地黃飲子湯對(duì)腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

劉季紅

地黃飲子湯對(duì)腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

劉季紅

目的 探討腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的實(shí)驗(yàn)觀察。方法 選取清潔級(jí)大鼠60只，隨機(jī)分為尼莫地平組、地黃組、模型組、對(duì)照組，各15只。給予大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉，制造大鼠腦缺血再灌注的模型，分別測(cè)定腦組織內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量。尼莫地平組：造模后每日灌服尼莫地平12.5 mg/kg；地黃組：造模后每日灌服地黃飲子湯36 g/kg；模型組：造模后每日胃灌鹽水1次；對(duì)照組：正常飲食。連續(xù)喂藥3周后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，病理組織觀察計(jì)算大鼠腦梗死面積。結(jié)果 模型組與對(duì)照組比較，SOD含量明顯降低、MDA含量明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，證明實(shí)驗(yàn)造模成功。模型組學(xué)習(xí)記憶能力潛伏期、跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)潛伏期與對(duì)照組比較均明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；尼莫地平組和地黃組學(xué)習(xí)記憶能力潛伏期、跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)潛伏期分別與模型組比較均明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。地黃組腦梗死面積明顯小于尼莫地平組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。尼莫地平組和地黃組分別與模型組比較，SOD含量明顯增高，MDA含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 地黃飲子湯可修復(fù)腦缺血再灌注后神經(jīng)損傷，提高學(xué)習(xí)記憶能力，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

腦缺血再灌注；大鼠；學(xué)習(xí)記憶能力；超氧化物歧化酶；丙二醛

腦缺血再灌注導(dǎo)致腦細(xì)胞損傷進(jìn)一步加重，目前腦缺血再灌注已成為我國(guó)心腦血管疾病的第一大死亡原因。急性腦缺血導(dǎo)致大腦神經(jīng)受損，神經(jīng)功能缺失[1-2]，神經(jīng)生長(zhǎng)因子受抑制，嚴(yán)重者導(dǎo)致殘疾和死亡。臨床上以中藥為主要的治療藥物，地黃飲子湯[3-4]在臨床上治療缺血性中風(fēng)、血管性癡呆、阿爾茨海默病、腦萎縮等有一定療效。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立腦缺血再灌注大鼠模型，研究地黃飲子湯對(duì)大鼠學(xué)習(xí)能力、記憶能力的影響及對(duì)腦組織的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組 健康清潔級(jí)Wistar大鼠60只，雌雄不限，成年體重250 g～280 g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-LN2014-0008。隨機(jī)分為尼莫地平組、地黃組、模型組、對(duì)照組，各15只。尼莫地平組：造模后每日灌服尼莫地平12.5 mg/kg，連續(xù)3周(天津中央藥業(yè)公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：20130067，規(guī)格：20 mg/片，與注射用水溶解)；地黃組：造模后每日灌服地黃飲子湯36 g/kg，連續(xù)3周；模型組：造模后每日生理鹽水灌胃1次，連續(xù)灌胃3周；對(duì)照組：正常飲食。連續(xù)喂藥3周。

1.2 研究方法

1.2.1 造模 選用10%水合氯醛麻醉尼莫地平組、地黃組、模型組3組大鼠，固定，頸部正中切開，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈并用動(dòng)脈夾鉗夾30 min，用溫鹽水紗布保護(hù)切口創(chuàng)面，松開動(dòng)脈夾30 min后，再次用動(dòng)脈夾鉗夾30 min，使大鼠處于腦缺血再灌注狀態(tài)，模型完成。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)指標(biāo) 最后一次腦灌注后每組隨機(jī)取出1只大鼠斷頭，取除大腦烘干稱重，加入9倍鹽水制成10%腦組織勻漿液，參照試劑盒說(shuō)明書加入超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和考馬斯亮藍(lán)蛋白，測(cè)定腦組織內(nèi)SOD和MDA蛋白含量。

