氯胺酮長(zhǎng)期濫用后小鼠海馬區(qū)caspase?3和PSD?95的表達(dá)變化

杜傲，任鵬，2，何柏林，楊順成，丁潤(rùn)濤，沈瑞鵬，李延檸，董志斌，盧巖，吳旭

（1.中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)病理學(xué)教研室，沈陽 110122；2.中國刑警學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，沈陽 110035；3.沈陽市公安司法鑒定中心，沈陽 110003；4.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院衛(wèi)生部小兒先天畸形重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110004）

·論著·

氯胺酮長(zhǎng)期濫用后小鼠海馬區(qū)caspase?3和PSD?95的表達(dá)變化

杜傲1，任鵬1，2，何柏林1，楊順成3，丁潤(rùn)濤1，沈瑞鵬1，李延檸1，董志斌1，盧巖4，吳旭1

（1.中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)病理學(xué)教研室，沈陽 110122；2.中國刑警學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，沈陽 110035；3.沈陽市公安司法鑒定中心，沈陽 110003；4.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院衛(wèi)生部小兒先天畸形重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110004）

目的 研究氯胺酮長(zhǎng)期濫用模型中海馬區(qū)半胱氨酸蛋白酶（caspase）3和突觸后密度蛋白（PSD）95的表達(dá)變化。方法每日小鼠腹腔注射氯胺酮（30 mg/kg）、持續(xù)3個(gè)月建立小鼠氯胺酮長(zhǎng)期濫用模型，采用免疫組化及Western blotting檢測(cè)小鼠氯胺酮長(zhǎng)期濫用后caspase?3和PSD?95的表達(dá)情況。結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示caspase?3表達(dá)增強(qiáng)，PSD?95表達(dá)減弱。Western blotting結(jié)果顯示caspase?3活化片段蛋白表達(dá)升高，PSD?95蛋白表達(dá)下降。結(jié)論 氯胺酮長(zhǎng)期濫用致小鼠腦海馬區(qū)caspase?3表達(dá)增加、PSD?95表達(dá)減弱，這一結(jié)果揭示了長(zhǎng)期濫用氯胺酮所致神經(jīng)毒性作用的可能機(jī)制。

氯胺酮；半胱氨酸蛋白酶3；突觸后密度蛋白95；海馬

氯胺酮是非競(jìng)爭(zhēng)性N?甲基?D?天門冬氨酸（N?methyl?D?aspartate，NMDA）受體拮抗劑，是臨床常用的一種靜脈全麻藥。由于能產(chǎn)生強(qiáng)烈致欣快作用，氯胺酮作為一種新型毒品在全球大肆蔓延，俗稱“K粉”。大量研究發(fā)現(xiàn)，氯胺酮濫用會(huì)引起神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。2001年至2002年，中國藥物依賴性研究所對(duì)708例氯胺酮濫用者進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，有85例發(fā)生了不同程度的精神障礙，主要表現(xiàn)為幻覺、抑郁、精神分裂等［1］。2009年，廣州市腦科醫(yī)院物質(zhì)依賴科王達(dá)平等［2］發(fā)現(xiàn)在接受認(rèn)知能力分析的46例氯胺酮濫用者中，40%～50%濫用者出現(xiàn)了認(rèn)知功能損害。本研究擬建立氯胺酮長(zhǎng)期濫用小鼠模型，采用免疫組化和Western blotting方法檢測(cè)小鼠海馬區(qū)半胱氨酸蛋白酶3（caspase?3）和突觸后密度蛋白95（postsynaptic density 95，PSD?95）的變化，探討氯胺酮長(zhǎng)期濫用后海馬區(qū)神經(jīng)毒性的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

兔抗小鼠caspase?3多克隆抗體（美國Santa Cruz公司，sc?7148），兔抗小鼠PSD?95多克隆抗體（美國Abcam公司，ab18258），小鼠抗人β?actin單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，A03?60BM），兔SP檢測(cè)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，SP?9001），小鼠SP檢測(cè)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，SP?9002），DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ZLI?9018）等。

1.2 動(dòng)物模型建立及分組

2月齡健康成年雄性C57BL/6小鼠40只，體質(zhì)量18～22 g，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。小鼠隨機(jī)分為生理鹽水組和氯胺酮組，每組20只。分別根據(jù)小鼠所在組，每日同一時(shí)間腹腔注射給藥（注射藥量依公式計(jì)算，隨體質(zhì)量變化而變化，30 mg/kg），連續(xù)給藥3個(gè)月。3個(gè)月后取材。

