一資源優(yōu)勢，深度開發(fā)優(yōu)質(zhì)的醫(yī)用茶多酚產(chǎn)品，其經(jīng)濟(jì)效益十分顯著。隨著人們對氧化應(yīng)激及抗氧化劑認(rèn)識的不斷深入，茶多酚等安全高效的抗氧化劑有望成為百草枯中毒治療中一項(xiàng)新的策略。

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（編輯 陳 姜）

Effects of Epigallocatechin?3?gallate on Oxidative Stress and Inflammatory Factors in the Kidney Tissues of Rats with Paraquat Poisoning

SHEN Haitao1，WU Na2，ZHAO Hongyu1，HU Xiao1，GUO Feng1，ZHAO Min1
（1.Department of Emergency，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Department of Endocrinology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

Objective To investigate the effect of Epigallocatechin?3?gallate（EGCG）on oxidative stress and inflammatory factors in the kidney tissues of rats with paraquat poisoning，and explore the possible mechanism.Methods Rats were randomly divided into control group（group A），paraquat exposure group（group B），paraquat exposure+low dose of EGCG group（group C），and paraquat exposure+high dose of EGCG group（group D）（n=10 in each group）.Kidney tissues were harvested and observed by HE staining.The level of creatinine was tested by biochemical detector.Serum oxidative stress and inflammatory factor level were detected by ELISA method.Oxidative stress in kidney tissue was determined by Western blotting and colorimetry.Inflammatory factor level in renal tissue was tested by real?time PCR.Results Kidney damage was observed in rats of groups B，C，and D.Rats in groups C and D showed less renal injury than group B，and high dose of EGCG（group D）enhanced kidney damage compared to the low dose（group C）.Compared with group A，rats in the groups C and D showed lower level of 8?isoprostane，creatinine，interleukin?6（IL?6），and tumor necrosis factor α（TNF?α）in serum and malondialdehyde（MDA），3?nitrotyrosine（3?NT），andTNF?αandIL?6 mRNA in renal tissue in rats with paraquat poisoning，and group D showed the lowest mRNA level of inflammatory factor and oxidative stress.Con?clusion EGCG has protective effects on the kidney of rats with paraquat poisoning，and its mechanism may be related to the reduction of oxida?tive stress and inflammatory reaction in the kidney.

epigallocatechin?3?gallate；paraquat；oxidative stress；inflammatory reaction；kidney

R595.4

A

0258-4646（2017）03-0210-05

10.12007/j.issn.0258?4646.2017.03.005

衛(wèi)生部國家臨床重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)項(xiàng)目（2012?649）

沈海濤（1980-），男，主治醫(yī)師，碩士.

趙敏，E-mail：zhaom@sj?hospital.org

2016-09-14

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：