1.3 藥物配制 參照《黃帝素問(wèn)宣明論方》里地黃飲子的配制方法：熟地黃12 g，山茱萸15 g，石斛15 g，巴戟天15 g，白茯苓12 g，山茱萸15 g，石斛15 g，炮附子15 g，麥門冬15 g，肉蓯蓉15 g，菖蒲12 g，遠(yuǎn)志10 g，官桂10 g，五味子10 g。分別用12倍和10倍量水煎煮2次，各1 h，將兩次藥液混合，用旋轉(zhuǎn)儀蒸發(fā)濃縮，干燥密封備用。

1.4 儀器 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)記錄儀，OLYMPUS光學(xué)顯微鏡。

1.5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：

1.5.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 用于測(cè)試所有大鼠的學(xué)習(xí)能力和記憶能力。實(shí)驗(yàn)共4 d，每天3次，每次1 min。訓(xùn)練場(chǎng)地由一圓形水池和移動(dòng)平臺(tái)組成，水池上方有攝像機(jī)和監(jiān)視器與電腦連接，記錄大鼠游行軌跡、路程、到達(dá)平臺(tái)時(shí)間(潛伏期)。實(shí)驗(yàn)前將池中注入清水和牛奶，使水池變成不透明顏色，水溫保持24 ℃，水池分為四個(gè)象限，在密室內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)前1 d將大鼠放入水池中適應(yīng)環(huán)境2 min。次日進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，大鼠在池中1 min內(nèi)若未能找到平臺(tái)，潛伏期為60 s；在平臺(tái)上休息60 min后再次進(jìn)行訓(xùn)練。每只大鼠訓(xùn)練3次，連續(xù)訓(xùn)練4 d，分別記錄每組大鼠潛伏期。

1.5.2 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn) 用于檢測(cè)大鼠刺激后回避反應(yīng)時(shí)間(潛伏期)。經(jīng)過(guò)定位航行實(shí)驗(yàn)后，將大鼠放于平臺(tái)適應(yīng)環(huán)境5 min，開始通電，觀察大鼠是否雙足同時(shí)跳上絕緣臺(tái)，每只大鼠訓(xùn)練3 min。24 h后通過(guò)電腦開始測(cè)試每只大鼠在3 min內(nèi)跳上絕緣臺(tái)的次數(shù)和時(shí)間(潛伏期)。

1.6 測(cè)量大鼠腦梗死面積 治療3周后，斷頭取腦，鹽水沖洗大腦并吸干，大腦冠狀切片，加入1%2，3，5-三苯基四氮唑(TTC)磷酸液染色，避光30 min，間隔6 min轉(zhuǎn)動(dòng)1次，將腦片放在電鏡圖像分析系統(tǒng)中，計(jì)算腦梗死面積。

2 結(jié) 果

2.1 4組大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力比較 模型組的錯(cuò)誤次數(shù)、潛伏期與對(duì)照組比較均明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。尼莫地平組和地黃組的錯(cuò)誤次數(shù)、潛伏期與模型組比較均明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

組別n 學(xué)習(xí)能力 錯(cuò)誤次數(shù)(次)潛伏期(s) 記憶能力 錯(cuò)誤次數(shù)(次)潛伏期(s)尼莫地平組152.95±1.312)78.78±18.572)2.34±0.592)114.24±22.952)地黃組152.79±1.132)75.96±20.832)2.08±0.632)117.64±21.792)模型組155.35±1.761)98.36±23.921)2.85±0.781)92.73±18.121)對(duì)照組152.29±1.08 68.93±14.86 1.74±0.58 126.57±24.86 與對(duì)照組比較,1)P<0.05;與模型組比較,2)P<0.05。

