利用生物信息學(xué)技術(shù)分析APC基因同義突變SNP在家族性腺瘤性息肉病發(fā)病機(jī)制的研究*

楊 軍，劉為青，李文亮，王志強(qiáng)，董 堅,3△

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，昆明 650032;2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，昆明 650032;3.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，昆明 650106)

利用生物信息學(xué)技術(shù)分析APC基因同義突變SNP在家族性腺瘤性息肉病發(fā)病機(jī)制的研究*

楊 軍1，劉為青2，李文亮1，王志強(qiáng)1，董 堅2,3△

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，昆明 650032;2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，昆明 650032;3.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，昆明 650106)

目的 利用生物信息學(xué)技術(shù)分析APC基因同義突變SNP(sSNP)在家族性腺瘤性息肉病(FAP)中的發(fā)病機(jī)制。方法 選取云南省遺傳性大腸癌組織標(biāo)本庫中的5個FAP患者的組織標(biāo)本進(jìn)行APC基因突變比對分析，將篩選得到的sSNP進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測，包括蛋白編碼、剪接調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、翻譯后調(diào)節(jié)，并對RNA二級結(jié)構(gòu)影響分析方面的預(yù)測。結(jié)果 篩選得到5個可能對APC蛋白產(chǎn)生影響的sSNP，生物信息學(xué)預(yù)測提示這些sSNP 在mRNA水平影響剪接增強(qiáng)子(ESE)從而引起APC外顯子異常剪切，使APC蛋白截短而導(dǎo)致FAP。RNA二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)這些sSNP對RNA穩(wěn)定、與其他RNA或蛋白的相互作用等產(chǎn)生功能性影響。結(jié)論 利用生物信息學(xué)預(yù)測手段，APC基因的某些sSNP引起的突變效應(yīng)可以解釋部分APC陰性FAP的病因。

基因；腺瘤息肉病，結(jié)腸；遺傳性疾病，先天性；家族性腺瘤樣息肉病；APC基因；同義突變SNP；生物信息學(xué)工具

家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis,FAP)是一類特殊類型的遺傳性大腸癌，其臨床表現(xiàn)為消化系統(tǒng)特別是下消化道黏膜遍布成百上千的腺瘤性息肉,這些息肉最終都將轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)直腸癌。此類患者早期多無臨床癥狀,出現(xiàn)消化道癥狀就診時多已為疾病中晚期,多數(shù)自然生存時間不超過40歲,預(yù)后極差[1]。由于遺傳性大腸癌具有家族聚集性以及特征性的發(fā)病過程，因此，對于此類人群的篩查較散發(fā)性大腸癌相對簡便。同時，F(xiàn)AP具備典型的息肉-腺瘤-癌變過程，是大腸癌發(fā)病機(jī)制研究的最佳樣本。

既往研究認(rèn)為，F(xiàn)AP為常染色體顯性遺傳性疾病，F(xiàn)AP的發(fā)病主要是由位于人類染色體5q21的APC基因突變所致。為探索FAP患者的相關(guān)致病基因及其發(fā)病機(jī)制，經(jīng)項目依托單位倫理委員會批準(zhǔn)后，項目組自2005年按照“中國人遺傳性大腸癌篩檢標(biāo)準(zhǔn)”[2]開始收集云南省FAP家系樣本并逐漸建立遺傳性大腸癌組織標(biāo)本庫[3]。在此基礎(chǔ)上，項目組按照常規(guī)篩查手段已完成了所有收集的FAP家系患者的APC基因的篩查工作[4]。

