三氧化二砷對人子宮內(nèi)膜癌細胞裸鼠模型中Caspase-3表達的影響

王明芳 張文劍 王新紅 邢海青 趙園園

三氧化二砷對人子宮內(nèi)膜癌細胞裸鼠模型中Caspase-3表達的影響

王明芳 張文劍 王新紅 邢海青 趙園園

目的 通過建立人子宮內(nèi)膜癌細胞HEC-1-B裸鼠模型，檢測不同濃度三氧化二砷(As2O3)對移植瘤細胞Caspase-3表達的影響，并探討As2O3的作用機制。方法 建立人子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細胞皮下移植瘤模型，按編號隨機分為實驗組即As2O3低(1.0 mg/kg)、中(2.5 mg/kg)、高(5.0 mg/kg)劑量組、空白對照生理鹽水(NS)組及陽性對照順鉑組(5.0 mg/kg)，連續(xù)腹腔給藥8天后，通過流式細胞儀及實時熒光定量RT-PCR 檢測移植瘤內(nèi)Caspase-3相對表達量。結(jié)果 與生理鹽水組比較，低、中濃度As2O3及順鉑均可上調(diào)Caspase-3的表達(P<0.05)，但高濃度組上調(diào)不明顯(P>0.05)。與順鉑組比較，As2O3低劑量組作用最明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；但與中、高濃度組比較，差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論 低濃度As2O3能上調(diào)人子宮內(nèi)膜癌細胞內(nèi)Capase-3的表達，且優(yōu)于順鉑，可能是三氧化二砷誘導細胞凋亡的作用機制之一。

三氧化二砷；子宮內(nèi)膜癌；Caspase-3

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:009～011)

三氧化二砷(arsenic trioxide，As2O3)俗稱砒霜，治療血液病效果顯著，而且對于某些實體瘤尤其是肝癌的治療亦見療效[1]，其抗腫瘤作用及其機制日益受到廣大學者的廣泛關(guān)注[2]。我們已在前期實驗中證實了As2O3對子宮內(nèi)膜癌細胞的抑制增殖作用，本實驗旨在探討As2O3在體內(nèi)抗腫瘤的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株及實驗動物 人子宮內(nèi)膜癌細胞株HEC-1-B細胞株，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。Balb/c-nu裸小鼠，40 只，4～6 周齡，雌性，體質(zhì)量15～18 g，購自蘇州貝爾達實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于SPF(specific pathogen free condition)級動物實驗室。

1.1.2 藥物與試劑 As2O3購自哈爾濱伊達藥業(yè)有限公司，順鉑注射液購自豪森藥業(yè)股份有限公司，多克隆活性Caspase-3抗體購自BD公司，引物及熒光探針由上海生物公司合成，Trizol試劑盒購自In-vitrogen公司，Real-Time PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與動物實驗模型的建立 將HEC-1-B細胞株貼壁培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、雙抗(青霉素100 u/mL，鏈霉素100 u/mL)的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2溫箱中，2天更換1次培養(yǎng)液，當細胞80%融合時傳代培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期的細胞，胰酶消化，制備成濃度3×107單細胞懸液0.2 mL，在超凈工作臺內(nèi)接種于裸鼠的腋下，8天后均形成直徑0.5 cm以上的移植瘤。

1.2.2 裸鼠分組及給藥 將其按編號隨機分為5組，分別設為生理鹽水組，順鉑組(5.0 mg/kg)，As2O3低劑量組(1 mg/kg)、As2O3中劑量組(2.5 mg/kg)、As2O3高劑量組(5.0 mg/kg)。將As2O3和順鉑按比例(1∶100)在無菌條件下配成目標濃度，用無菌注射器抽取0.2 mL注入裸鼠腹腔，共給藥8天。24 h時后將裸鼠稱重后用摘眼球取血法處死，剝離腫瘤切塊后分別用無水乙醇、液氮速凍備用。