1.3 免疫組化染色

取小鼠左半腦，4%多聚甲醛或PBS固定，水洗、脫水、透明，石蠟包埋，制作5 μm厚度連續(xù)切片，貼于經(jīng)多聚賴氨酸處理后的載玻片上，37℃溫箱干燥過夜。常規(guī)脫蠟、水化，3%H2O2或PBS滅活內(nèi)源性過氧化物酶后，室溫非免疫血清封閉60 min，加入兔抗小鼠caspase?3多克隆抗體（1∶500稀釋）和兔抗小鼠PSD?95多克隆抗體（1∶500稀釋）4℃孵育過夜，二抗室溫孵育30 min，SP室溫30 min，DAB顯色25 s，顯微鏡觀察。

1.4 Western blotting檢測(cè)

取小鼠右半腦海馬，進(jìn)行組織樣品提取及cas?pase?3、PSD?95的蛋白定量檢測(cè)。30 μg總蛋白等量上樣，SDS?PAGE凝膠電泳后，以濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，加入兔抗小鼠多克隆抗體caspase?3（1∶500稀釋）和兔抗小鼠多克隆抗體PSD?95（1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜。TBST洗膜，加入相應(yīng)的二抗室溫2 h，TBST洗膜后ECL發(fā)光。利用Scion Image軟件分別檢測(cè)caspase?3、PSD?95和β?actin蛋白表達(dá)的平均光密度值，caspase?3用17 000/β?actin與32 000/β?actin相比，得到17 000蛋白表達(dá)相對(duì)量。PSD?95與β?actin相比，得到PSD?95蛋白表達(dá)相對(duì)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用x±s表示，進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色結(jié)果

caspase?3在生理鹽水組海馬神經(jīng)元中彌漫性表達(dá)，陽性物質(zhì)主要分布于細(xì)胞質(zhì)中（圖1A、1C）；氯胺酮組海馬神經(jīng)元陽性物質(zhì)主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，陽性表達(dá)增加（圖1B、1D）?？瞻讓?duì)照以PBS代替一抗，無caspase?3表達(dá)。PSD?95在生理鹽水組及氯胺酮組均可見表達(dá)，陽性物質(zhì)于生理鹽水組海馬神經(jīng)元胞質(zhì)及突起中彌漫表達(dá)（圖2A、2C）；氯胺酮組海馬神經(jīng)元胞質(zhì)及突起中表達(dá)較生理鹽水組減弱（圖2B、2D）?？瞻讓?duì)照以PBS代替一抗，無PSD?95表達(dá)。

圖1 caspase?3在小鼠海馬區(qū)的免疫組化染色結(jié)果Fig.1 Immunohistochemistry of caspase?3 protein expression in mouse hippocampus

2.2 Western blotting檢測(cè)結(jié)果

以β?actin為內(nèi)參（約為42 000），caspase?3及PSD?95在生理鹽水組和氯胺酮組均有陽性條帶。caspase?3非活性片段大小為32 000，降解后形成的2條活性片段分別為17 000及12 000。生理鹽水組及氯胺酮組均出現(xiàn)2條帶，為32 000及17 000，活性片段17 000在氯胺酮組的蛋白表達(dá)相對(duì)量（0.91± 0.05）較生理鹽水組蛋白表達(dá)相對(duì)量（0.53±0.05）升高（P＜0.05），見圖3。

圖2 PSD?95在小鼠海馬區(qū)免疫組化染色結(jié)果Fig.2 Immunohistochemistry of PSD?95 protein expression in mouse hippocampus

圖3 caspase?3活化片段在生理鹽水組和氯胺酮組小鼠海馬區(qū)表達(dá)水平的變化Fig.3 Changes of hippocampal caspase?3 activation level in the groups of saline and ketamine

PSD?95片段大小為80 000，在生理鹽水組及氯胺酮組對(duì)應(yīng)位置均有表達(dá)，氯胺酮組PSD?95蛋白表達(dá)相對(duì)量（1.34±0.25）較生理鹽水組PSD?95蛋白表達(dá)相對(duì)量（1.75±0.05）降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 PSD?95蛋白在生理鹽水組和氯胺酮組小鼠海馬區(qū)表達(dá)水平的變化Fig.4 Changes of hippocampal PSD?95 protein level in the groups of saline and ketamine

3 討論

截至2013年底，我國累計(jì)登記在冊(cè)氯胺酮濫用者19萬，濫用人數(shù)居全球第3位，其中25歲以下青少年所占比例高達(dá)62%，氯胺酮已成為對(duì)我國青少年影響和危害最大的毒品種類之一［3］。目前研究多為單次或一日多次注射氯胺酮對(duì)新生或幼年個(gè)體的神經(jīng)毒性作用。研究［4?5］發(fā)現(xiàn)，氯胺酮單次注射可引起動(dòng)物腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡，且具有劑量-效應(yīng)關(guān)系。關(guān)于氯胺酮長(zhǎng)期毒性作用，有研究［6］表明其長(zhǎng)期反復(fù)作用會(huì)引起認(rèn)知功能的改變。YEUNG等［7］發(fā)現(xiàn)，氯胺酮以30 mg/kg劑量連續(xù)注射6個(gè)月后，小鼠前額葉皮質(zhì)區(qū)過度磷酸化tau的表達(dá)水平顯著升高。而SUN等［8］發(fā)現(xiàn)氯胺酮以30 mg/kg劑量注射6個(gè)月不引起前額葉皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。本研究擬探討氯胺酮長(zhǎng)期濫用是否會(huì)引起與認(rèn)知功能密切相關(guān)的小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡以及突觸損害。