前期關(guān)于FAP家系內(nèi)先證者的突變基因篩查工作，包括已報道的與FAP發(fā)病密切相關(guān)的APC、MUTYH及AXIN2基因的全部測序及分析,除了僅發(fā)現(xiàn)的與FAP發(fā)病密切相關(guān)的部分致病性突變位點以外，許多患者未檢測到已報道的與致病密切相關(guān)的突變位點，也即為APC陰性FAP患者[5]。本研究對這些沒有確切致病原因的家系內(nèi)的基因掃描結(jié)果進(jìn)行了全面的統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，許多同義突變SNP(synonymous SNP，sSNP)在不相關(guān)的FAP患者中重復(fù)多次出現(xiàn)，且出現(xiàn)頻率較高。既往普遍共識認(rèn)為，sSNP為沉默突變，與疾病發(fā)生、發(fā)展無明顯關(guān)系；而2007年Kimchi-Sarfaty等[6]發(fā)表于《Sicence》的關(guān)于MDR-1的同義突變體的文章卻認(rèn)為，“沉默突變”在特定的環(huán)境下，會影響最終翻譯出的蛋白的功能。隨后，與許多疾病相關(guān)的sSNP逐漸被發(fā)現(xiàn)并通過國際千人基因組計劃數(shù)據(jù)被證實。針對sSNP最新研究表明，某些同義突變雖然其編碼的氨基酸未發(fā)生改變，但是由于核苷酸序列的改變在mRNA水平上擾亂了相應(yīng)區(qū)域的外顯子剪接增強(qiáng)子基因序列，導(dǎo)致外顯子剪接增強(qiáng)子不能被調(diào)控因子所識別，隨后引起該區(qū)域的外顯子剪切出現(xiàn)跳躍或是移碼，使得相應(yīng)的蛋白出現(xiàn)截短，最終可能引起疾病的發(fā)生。

結(jié)合本研究發(fā)現(xiàn)及關(guān)于其他致病性同義突變的研究結(jié)果，筆者認(rèn)為，利用生物信息學(xué)網(wǎng)站及相關(guān)軟件對篩選得到的APC-sSNP進(jìn)行深入的數(shù)據(jù)分析，將APC-sSNP進(jìn)一步定位并進(jìn)行相應(yīng)功能研究，有望為尋找既往常規(guī)篩查手段認(rèn)定為APC陰性FAP患者的致病原因提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 選擇項目組已建立的云南省遺傳性大腸癌組織標(biāo)本庫中的5個FAP患者的組織標(biāo)本，選取的FAP患者均為符合FAP的臨床診斷。

1.2 組織DNA提取 按Invitrogen DNA提取試劑盒說明書提取組織樣本DNA。APC基因擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物純化參照參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。

1.3 APC基因突變比對分析 對所有APC基因PCR產(chǎn)物測序結(jié)果，采用Mutation Surveyor軟件(http://www.softgenetics.com/)分析尋找突變位點。隨后，將上述檢測所得突變位點與人類基因突變數(shù)據(jù)庫(http://www.hgmd.org/)、國際HapMap項目(www.hapmap.org/)、核苷酸變異和突變數(shù)據(jù)庫(http://www.mutationdiscovery.com/md/MD.com/home_page.jsp)、dbSNP數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)、千人基因組計劃(http://www.1000genomes.org/),以及Ensembl數(shù)據(jù)庫(www.ensembl.org/)進(jìn)行比對分析，以篩選已報道的致病性突變位點。隨后進(jìn)一步利用國內(nèi)外已建立的專門針對APC基因突變位點數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步進(jìn)行比對分析，主要包括：UMD的APC基因突變數(shù)據(jù)庫(http://www.umd.be/APC/)、APC數(shù)據(jù)庫(http://www.LOVD.nl/APC)、浙江大學(xué)基因和基因組學(xué)中心APC基因數(shù)據(jù)庫(http://www.genomed.org/lovd2/home.php?select_db=APC)，以及APC 突變數(shù)據(jù)庫(http://fap.taenzer.me)等。