1.2.3 流式細胞測定 將經(jīng)70%冰乙醇固定的部分腫瘤標本，在超凈工作臺內(nèi)用研磨棒研碎，用400目濾網(wǎng)過濾，低速離心(800 r/min)去除碎片，PBS洗滌后，制成單細胞懸液，采用triton細胞打孔后加入PE標記的活性Caspase-3抗體，同時設立空白染色對照組，染色半小時后通過流式細胞儀進行Caspase-3活性的測定。采用Cellquest3.1f收集細胞，用ModfitLTV2.0軟件系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.2.4 實時熒光定量PCR(Real-time PCR) 將液氮凍存腫瘤標本，剪成小塊并研磨成碎片，按照RNA提取說明書方式提取RNA，分光光度計檢測所提RNA260/280吸光值，選取比值在1.8～2.0之間的RNA樣本，按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄體系要求(反應條件為37° 15 min反轉(zhuǎn)錄反應，85° 5 s 失活反應)合成cDNA，以GDPT為管家基因，應用Rotor-Gene 3000 熒光定量PCR儀(Corbett Research 公司)進行PCR反應。用Roche Light Cycler probe design software 2.0軟件設計引物及探針，由上海生工公司合成。Caspase-3前引物序列：5’-AAATACCAGTGGAGGCCCGACTT-3’，后引物序列：5’-AAGCTTGTCGGCATACTGTTTCA-3’;Taq探針序列：5’-TGGCTCCTGGTT CATCCAGTCGCGCTT-3。GDPH前引物序列：5’-GCCAAAAGGGTCATCATCTC-3’，后引物序列：5’-GGCCATCCACAGTCTTCT-3’；Taq探針序列：5’-AAGA TCATCA GCA A TGCCTCCTGC-3’。按TAKARA說明書進行PCR熒光定量反應，PCR反應條件：預變性95°10 s，1cycle，PCR反應95° 5 s，60° 20 s，45cycle。測定CT值，采用2-△△CT法進行Caspase-3基因表達相對定量分析，CT值為熒光信號達到閾值時的循環(huán)數(shù)，△CT為同一樣本達到閾值時靶基因Caspase-3與對照基因GDPH擴增所需的循環(huán)數(shù)差值即△CT=CT(Caspase-3)-CT(GDPH)，2-△△CT值代表經(jīng)GDPH校正后的靶mRNA的數(shù)目。公式：F=2-[(對照組目的基因平均Ct值-對照組管家基因平均Ct值)-(待測樣品目的基因平均Ct值-待測樣品管家基因平均Ct值)]

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 流式細胞儀檢測移植瘤內(nèi)Caspase-3活性結(jié)果

前期實驗中應用流式細胞儀檢測到低濃度As2O3組和順鉑組均出現(xiàn)典型的細胞凋亡表現(xiàn)——亞G1峰，證實As2O3有誘導子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡的作用。本實驗進一步測定Caspase-3活性，發(fā)現(xiàn)與空白對照組比較，不同濃度的As2O3作用強度不同，其中低劑量As2O3組的熒光強度最強，說明其Caspase-3活性最大，順鉑組次之，生理鹽水組強度最小，說明Caspase-3活性最小。

2.2 Real-time PCR 檢測移植瘤內(nèi)Caspase-3的表達

根據(jù)熒光定量曲線(圖1)，測定CT值，規(guī)定生理鹽水組基因表達量為1，則得順鉑組及低、中、高劑量As2O3組基因表達相對量，通過表1可見低、中劑量As2O3組和順鉑組Caspase-3基因表達量明顯高于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；但高劑量組與生理鹽水組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，雖然數(shù)值上高于生理鹽水組。與順鉑組比較，As2O3低劑量組作用最高，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；而中、高劑量組與順鉑組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。說明As2O3低劑量組對Caspase-3表達的影響強于順鉑。

3 討論

子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer，EC)近年發(fā)病率呈明顯上升和年輕化趨勢，死亡率高，危害性大。多個

表1 移植瘤內(nèi)Caspase-3相對定量分析

注：a指與生理鹽水組比較，P<0.05；b指與順鉑組比較，P<0.05。

圖1 Caspase-3熒光定量曲線

實驗證實在子宮內(nèi)膜癌中半胱氨酸蛋白酶Caspase-3的表達很低甚至無表達，明顯低于正常子宮內(nèi)膜，而且表達水平越低，分化越差，提示子宮內(nèi)膜癌凋亡失控與Caspase-3表達減少有密切關(guān)系[3]。三氧化二砷是一種細胞原漿毒物質(zhì)，可以通過多種機制多靶點誘導細胞凋亡，其中三氧化二砷可以破壞線粒體跨膜電位，在線粒體損傷應答刺激下激活細胞內(nèi)的Caspase-3，活化的Caspase-3再瀑布式激活Caspase-2，6，8，10等，最終水解核酸及細胞骨架蛋白，引起細胞凋亡[4]，Caspase-3被認為是凋亡事件的真正執(zhí)行者[2]。

