人脂肪干細(xì)胞與不同濃度纖維蛋白膠的相容性研究*

陽水發(fā)，易陽艷，黃 艷，吳 舒，王朝慧

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)療美容科，南昌 330000)

人脂肪干細(xì)胞與不同濃度纖維蛋白膠的相容性研究*

陽水發(fā)，易陽艷△，黃 艷，吳 舒，王朝慧

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)療美容科，南昌 330000)

目的 研究人脂肪干細(xì)胞(ASCs)與不同濃度纖維蛋白膠支架的體外生物相容性。方法 獲取人原代ASCs，鑒定后通過CCK-8試驗檢測纖維蛋白膠對ASCs的毒性。通過光鏡直接觀察和活細(xì)胞/死細(xì)胞(DEAD/LIVE)雙標(biāo)染色熒光觀察ASCs分別與100.0、50.0、25.0、12.5mg/mL4組不同濃度纖維蛋白膠支架三維培養(yǎng)后ASCs的生長狀況。結(jié)果CCK-8試驗顯示纖維蛋白膠對ASCs無明顯毒性。通過光鏡直接觀察及DEAD/LIVE雙熒光染色后觀察顯示ASCs與不同濃度纖維蛋白膠復(fù)合后細(xì)胞呈立體三維生長，ASCs增殖速率和健康程度(DEAD/LIVE值)隨纖維蛋白濃度降低而提高，低于25.0mg/mL時細(xì)胞增殖速率和健康程度趨于良好。結(jié)論ASCs與纖維蛋白膠支架具有良好的體外生物相容性，纖維蛋白濃度低于25.0mg/mL為與ASCs三維培養(yǎng)的適宜濃度。

干細(xì)胞；脂肪類；纖維蛋白組織黏著劑；組織工程；支架；組織相容性

臨床上因先天性畸形和獲得性損傷所造成的軟組織缺損的修復(fù)及美容需求的軟組織填充是整形修復(fù)外科常見問題。目前臨床采用注射透明質(zhì)酸或膠原的方法存在填充效果維持時間短的弊端，假體植入存在填充效果不自然等缺點，自體脂肪移植由于缺乏微血管也存在再吸收率高的難題[1-2]。以脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ASCs)為種子細(xì)胞的脂肪組織工程為研究熱點，特別是與可注射型支架材料為載體構(gòu)建的組織工程脂肪具有極大的臨床應(yīng)用價值，有可能為解決這類問題提供優(yōu)良的軟組織填充材料，并且具有可穩(wěn)定存活，有結(jié)構(gòu)和功能雙重修復(fù)作用，不需開放式外科手術(shù)，滿足各種形狀的填充需要等優(yōu)點[3]。纖維蛋白膠由于其良好的可降解性和生物相容性等特性，被嘗試用于包括組織工程等多個領(lǐng)域的研究[4-5]。在已有研究中，ASCs與纖維蛋白膠支架的三維培養(yǎng)模式缺乏直觀的展示，對于ASCs與不同濃度纖維蛋白膠的生物相容性也缺乏研究，而這是纖維蛋白膠作為支架材料用于可注射型脂肪組織工程的重要參數(shù)[6]。因此，本研究將直觀地顯示ASCs復(fù)合纖維蛋白膠后三維培養(yǎng)下細(xì)胞生長狀況，并摸索最適的纖維蛋白膠支架濃度，為以纖維蛋白膠為支架材料的可注射型脂肪組織工程的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織材料 游離脂肪組織取自本科26～32歲健康女性腹部吸脂術(shù)后廢棄的脂肪組織。術(shù)前已與患者談話征得同意，研究經(jīng)由醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑與儀器 低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶、0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)購于美國Gibco公司；Ⅰ型膠原酶、地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、吲哚美辛、油紅O染色劑、纖維蛋白原、凝血酶購于美國Sigma公司；鼠抗人CD34、CD45、CD49d、CD90、CD105、CD106多克隆抗體購于美國eBioscience公司；碘化丙啶(propidium iodide,PI)、鈣黃綠素乙酰氧基甲酯(Calcein-AM)購于美國Invitrogen公司。CKX41型倒置相差顯微鏡、IX3型熒光倒置顯微鏡購于日本Olympus公司；BD FACSCALIBUR流式細(xì)胞儀購于美國BD公司；CO2培養(yǎng)箱、Multiskan Spectrum型多功能酶標(biāo)儀購于美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 ASCs的分離培養(yǎng)與鑒定

1.2.1.1 ASCs的獲取 取成人吸脂術(shù)后的脂肪組織10 mL，加入等體積1.0 mg/mL的Ⅰ型膠原酶溶液混勻后37 ℃恒溫水浴消化40 min，定時搖勻。1 000 r/min離心5 min，去除上層油脂及液體成分，200目濾網(wǎng)過濾。10% FBS低糖DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為(5～10)×105/L,接種至25 cm培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)。48 h后首次換液，之后胰蛋白酶消化傳代。傳至第3代用。