1.4 APC-sSNP生物信息學(xué)預(yù)測 經(jīng)由上述數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對后，與既往已報道的多核苷酸多態(tài)位點(SNP)進(jìn)行比對。對已報道過的SNP位點，根據(jù)既往習(xí)慣標(biāo)記其SNPID編碼。隨后將篩選得到的APC-sSNP進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測，包括蛋白編碼、剪接調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、翻譯后調(diào)節(jié)，并對RNA二級結(jié)構(gòu)影響分析方面的預(yù)測。(1)SNP蛋白編碼功能預(yù)測。判斷目標(biāo)SNP是否位于編碼區(qū)域，若是無義突變，其為致病性SNP；若是錯義突變，對比Ensembl數(shù)據(jù)庫查詢，并采用PolyPhen-2[8]，SIFT[9]，SNPs3D[10]，以及LS-SNP[11]軟件綜合分析目標(biāo)SNP是否為致病性突變。(2)SNP剪接調(diào)節(jié)功能預(yù)測。利用Ensembl數(shù)據(jù)庫查詢目標(biāo)SNP是否位于內(nèi)含子剪切位點，若是內(nèi)含子剪切位點SNP，其為致病性突變；若目標(biāo)SNP位于外顯子剪切點并位于保守區(qū)域，結(jié)合ESEfinder[12]，ESRSearch[13]，PESX[14]及RESCUE_ESE[15]軟件綜合分析目標(biāo)SNP是否為致病性突變。(3)SNP轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能預(yù)測。利用TF Search(http://diyhpl.us/～bryan/irc/protocol-online/protocol-cache/TFSEARCH.html)及Consite[16]軟件分析目標(biāo)SNP，若是否位于TF結(jié)合位點并位于保守區(qū)域，證實該SNP是致病性突變；若目標(biāo)SNP位于其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域且位于保守區(qū)域，利用Gonden Path[17]軟件及Ensembl數(shù)據(jù)庫分析目標(biāo)SNP是否為致病性突變。(4)SNP翻譯后調(diào)節(jié)功能預(yù)測。分別利用Kinase Phos[18]軟件分析目標(biāo)SNP是否位于磷酸化位點，OGPET[19]軟件分析目標(biāo)SNP是否位于O-糖基化位點，Sulfinator[20]軟件分析目標(biāo)SNP是否位于硫酸化酪氨酸位點，從而分析目標(biāo)SNP是否為致病性突變。(5)目標(biāo)SNP對RNA二級結(jié)構(gòu)影響分析。利用RNAsnp[21]進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 APC基因篩查結(jié)果 篩選得到5個可能對APC蛋白產(chǎn)生影響的sSNP，它們分別是位于APC基因11號外顯子的①號APC-sSNP:c.1458T>C(rs2229992)及位于APC基因15號外顯子的②號APC-sSNP:c.4425G>A(rs41115)，③號APC-sSNP:c.5034G>A(rs42427)，④號APC-sSNP:c.5268T>G(rs866006)和⑤號APC-sSNP:c.5880G>A(rs465899)，見表1。其中，c.1458T>C(rs2229992)位于APC蛋白的第2個Armadillo repeat區(qū)域(APC蛋白與Asef1，Asef2 IQGAP1結(jié)合區(qū)域)，5880G>A(rs465899)剛好處于APC蛋白的第6個20 amino repeat(APC蛋白與β-catenin蛋白密切結(jié)合)區(qū)域，而c.4425G>A(rs41115)及c.5034G>A(rs42427)分別位于APC蛋白第3個20 amino repeat前及第4個20 amino repeat后，而c.5268T>G(rs866006)則位于APC蛋白的第2個SAMP repeat 區(qū)域(APC蛋白與AXIN蛋白結(jié)合的功能區(qū)域)后，見圖1。

表1 APC基因突變位點

圖1 APC-sSNP在APC蛋白的定位

2.2 APC-sSNP生物學(xué)功能預(yù)測 本研究隨后將篩選得到的APC-sSNP進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測，進(jìn)行了包括蛋白編碼，剪接調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及翻譯后調(diào)節(jié)4個方面的預(yù)測，結(jié)果顯示，所有sSNP均無蛋白編碼、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及翻譯后調(diào)節(jié)方面的功能，僅在蛋白的剪接調(diào)節(jié)方面發(fā)揮作用。以上這些APC-sSNP均不同程度干擾APC外顯子的剪切過程，見表2、3。

表2 APC-sSNP生物學(xué)功能信息預(yù)測結(jié)果

表3 APC-sSNP對剪接增強(qiáng)子的干擾分析結(jié)果

分別將這些APC-sSNP對RNA二級結(jié)構(gòu)影響的預(yù)測分析，本研究發(fā)現(xiàn)，除了⑤號APC-sSNP對RNA二級結(jié)構(gòu)無影響，其余所有APC-sSNP如①、②、③及④號對RNA二級結(jié)果影響較大(圖2)。與野生型相比，①、②、③號突變體的主莖環(huán)結(jié)構(gòu)無顯著差異，其中，①號APC-sSNP在主莖環(huán)結(jié)構(gòu)外增加了一種類似的“莖泡”樣結(jié)構(gòu)；②號APC-sSNP突變體在主莖環(huán)結(jié)構(gòu)上減少了兩個“莖泡”樣結(jié)構(gòu)，且其附近的莖環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)生了輕微改變；③號APC-sSNP突變體主莖環(huán)結(jié)構(gòu)的部分莖環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)生了輕微改變；而④號APC-sSNP的主莖環(huán)結(jié)構(gòu)與野生型的主莖環(huán)結(jié)構(gòu)顯著差異。

