miR?29s家族對人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

奚卓，薛一雪，馬珺，劉云會

（中國醫(yī)科大學(xué)1.附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽 110004；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，沈陽 110122）

miR?29s家族對人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

奚卓1，薛一雪2，馬珺2，劉云會1

（中國醫(yī)科大學(xué)1.附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽 110004；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，沈陽 110122）

目的 研究miR?29s家族在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（GSCs）中的表達(dá)水平，以及對GSCs生物學(xué)行為的影響是否存在差異。方法8例膠質(zhì)瘤患者術(shù)中取腫瘤標(biāo)本，制備成GSCs。應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR方法檢測miR?29a、miR?29b和miR?29c的內(nèi)源性表達(dá)。CCK?8方法檢測GSCs增殖，Transwell小室方法檢測GSCs的遷移侵襲，流式細(xì)胞儀檢測GSCs的凋亡。結(jié)果 miR?29a、miR?29b和miR?29c在GSCs中低表達(dá)，外源性提高表達(dá)量后，可以抑制GSCs的增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)GSCs的凋亡。結(jié)論 miR?29s家族在GSCs中起抑癌基因的作用，家族成員中以miR?29a的抑癌能力最強(qiáng)且起到主導(dǎo)作用。

膠質(zhì)瘤干細(xì)胞；miR?29a；miR?29b；miR?29c；生物學(xué)行為

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是膠質(zhì)瘤中惡性程度最高、侵襲性最強(qiáng)、最易復(fù)發(fā)的一種［1］，目前標(biāo)準(zhǔn)的治療方法是手術(shù)切除聯(lián)合放、化療，但患者的5年生存率仍不足5%［2］。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（glioma stem cells，GSCs）是膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的少數(shù)亞群細(xì)胞，具有自我更新、多向分化及無限增殖的能力。

miR?29s家族有miR?29a、miR?29b和miR?29c，在不同腫瘤組織中作用不同［3?4］。在人腦膠質(zhì)瘤組織中，miR?29s為抑癌基因，miR?29a和miR?29c可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力［5］。因?yàn)镚SCs與膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)及侵襲性生長存在密切關(guān)系，所以本研究希望通過檢測miR?29s在GSCs中的表達(dá)以及其家族成員對GSCs生物學(xué)行為的影響，為研究GSCs的靶向治療提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織來源

8例膠質(zhì)瘤組織均取自2015年中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院第一神經(jīng)外科手術(shù)患者，其中男5例，女3例，年齡26～67歲，4例位于頂葉，2例位于額葉，2例位于顳葉。術(shù)后病理：5例為多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，3例為間變性星形細(xì)胞瘤。所有患者均為首次發(fā)病，術(shù)前未接受放、化療，手術(shù)均為開顱切除，術(shù)中選擇未壞死、未囊變的腫瘤組織。術(shù)后病理均由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病理科診斷。8例患者針對手術(shù)及研究均簽署知情同意書，研究方案由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院倫理委員會審查通過。

1.2 GSCs的分離和培養(yǎng)

膠質(zhì)瘤組織術(shù)中取出后，放入PBS緩沖液，于冰盒中轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。無菌條件下取腫瘤組織（約1 cm3），反復(fù)PBS沖洗，剪切成碎塊至乳糜狀，胰酶消化、過濾，后予以1 000g5 min離心，棄上清。組織團(tuán)塊應(yīng)用GSCs培養(yǎng)液重懸，并放入懸浮培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。GSCs培養(yǎng)液包括：無血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，其中添加20 ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），20 ng/mL表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和2%B27。細(xì)胞置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)過近2周的培養(yǎng)，細(xì)胞球形成，而殘留在瓶中的未形成細(xì)胞球的細(xì)胞為非膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（non?glioma stem cells，non?GSCs）。目前研究［6］已經(jīng)針對干細(xì)胞的分化和增殖能力進(jìn)行鑒定，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)方法相同，本研究未再進(jìn)行鑒定。

1.3 RNA的提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

總RNA應(yīng)用Trizol reagent從GSCs及non?GSCs中提取，RNA樣品稀釋后測定RNA濃度。然后應(yīng)用Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit將RNA反轉(zhuǎn)錄，應(yīng)用TaqMan Universal Master MixⅡ和Taq?Man MicroRNA Assay（miR?29a、miR?29b、miR?29c和U6）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。應(yīng)用7500 Fast Real?Time PCR System測定CT值，以U6為內(nèi)參照，以2-ΔΔCt表示mRNA的相對表達(dá)量。

1.4 miR?29s的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

miR?29a、miR?29b和miR?29c對應(yīng)的miRNA激動(dòng)劑和其陰性對照（nonsense scrambled sequence，Scr）均由上海吉瑪公司合成。應(yīng)用Lipofectamine 3000 reagent（Life Technologies Corporation，Carls?bad，CA，USA）將miR?29s miRNA激動(dòng)劑和其陰性對照轉(zhuǎn)染至GSCs中，得到過表達(dá)miR?29s的GSCs，然后應(yīng)用qRT?PCR檢測miR?29a、miR?29b和miR?29c的轉(zhuǎn)染效率，實(shí)驗(yàn)分為：未轉(zhuǎn)染的GSCs組（Control組），轉(zhuǎn)染陰性對照的GSCs組（Scr組），轉(zhuǎn)染miR?29a miRNA激動(dòng)劑組（pre?miR?29a組），轉(zhuǎn)染miR?29b miRNA激動(dòng)劑組（pre?miR?29b組），轉(zhuǎn)染miR?29c miRNA激動(dòng)劑組（pre?miR?29c組）。