caspase?3作為細(xì)胞凋亡的經(jīng)典標(biāo)志物被廣泛應(yīng)用于包括氯胺酮致神經(jīng)損傷在內(nèi)的研究中［9?10］。培養(yǎng)神經(jīng)元經(jīng)氯胺酮處理后呈現(xiàn)了時(shí)間依賴性數(shù)目減少及凋亡［11］。MAJEWSKI?TIEDEKEN等［12］對(duì)8～10周齡小鼠注射氯胺酮5次，每次間隔30 min，發(fā)現(xiàn)海馬CA3區(qū)凋亡增加。本研究經(jīng)Western blotting檢測(cè)，caspase?3活性片段表達(dá)量在氯胺酮組較生理鹽水組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)免疫組化染色，氯胺酮組小鼠海馬區(qū)caspase?3表達(dá)的神經(jīng)元較生理鹽水組多，且氯胺酮組彌漫性表達(dá)較生理鹽水組強(qiáng)。說明氯胺酮長(zhǎng)期濫用可致海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡增加。

PSD?95是突觸標(biāo)志性蛋白，在維持突觸可塑性方面起重要作用，與認(rèn)知功能關(guān)系密切。氯胺酮急性作用的實(shí)驗(yàn)［13］表明，氯胺酮會(huì)導(dǎo)致PSD?95表達(dá)下降，影響神經(jīng)突觸功能，引起認(rèn)知功能障礙。本研究經(jīng)Western boltting檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PSD?95在氯胺酮組小鼠海馬區(qū)表達(dá)較生理鹽水組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組化見PSD?95陽性物質(zhì)彌漫表達(dá)于海馬神經(jīng)元胞質(zhì)及突起中；氯胺酮組表達(dá)較生理鹽水組減弱。以上說明氯胺酮長(zhǎng)期濫用可致海馬區(qū)PSD?95表達(dá)減少。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)氯胺酮長(zhǎng)期濫用組小鼠海馬區(qū)凋亡相關(guān)蛋白caspase?3活性片段表達(dá)增加，突觸功能蛋白PSD?95表達(dá)減少，說明氯胺酮長(zhǎng)期濫用可致海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡及突觸損害，該變化可能與氯胺酮的神經(jīng)毒性作用以及對(duì)認(rèn)知功能的影響有關(guān)。

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（編輯 于 溪）

Change of Caspase?3 and PSD?95 Expression in Hippocampus of Mice with Chronic Ketamine Addiction

DU Ao1，REN Peng1，2，HE Bolin1，YANG Shuncheng3，DING Runtao1，SHEN Ruipeng1，LI Yanning1，DONG Zhibin1，LU Yan4，WU Xu1
（1.Department of Forensic Pathology，School of Forensic Medicine，China Medical University，Shenyang 110122，China；2.Department of Forensic Medicine，China Criminal Police College，Shenyang 110035，China；3.Forensic Science Division of Shenyang Municipal Public Security Department，Shenyang 110003，China；4.Key Laboratory of Health Ministry in Congenital Malformation，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

Objective To study the changes of hippocampal caspase?3 and PSD?95 expression levels in the mice exposed to ketamine 30 mg/（kg·d）for three months.Methods Forty C57BL/6 mice were randomly divided into two groups，and the chronic ketamine addiction model was established by giving mice a three month course of daily intraperitoneal injections of ketamine.Immunohistochemical study and Western blot?tingwereappliedtoobservetheexpressionofcaspase?3andPSD?95protein.Results Thereweremoreexpressionofcaspase?3andlessofPSD?95 in ketamine group as detected by immuohistochemistry.Western blotting results showed caspase?3 active fragment level significantly increased com?pared to saline group，but PSD?95 protein level was decreased.Conclusion The increased level of caspase?3 protein and reduced expression of PSD?95 are observed after long?term ketamine administration.These findings may provide an evidence for the neurotoxicity in mouse hippocampus of chronic ketamine addition as a recreational drug.

ketamine；caspase?3；postsynaptic density 95；hippocampus

R89

A

0258-4646（2017）03-0193-04

10.12007/j.issn.0258?4646.2017.03.001

國家自然科學(xué)基金（81171032，81100807，81671867）；遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目（L2014316）；遼寧省科學(xué)技術(shù)基金（2015020514）

杜傲（1991-），女，碩士研究生.

吳旭，E-mail：wuxu@mail.cmu.edu.cn

2016-11-04

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：