圖2 APC-sSNP對RNA二級結(jié)構(gòu)影響的預(yù)測分析結(jié)果

3 討 論

目前普遍共識認(rèn)為，對FAP患者早期干預(yù)以及高危人群的早期發(fā)現(xiàn)能使該類患者獲益。因此探討FAP的早期發(fā)現(xiàn)及早期診斷是當(dāng)前該研究領(lǐng)域的熱點。針對FAP的早期診斷，國內(nèi)外同類研究結(jié)果均提示基因篩查是診斷無臨床表現(xiàn)的遺傳性大腸癌致病基因攜帶者最準(zhǔn)確的方法之一[1]。但是，按照現(xiàn)有常規(guī)篩查手段進(jìn)行APC基因突變檢測，APC基因突變的檢出率從30%到60%，且在不同國家或區(qū)域APC突變陽性檢出率同樣存在較大差異[22]。由于仍有大部分的FAP患者其真正的病因未能明確，國內(nèi)外將此類患者歸結(jié)為APC陰性FAP[5]。對此，目前國際上大多認(rèn)為有兩種可能，(1)APC基因異常突變的存在；(2)其他易感基因的存在[5]。而探索并研究這部分患者的病因及相關(guān)發(fā)病機(jī)制更是目前本研究領(lǐng)域的重點。

為探索FAP患者的相關(guān)致病基因及其發(fā)病機(jī)制，項目組對已收集的FAP家系內(nèi)先證者按照常規(guī)篩查手段對APC基因進(jìn)行檢測，80%的FAP患者未檢測到APC基因的突變。而在擴(kuò)大篩查范圍，進(jìn)行了其他與FAP發(fā)病可能相關(guān)的其他基因，包括進(jìn)行MUTYH基因及AXIN2基因的篩查[4]，仍未發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果。前期關(guān)于APC基因篩查的所有結(jié)果中，包含了許多錯義突變，內(nèi)含子突變及同義突變。其中錯義突變及內(nèi)含子突變既往均已有報道證實無確切致病性，而經(jīng)過全面的生物信息學(xué)分析，本課題組發(fā)現(xiàn)許多sSNP在不相關(guān)的FAP患者中重復(fù)高頻出現(xiàn)。

既往一致認(rèn)為，同義突變是堿基被替換之后，產(chǎn)生了新的密碼子，但由于生物的遺傳密碼子存在簡并現(xiàn)象，新舊密碼子仍是同義密碼子，所編碼的氨基酸種類保持不變，因此認(rèn)為同義突變?yōu)槌聊蛔?，并不產(chǎn)生突變效應(yīng)。但是，Kimchi-Sarfaty等證實某些特定類型的sSNP 與疾病發(fā)生明確相關(guān)[6]；近期研究發(fā)現(xiàn)P53基因的同義突變導(dǎo)致其mRNA剪切出現(xiàn)問題而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[23]。因此，同義突變?yōu)槌聊蛔兊挠^點受到挑戰(zhàn)。隨后與許多疾病相關(guān)的sSNP逐漸被發(fā)現(xiàn)并通過國際千人基因組計劃數(shù)據(jù)被證實，而與各類腫瘤相關(guān)的sSNP相繼在各類惡性腫瘤的基因篩查中被發(fā)現(xiàn)，如與吸煙相關(guān)致癌性的NBS1基因的sSNP(rs709816，rs1061302)[24]；與結(jié)直腸癌化療療效相關(guān)的ERCC1基因的sSNP(rs11615)[25]；白血病治療過程中導(dǎo)致化療抵抗的WT1基因的sSNP(rs2229069)[26]；與非小細(xì)胞肺癌預(yù)后相關(guān)的EGFR基因的sSNP(rs2293347)[27]及化療抵抗相關(guān)的MDR1基因的sSNP(rs1045642)[28]等。結(jié)合上述研究結(jié)果，將本研究中所檢測得到APC-sSNP的進(jìn)一步定位及相應(yīng)功能研究，可能為解釋APC陰性FAP患者的致病原因提供理論依據(jù)。為避免與健康人群產(chǎn)生交叉，通過與國際千人基因組計劃數(shù)據(jù)進(jìn)行初篩，剔除健康人群中存在的APC-sSNP。本研究篩選得到5個可能對APC蛋白影響的sSNP，分別是位于APC基因11號外顯子的①號APC-sSNP:c.1458T>C(rs2229992)及位于APC基因15號外顯子的②號APC-sSNP:c.4425G>A(rs41115)，③號APC-sSNP:c.5034G>A(rs42427)，④號APC-sSNP:c.5268T>G(rs866006)和⑤號APC-sSNP:c.5880G>A(rs465899)，而上述APC-sSNP分別定位于APC蛋白的特殊區(qū)域。