1.5 GSCs增殖能力檢測

應(yīng)用CCK?8方法（Cell Counting Kit?8，中國南通碧云天公司），檢測過表達(dá)miR?29a、miR?29b和miR?29c后，GSCs增殖能力的變化。將成球的GSCs應(yīng)用胰酶消化成單細(xì)胞懸液，以100 μL、3 000/孔接種于96孔懸浮細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)5個(gè)副孔，轉(zhuǎn)染48 h后每孔加入10 μL的CCK?8溶液，避光孵育3 h，在450 nm波長處檢測光密度值。

1.6 GSCs遷移侵襲能力的檢測

GSCs的遷移和侵襲能力實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Transwell小室（8 μm孔徑）進(jìn)行檢測。瞬轉(zhuǎn)48 h的GSCs，應(yīng)用胰酶消化成單球，1 000g5 min離心，棄上清，用100 μL GSCs培養(yǎng)液重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)20 000/mL，并加入小室的上室，下室則加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。細(xì)胞置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。后將小室取出，PBS中輕輕涮洗小室，小室內(nèi)面用棉簽輕輕擦拭。配置固定液：甲醇∶冰乙酸= 3∶1。將小室于固定液中固定30 min，再次應(yīng)用PBS涮洗，吉姆薩染色30 min。然后將小室洗凈，置于倒置顯微鏡下觀察，并計(jì)數(shù)5個(gè)隨機(jī)視野的細(xì)胞數(shù)做均值計(jì)數(shù)。GSCs侵襲實(shí)驗(yàn)中，步驟與遷移實(shí)驗(yàn)步驟相似，但小室上室鋪細(xì)胞之前需要涂蓋500 ng/μL的Matrigel膠，37℃放置4 h。

1.7 GSCs凋亡能力的檢測

應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測miR?29s過表達(dá)后對GSCs凋亡能力的影響。瞬轉(zhuǎn)48 h后的GSCs以1 000g5 min離心，然后用PBS洗滌2次，相同轉(zhuǎn)數(shù)離心，棄上清。然后用Annexin V?FITC/PI kit凋亡檢測試劑盒進(jìn)行檢測，首先加入500 μL工作液重懸細(xì)胞，然后加入5 μL FITC及PI，室溫，避光反應(yīng)15 min。最后使用流式細(xì)胞儀分析樣品，使用CELLQuest 3.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。統(tǒng)計(jì)分析時(shí)采用右側(cè)上、下象限百分?jǐn)?shù)的和代表總的凋亡率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以x±s表示。采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2組間采用t檢驗(yàn)，多組間采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR?29s在正常膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)

在正常膠質(zhì)細(xì)胞中，相對于miR?29a，miR?29b和miR?29c的表達(dá)量顯著減少（P均＜0.01），見圖1A。

2.2 miR?29s在GSCs中低表達(dá)

與non?GSCs比較，miR?29a、miR?29b和miR?29c在GSCs中均呈低表達(dá)（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05），且將non?GSCs的表達(dá)統(tǒng)一后，miR?29a在GSCs中的表達(dá)相對于其他2個(gè)家族成員，表達(dá)量更低。但與正常膠質(zhì)細(xì)胞比較，miR?29a、miR?29b和miR?29c在non?GSCs中的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見圖1B。

2.3 過表達(dá)miR?29s后轉(zhuǎn)染效率的驗(yàn)證

圖1 miR?29a，miR?29b和miR?29c在正常膠質(zhì)細(xì)胞和GSCs中的內(nèi)源性表達(dá)（n=5）Fig.1 The expression of miR?29a，miR?29b and miR?29c in the human normal astrocytes and glioma stem cell（n=5）

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR?29a、miR?29b和miR?29c各自對應(yīng)的miRNA激動(dòng)劑以及共同的陰性對照Scr后，應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率的驗(yàn)證，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染48 h后，轉(zhuǎn)染效率最高，見圖2A。

2.4 過表達(dá)miR?29s后抑制GSCs的增殖

相對于Scr組，過表達(dá)miR?29a、miR?29b和miR?29c后均可抑制GSCs的增殖能力（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05），且以miR?29a抑制的最明顯，而Con?trol組與Scr組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見圖2B。

2.5 過表達(dá)miR?29s后抑制GSCs的遷移侵襲

當(dāng)GSCs中miR?29a、miR?29b和miR?29c外源性表達(dá)升高后，GSCs的遷移（P均＜0.01）和侵襲（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05）能力均受到抑制，且家族成員中仍以miR?29a的抑制效果最明顯，miR?29c的抑制能力最差。見圖2C。