本實驗中通過建立裸鼠模型，通過2種不同的檢測方法，均發(fā)現(xiàn)NS組Caspase-3的表達最低，經(jīng)過三氧化二砷和順鉑處理后Caspase-3的表達均有所增加，其中低濃度組效果最明顯，中濃度組次之，有統(tǒng)計學意義，證實三氧化二砷能上調(diào)Caspase-3的表達。說明三氧化二砷上調(diào)Caspase-3可能是誘導子宮內(nèi)膜癌細胞的凋亡的作用機制之一。多數(shù)研究表明，三氧化二砷抗腫瘤作用具有濃度、時間依賴關(guān)系，在低劑量時具有抑制細胞增殖、誘導凋亡的作用，高劑量時起細胞毒作用，造成病理性死亡[5]。這種效應的強度和細胞型別依賴性與ROS的水平不同有關(guān)，最終不同水平的ROS通過影響Caspase-3激活的活性及ATP水平?jīng)Q定細胞命運，出現(xiàn)不同的死亡方式[6]。本研究中發(fā)現(xiàn)三氧化二砷和順鉑均可影響Caspase-3的活性，但發(fā)現(xiàn)不同濃度的三氧化二砷對Caspase-3的影響不同，其中低濃度

三氧化二砷的作用最明顯，并高于順鉑對Caspase-3表達的影響，而高濃度組作用效果最差，進一步證實，三氧化二砷調(diào)節(jié)Caspase-3的作用與濃度相關(guān)，以低濃度最適宜。但與體外實驗不同的是，本實驗中三氧化二砷的抗子宮內(nèi)膜癌作用不存在典型的濃度依賴關(guān)系。由于三氧化二砷治療劑量與中毒劑量接近，增加藥物劑量，就有增加毒性和副作用的可能。因此探索合適的劑量，達到最大效度的抑瘤作用而不增加毒副作用，有待于進一步的深入研究。

綜上所述，三氧化二砷可以上調(diào)Caspase-3的表達，可能是誘導子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡的機制。但三氧化二砷誘導細胞凋亡的機制是多通路、多靶點的，需要進一步深入研究并尋找最佳作用劑量。

[1] 邱從坤，陳國碩，王忠富.三氧化二砷治療肝癌的研究進展〔J〕.中華介入放射科電子雜志，2015，3(1):52-55.

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[3] 孫 炯，楊留才，李仕紅.Livin與Caspase-3在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達水平及相關(guān)性研究〔J〕.醫(yī)學綜述，2014，20 (9):1708-1710.

[4] Matos AJ，Santos AA.Advances in the understanding of the clinically relevant genetic pathway and molecular aspects of canine mammary tumours;part Ⅰ proliferation apoptosis and DNA repair〔J〕.Vet J，2015，205(2):136-143.

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(編輯：甘 艷)

EFFECT of Arsenic Trioxide on Caspase-3 in Nude Mice Models of Human Endometrial Carcinoma Cell Lines(Hec-1B)

WANGMingfang，ZHANGWenjian，WANGXinhong，etal.

TheAffiliatedYiduCentralHospitalofWeifangMedicalUniversity，Qingzhou，262500

Objective To study the effect of arsenic trioxide(As2O3)on expression of Caspase-3 in nude mice models of human endometrial carcinoma cell lines(Hec-1B).Methods The nude mice models of endometrial carcinoma cell lines(Hec-1B)were randomized into 5 groups via number，then they were treated with NS，DDP，increasing concentrations of As2O3(1.0 mg/kg，2.5 mg/kg，5.0 mg/kg)by intraperitoneal injection.The Caspase-3 expression was detected by flow cytometry and real-time PCR.Results Compared with NS group，the As2O3(1 mg/kg、2.5 mg/kg)groups and DDP group increased significantly the expression of Caspase-3(P<0.05).But As2O3(5 mg/kg)group hadn’t distinguished effection.Compared with DDP group，the As2O3(1 mg/kg)group was statistically significant(P<0.05)，but the As2O3(2.5 mg/kg、5 mg/kg)groups weren’t.Conclusion(1 mg/kg)As2O3can increase the expression of Caspase-3，and was superior to DDP，the action may be one of mechanisms of arsenic trioxide inducing apoptosis.

Arsenic trioxide(As2O3);Endometrial carcinoma;Caspase-3

山東省衛(wèi)生廳青年基金資助項目(編號：2001CA2CKB6)

262500 山東省濰坊市益都中心醫(yī)院(王明芳，張文劍，王新紅，邢海青)；266005 青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院(趙園園)

趙園園

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.01.003

R737.33

A

1001-5930(2017)01-0009-03

2016-09-30

2016-12-08)