正常APC蛋白與Axin、GsK-3β等形成復(fù)合物保證Wnt信號途徑對細(xì)胞分化、增殖、極性以及遷移的正常調(diào)節(jié)，而且APC蛋白含有多個功能域，不同的功能域發(fā)揮各自的特殊作用[29]。根據(jù)上述APC-sSNP在APC蛋白表達(dá)定位結(jié)果顯示，①號APC-sSNP位于APC蛋白的第2個Armadillo重復(fù)序列內(nèi)，該序列所在區(qū)域是APC蛋白與Asef1，Asef2 IQGAP1結(jié)合區(qū)域。Armadillo區(qū)含有7個Armadillo重復(fù)序列，此區(qū)域非常保守，對維持APC在和細(xì)胞的基本功能非常重要；而②號、③號APC-sSNP分別位于APC蛋白的第3個及第4個20氨基酸重復(fù)序列后，⑤號APC-sSNP則剛好處于APC蛋白的第6個20氨基酸重復(fù)序列內(nèi)。既往研究提示，APC蛋白共有7個20氨基酸重復(fù)序列，由于每個20氨基酸重復(fù)序列都含有SXXXS保守序列并可作為糖原合成GSK-3β的磷酸化位點，主要參與β-catenin的降解。有研究證實，APC蛋白的第3個20氨基酸重復(fù)序列是APC蛋白與β-catenin緊密結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域[29]。此外，④號APC-sSNP則位于APC蛋白的第2個SAMP重復(fù)序列后，該重復(fù)序列區(qū)域是APC蛋白與AXIN蛋白結(jié)合的功能區(qū)域，該區(qū)域的突變效應(yīng)可能導(dǎo)致APC蛋白無法形成復(fù)合物，最終可能引起FAP的發(fā)生[30]。

為進(jìn)一步檢測上述APC-sSNP可能引起的突變效應(yīng)，本研究對上述5個APC-sSNP分別進(jìn)行了包括蛋白編碼，剪接調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及翻譯后調(diào)節(jié)4個方面的預(yù)測，結(jié)果顯示，所有APC-sSNP均無蛋白編碼，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及翻譯后調(diào)節(jié)方面的功能，僅在蛋白的剪接調(diào)節(jié)方面發(fā)揮作用。其中，①號APC-sSNP位點處于APC基因11號外顯子邊緣區(qū)域，其對APC表達(dá)剪切的影響可能是直接導(dǎo)致APC的11號外顯子出現(xiàn)跳躍；而②、③、④號及⑤號APC-sSNP分別處于APC基因15號外顯子序列的中間區(qū)域，其產(chǎn)生的效應(yīng)可能是引起APC的15號外顯子的移碼突變，該類突變或許對RNA穩(wěn)定，與其他RNA或蛋白的相互作用等產(chǎn)生功能性影響。此外，本研究還對上述APC-sSNP對RNA二級結(jié)構(gòu)的影響進(jìn)行了預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)除⑤號APC-sSNP對RNA二級結(jié)構(gòu)無影響外，其余所有APC-sSNP，包括①、②、③號及④號對RNA二級結(jié)果影響較大。與野生型相比，①、②、③號突變體的主莖環(huán)結(jié)構(gòu)無顯著差異，其中①號APC-sSNP在主莖環(huán)結(jié)構(gòu)外增加了一種類似的“莖泡”樣結(jié)構(gòu)；②號APC-sSNP突變體在主莖環(huán)結(jié)構(gòu)上減少了兩個“莖泡”樣結(jié)構(gòu)，且其附近的莖環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)生了輕微改變；③號APC-sSNP突變體主莖環(huán)結(jié)構(gòu)的部分莖環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)生了輕微改變；而④號APC-sSNP的主莖環(huán)結(jié)構(gòu)與野生型的主莖環(huán)結(jié)構(gòu)顯著差異。

綜上所述，對APC-sSNP的生物信息學(xué)預(yù)測提示，APC基因的某些sSNP引起的突變效應(yīng)也許可以解釋部分APC陰性FAP的病因。但是，對于上述APC-sSNP導(dǎo)致APC蛋白截短及異常剪切的機(jī)制尚需深入研究，并應(yīng)在細(xì)胞及動物實驗水平進(jìn)一步探討上述APC-sSNP的功能及其作用機(jī)制。

[1]Ficari F,Cama A,Valanzano R,et al.APC gene mutations and colorectal adenomatosis in familial adenomatous polyposis[J].Br J Cancer,2000,82(2):348-353.