2.6 過表達(dá)miR?29s后促進(jìn)GSCs的凋亡

將miR?29a、miR?29b和miR?29c各自的miRNA激動(dòng)劑轉(zhuǎn)染至GSCs中，使細(xì)胞中miR?29a、miR?29b和miR?29c的表達(dá)量升高后，會明顯促進(jìn)GSCs的凋亡（P均＜0.01），且以miR?29a促進(jìn)的最明顯（36%），相對于Scr組（11.8%），提高了（24.2%）。見圖2D。

3 討論

很多研究者認(rèn)為，miRNAs在GSCs中的異常表達(dá)以及它們對GSCs生物學(xué)行為的影響可能與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，例如miR?101、miR?152、miR?330和miR?145等［7?10］。在不同腫瘤組織中，miR?29s家族功能不同，甚至在同一疾病中的功能也不相同［11?12］。在人腦膠質(zhì)瘤中，miR?29s家族為低表達(dá)，且均起抑癌基因的作用，但miR?29s家族在GSCs中的表達(dá)以及家族成員之間對GSCs生物學(xué)行為的影響尚不明確。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對于non?GSCs，miR?29s家族各個(gè)成員在GSCs中也為低表達(dá)，且以miR?29a表達(dá)下降最為明顯，此結(jié)果與miR?29s家族在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)一致。外源性增強(qiáng)miR?29a、miR?29b和miR?29c的表達(dá)后，GSCs的增殖、遷移、侵襲能力受到抑制，而GSCs凋亡受到促進(jìn)，結(jié)果說明miR?29s家族在GSCs中確實(shí)起到抑癌基因的作用。

本研究結(jié)果顯示，相對于miR?29b和miR?29c，外源性提高miR?29a的表達(dá)后，可以更明顯的抑制GSCs的增殖、遷移侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。說明miR?29a在GSCs中的抑癌作用更顯著。為了解釋這個(gè)現(xiàn)象，在人正常膠質(zhì)細(xì)胞中檢測了miR?29a、miR?29b和miR?29c的內(nèi)源性表達(dá)，結(jié)果顯示miR?29a的表達(dá)明顯高于miR?29b和miR?29c。與本研究結(jié)果相同，miR?29a被證實(shí)在正常乳腺細(xì)胞中主要表達(dá)，且功能上在miR?29s家族中也起主導(dǎo)作用［13］。所以，在GSCs中，miR?29a在miR?29s家族的抑癌作用中起主導(dǎo)作用。在miR?29s家族影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為機(jī)制研究方面，目前針對miR?29a、miR?29b和miR?29c的研究很多，如miR?29a和miR?29c可以通過影響CDC42的表達(dá)來抑制細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲［14?15］，但在GSCs中的機(jī)制研究暫時(shí)沒有。

圖2 miR?29a、miR?29b和miR?29c轉(zhuǎn)染效率的驗(yàn)證及過表達(dá)miR?29a、miR?29b和miR?29c后對GSCs生物學(xué)行為的影響（n=5）Fig.2 The transfection efficiency of miR?29a，miR?29b，miR?29c and over?expression of miR?29a，miR?29b and miR?29c influence the bi?ological behaviors of GSCs（n=5）

綜上所述，miR?29s家族在GSCs中低表達(dá)，且發(fā)揮抑癌基因的作用，家族成員中以miR?29a的抑癌能力最強(qiáng)且發(fā)揮主導(dǎo)作用。但miR?29s家族影響GSCs生物學(xué)行為的機(jī)制，還需在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行研究。希望目前的研究可以為進(jìn)一步研究miR?29s家族在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用提供參考，并為研究GSCs的功能提供理論支持。

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（編輯 于 溪）

Effects of miR?29s Family on the Biological Behaviors of Glioma Stem Cells

XI Zhuo1，XUE Yixue2，MA Jun2，LIU Yunhui1
（1.Department of Neurosurgery，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Department of Neurobiology，College of Basic Medical Science，China Medical University，Shenyang 110122，China）

Objective To investigate the expression of miR?29s in the glioma stem cells，and explore how the members of miR?29s affect the bio?logical behaviors of glioma stem cells.Methods Eight patient specimens were used to culture glioma stem cells.Real?time PCR was adopted to test the expression of miR?29s.CCK?8 analysis was performed to test the proliferation，Transwell was used to test cell migration and invasion，and flow?cytometry analysis was carried out to test apoptosis.Results miR?29a，miR?29b and miR?29c were decreased in glioma stem cells.Over?ex?pression of miR?29s could inhibit the proliferation，cell migration and invasion，but promote apoptosis of glioma stem cells.Conclusion miR?29s acts as a cancer suppressor gene in the glioma stem cells，and miR?29a plays the dominant functional role in the family.

glioma stem cells；miR?29a；miR?29b；miR?29c；biological behaviors

R739.41

A

0258-4646（2017）03-0201-04

10.12007/j.issn.0258?4646.2017.03.003

國家自然科學(xué)基金（81672511，81573010）；遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃（2015225007）；中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院自由研究者計(jì)劃（201304）

奚卓（1984-），男，主治醫(yī)師，博士.

劉云會，E-mail：liuyh_cmuns@163.com

2016-09-26

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