2.2 4組大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)潛伏期比較 模型組潛伏期比對(duì)照組明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；地黃組和尼莫地平組潛伏期均比模型組明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

s

2.3 4組大鼠腦梗死面積比較 對(duì)照組腦梗死面積為0。地黃飲子組和尼莫地平組腦梗死面積明顯小于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。地黃組腦梗死面積明顯小于尼莫地平組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 4組大鼠腦梗死面積比較 %

2.4 4組大鼠SOD和MDA含量比較 模型組與對(duì)照組比較，SOD含量明顯降低、MDA含量明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，證明本實(shí)驗(yàn)造模成功。治療后地黃組和尼莫地平組與模型組比較，SOD含量明顯增高，MDA含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表4。

組別nSOD(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)尼莫地平組15130.26±18.741)2)3.26±1.791)2)地黃組15136.15±21.231)2)3.52±1.681)2)模型組1591.86±19.251)6.58±2.211) 對(duì)照組15157.79±23.64 2.33±1.58 與對(duì)照組比較,1)P<0.05;與模型組比較,2)P<0.05。

2.5 4組大鼠TTC染色(見圖1)

地黃組 尼莫地平組 模型組 對(duì)照組

3 討 論

腦缺血再灌注損傷病理機(jī)制復(fù)雜，如腦內(nèi)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)、細(xì)胞膜通透性增加、細(xì)胞水腫、細(xì)胞酸中毒、能量代謝障礙、自由基生成過(guò)多，細(xì)胞炎性因子釋放，凋亡等。SOD是一種金屬蛋白酶，它能清除由過(guò)氧化反應(yīng)生成的氧自由基，清除氧自由基同時(shí)，SOD含量減少[5]。MDA是由氧自由基與不飽和脂肪酸發(fā)生氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，即MDA含量提示腦組織內(nèi)氧自由基的含量。因此本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒MSOD含量降低，MDA含量增高，證實(shí)造模成功。通過(guò)分組治療，測(cè)試4組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中學(xué)習(xí)記憶能力潛伏期和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)潛伏期，得出結(jié)論地黃組和尼莫地平組潛伏期均明顯縮短；通過(guò)腦梗死面積比較，地黃飲子湯療效明顯優(yōu)于尼莫地平。治療后，地黃組和尼莫地平組均使腦組織內(nèi)SOD含量增高，MDA含量降低。

地黃飲子湯具有驅(qū)毒化瘀、滋腎陰、補(bǔ)腎陽(yáng)的功效，促進(jìn)腦神經(jīng)功能恢復(fù)。地黃飲子湯通過(guò)降低腦細(xì)胞的過(guò)氧化反應(yīng)，增加神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)SOD含量，增強(qiáng)機(jī)體清除過(guò)多的氧自由基能力，改善細(xì)胞膜通透性，維持細(xì)胞正常功能[6-7]，同時(shí)地黃飲子湯能改善腦部能量代謝，降低腦中乙酰膽堿酯酶活性，減輕海馬神經(jīng)元損傷[8-10]，進(jìn)而改善腦供血不足大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。研究發(fā)現(xiàn)[11-12]地黃飲子湯可顯著提高腦組織氧化應(yīng)激能力，通過(guò)不同劑量地黃飲子臨床研究得出，高劑量地黃飲子明顯提高大鼠腦內(nèi)SOD活性，減少細(xì)胞凋亡和氧化損傷，延緩大腦老化，保護(hù)腦細(xì)胞。

綜上所述，地黃飲子湯可修復(fù)腦缺血再灌注造成的神經(jīng)損傷，進(jìn)而提高學(xué)習(xí)記憶能力，為臨床治療腦缺血再灌注提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(本文編輯 薛妮)

遼寧沈陽(yáng)第九人民醫(yī)院(沈陽(yáng) 110024)，E-mail：ly200920513@tom.com

引用信息：劉季紅.地黃飲子湯對(duì)腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(2)：165-167.

R743 R331.3

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.02.011

1672-1349(2017)02-0165-03

2016-05-25)