[2]全國遺傳性大腸癌協(xié)作組．中國人遺傳性大腸癌篩檢標(biāo)準(zhǔn)的實施方案[J]．中華腫瘤雜志，2004，26(3)：191-192．

[3]陳明清，珠珠，戴莉萍，等．云南省遺傳性大腸癌組織庫的建立及管理[J]．世界華人消化雜志，2008，16(27)：3122-3125．

[4]楊軍，劉為青，李文亮，等．APC、MYH及AXIN2基因突變檢測在家族性腺瘤性息肉病胚系突變篩查中的應(yīng)用[J]．世界華人消化雜志，2015，23(4)：556-562．

[5]Renkonen ET,Nieminen P,Abdel-Rahman WM,et al.Adenomatous polyposis families that screen APC mutation-negative by conventional methods are genetically heterogeneous[J].J Clin Oncol,2005,23(24):5651-5659.

[6]Kimchi-Sarfaty C,Oh JM,Kim IW,et al.A "silent" polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity[J].Science,2007,315(5811):525-528.

[7]Wei SC,Su YN,Tsai-Wu JJ,et al.Genetic analysis of the APC gene in Taiwanese familial adenomatous polyposis[J].J Biomed Sci,2004,11(2):260-265.

[8]Ng PC,Henikoff S.Predicting deleterious amino acid substitutions[J].Genome Res,2001,11(5):863-874.

[9]Calabrese R,Capriotti E,Fariselli P,et al.Functional annotations improve the predictive score of human disease-related mutations in proteins[J].Hum Mutat,2009,30(8):1237-1244.

[10]Yue P,Melamud E,Moult J.SNPs3D:candidate gene and SNP selection for association studies[J].BMC Bioinformatics,2006,7(7):166.

[11]Karchin R,Diekhans M,Kelly L,et al.LS-SNP:large-scale annotation of coding non-synonymous SNPs based on multiple information sources[J].Bioinformatics,2005,21(12):2814-2820.

[12]Yeo G,Hoon S,Venkatesh B,et al.Variation in sequence and organization of splicing regulatory elements in vertebrate genes[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2004,101(44):15700-15705.

[13]Fairbrother WG,Yeh RF,Sharp PA,et al.Predictive identification of exonic splicing enhancers in human genes[J].Science,2002,297(5583):1007-1013.

[14]Zhang XH,Kangsamaksin T,Chao MS,et al.Exon inclusion is dependent on predictable exonic splicing enhancers[J].Mol Cell Biol,2005,25(16):7323-7332.

[15]Adzhubei IA,Schmidt S,Peshkin L,et al.A method and server for predicting damaging missense mutations[J].Nat Methods,2010,7(4):248-249.

[16]Sandelin A,Wasserman WW,Lenhard B.ConSite:web-based prediction of regulatory elements using cross-species comparison[J].Nucleic Acids Res,2004,32(Web Server issue):W249-252.

[17]Speir ML,Zweig AS,Rosenbloom KR,et al.The UCSC genome browser database:2016 update[J].Nucleic Acids Res,2016,44(1):D717-725.

[18]Huang HD,Lee TY,Tzeng SW,et al.KinasePhos:a web tool for identifying protein kinase-specific phosphorylation sites[J].Nucleic Acids Res,2005,33(Web Server issue):W226-229.

[19]Gerken TA,Tep C,Rarick J.Role of peptide sequence and neighboring residue glycosylation on the substrate specificity of the uridine 5′-diphosphate-alpha-N-acetylgalactosamine:polypeptide N-acetylgalactosaminyl transferases T1 and T2:kinetic modeling of the porcine and canine sub[J].Biochemistry,2004,43(30):9888-9900.

[20]Monigatti F,Gasteiger E,Bairoch A,et al.The sulfinator:predicting tyrosine sulfation sites in protein sequences[J].Bioinformatics,2002,18(5):769-770.

[21]Sabarinathan R,Tafer H,Seemann SE,et al.The RNAsnp web server:predicting SNP effects on local RNA secondary structure[J].Nucleic Acids Res,2013,41(Web Server issue):W475-479.

[22] Inra JA,Steyerberg EW,Grover S,et al.Racial variation in frequency and phenotypes of APC and MUTYH mutations in 6 169 individuals undergoing genetic testing[J].Genet Med,2015,17(10):815-821.

[23]Supek F,Mi?ana B,Valcárcel J,et al.Synonymous mutations frequently act as driver mutations in human cancers[J].Cell,2014,156(6):1324-1335.

[24]Park SL,Bastani D,Goldstein BY,et al.Associations between NBS1 polymorphisms,haplotypes and smoking-related cancers[J].Carcinogenesis,2010,31(7):1264-1271.

[25]Liang J,Jiang T,Yao RY,et al.The combination of ERCC1 and XRCC1 gene polymorphisms better predicts clinical outcome to oxaliplatin-based chemotherapy in metastatic colorectal cancer[J].Cancer Chemother Pharmacol,2010,66(3):493-500.

[26]Ernst T,Hoffmann J,Erben P,et al.ABL single nucleotide polymorphisms may masquerade as BCR-ABL mutations associated with resistance to tyrosine kinase inhibitors in patients with chronic myeloid leukemia[J].Haematologica,2008,93(9):1389-1393.

[27]Ma F,Sun T,Shi Y,et al.Polymorphisms of EGFR predict clinical outcome in advanced non-small-cell lung cancer patients treated with Gefitinib[J].Lung Cancer,2009,66(1):114-119.

[28]Fung KL,Gottesman MM.A synonymous polymorphism in a common MDR1(ABCB1) haplotype shapes protein function[J].Biochim Biophys Acta,2009,1794(5):860-871.

[29]Liu J,Xing Y,Hinds TR,et al.The third 20 amino acid repeat is the tightest binding site of APC for beta-catenin[J].J Mol Biol,2006,360(1):133-144.

[30]Kawasaki Y,Senda T,Ishidate T,et al.Asef,a link between the tumor suppressor APC and G-protein signaling[J].Science,2000,289(5482):1194-1197.

Study on analysis of synonymous mutation SNPs of APC gene in pathogenesis of familial adenomatous polyposis by bioinformatics technology*

YangJun1,LiuWeiqing2,LiWenliang1,WangZhiqiang1,DongJian2,3△

(1.DepartmentofOncology,FirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650032,China;2.DepartmentofMedicalOncology,FirstAffiliatedHospital,KunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650032,China;3.DepartmentofMedicalOncology,ThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650106,China)

Objective To analyze the synonymous mutation SNP(sSNP) of APC gene in the pathogenesis of familial adenomatous polyposis(FAP) by applying the bioinformatics technology.Methods Five samples of FAP tissue were selected from the Yunan provincial hereditary colorectal cancer tissue samples bank and performed the contrastive analysis of APC gene mutations.The screened sSNP were conducted the bioinformatics prediction,including protein coding,splicing regulation,transcriptional regulation,post-translation regulation and influence on RNA secondary sructure.Results Five sSNPs possibly affecting APC protein were screened out.The bioinformatics prediction prompted that these sSNP affected the exon splicing enhancer(ESE) at mRNA level,thus caused the abnormal shear of APC exon,and then truncated APC protein to result in FAP.The RNA secondary structure analysis found that these sSNP generated the functional impacts on RNA stability and interaction with other RNA or protein.Conclusion Through bioinformatics prediction means,the mutation effect caused by some sSNP in APC gene could explain the etiology of partial APC(-)/ FAP.

genes；adenomatous polyposis coli；genetic diseases,inborn；familial adenomatous polyposis;APC gene;synonymous mutation SNP;bioinformatic tools

?物信息學(xué)·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.02.022

國家自然科學(xué)基金資助項目(81160245)；云南省教育廳科學(xué)研究基金資助項目(2015Y177)。

楊軍(1982-)，副教授，博士，主要從事遺傳性大腸癌發(fā)病機(jī)制方面研究?！?/p>

R735.3+4

A

1671-8348(2017)02-0218-05

2016-07-02

2016-09-30)