1.2.1.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測ASCs表面抗原 取第3代ASCs,胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加少量磷酸鹽緩沖液(PBS)吹打均勻，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L，將細(xì)胞懸液移入EP管(每管100 μL)，每管分別加入兩種不同熒光素標(biāo)記的流式抗體各5 μL，以同型藻紅蛋白標(biāo)記的免疫球蛋白(PE-IgG)和異硫氰酸熒光素標(biāo)記的免疫球蛋白(FITC-IgG)為陰性對照，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌兩次以去除未結(jié)合的抗體，離心棄上清液后每管加500 μL PBS重懸均勻，上機(jī)行雙熒光標(biāo)記檢測。

1.2.1.3 ASCs的成脂誘導(dǎo)和油紅O染色 取第3代ASCs,胰蛋白酶消化,接種到置有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板上,待細(xì)胞貼壁融合較多時，將培養(yǎng)基更換為成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基[高糖DMEM，10% FBS,1 μmol/L地塞米松,10 μmol/L胰島素,0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)，200 μmol/L吲哚美辛]，陰性對照用10% FBS的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每周換液2～3次。定期觀察細(xì)胞形態(tài)變化，培養(yǎng)2周后取細(xì)胞爬片，PBS清洗后4%多聚甲醛固定5 min，洗滌后加入油紅O工作液染色15 min，PBS洗滌兩次后行顯微鏡觀察。

1.2.2 纖維蛋白膠對ASCs毒性檢測 ASCs消化后用含血清培養(yǎng)基調(diào)整為1×104/mL細(xì)胞懸液，按以下種板方式接種于96孔板中?？瞻字Ъ芙M：用雙聯(lián)注射器各抽取50 μL的纖維蛋白原和凝血酶，注射入孔板底部形成100 μL纖維蛋白膠，不加細(xì)胞懸液。支架復(fù)合細(xì)胞組：同法形成100 μL纖維蛋白膠鋪于板底，成膠后再每孔加入100 μL細(xì)胞懸液。對照組：每孔加入100 μL細(xì)胞懸液。每組5個復(fù)孔，共接種5塊96孔板。分別在1、2、3、5、7 d各取出一板，于支架復(fù)合細(xì)胞組和對照組分別加入CCK-8 10 μL，孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm處光密度(OD)值。實驗組OD值=(支架復(fù)合細(xì)胞組OD值-空白支架組OD值)。將各點OD值用統(tǒng)計學(xué)作圖軟件在坐標(biāo)紙上繪出實驗組和對照組增殖曲線。

1.2.3 ASCs與不同濃度纖維蛋白膠支架復(fù)合后早期存活狀況 將凝血酶用DMEM溶解為500 IU/mL的凝血酶溶液，用該溶液將ASCs制成約1×105/mL懸液。然后將纖維蛋白原分別溶解稀釋為200.0、100.0、50.0、25.0 mg/mL 4組。通過雙聯(lián)注射器各抽取0.2 mL混合ASCs的凝血酶溶液和以上相應(yīng)濃度的纖維蛋白原溶液，分別注入24孔板中，同法種板3塊，纖維蛋白原終濃度被等比稀釋為100.0、50.0、25.0、12.5 mg/mL 4組，待成膠后再各孔加含血清培養(yǎng)基1 mL培養(yǎng)24 h,光鏡下觀察4組中ASCs生長形態(tài)，存活數(shù)量差異，并且每組取3張照片通過兩名實驗者用photoshop點計數(shù)工具進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，通過統(tǒng)計學(xué)作圖軟件制作柱狀圖。

1.2.4 ASCs與不同濃度纖維蛋白膠支架復(fù)合后期生長狀況 將以上纖維蛋白原濃度為100.0、50.0、25.0、12.5 mg/mL的纖維蛋白膠+ASCs復(fù)合物于培養(yǎng)第5天取一塊孔板，用PBS洗滌兩遍，按說明書往孔板中加入含1/10體積2、4 μmol/L的Calcein-AM和PI的細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37 ℃孵箱孵育15 min，再用PBS洗滌兩遍。在熒光顯微鏡下，先使用490 nm激發(fā)波長觀察綠色的活細(xì)胞，然后用545 nm激發(fā)波長觀察紅色的死細(xì)胞。觀察各組細(xì)胞形態(tài)特征、活細(xì)胞/死細(xì)胞(DEAD/LIVE)數(shù)量。每組選取3個視野下拍攝的綠色熒光和紅色熒光圖片通過兩名實驗者用photoshop點計數(shù)工具進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，通過統(tǒng)計學(xué)作圖軟件制作柱狀圖。

2 結(jié) 果

2.1ASCs光鏡下形態(tài)學(xué)觀察 第3代ASCs為典型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，呈細(xì)長梭形，有粗大的分支，核仁明顯，細(xì)胞骨架伸展較大，細(xì)胞生長密集時呈現(xiàn)漩渦性，見圖1。

A:100倍;B:200倍。

圖1 第3代ASCs蘇木素-伊紅染色觀察

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測ASCs表面抗原表達(dá)結(jié)果 選取的第3代ASCs經(jīng)6種流式抗體結(jié)合后上機(jī)檢測，結(jié)果顯示ASCs高表達(dá)CD49d(94.8%)，CD90(99.8%)，CD105(99.8%)，不表達(dá)或極低表達(dá)CD34(3.1%)，CD45(2.9%)，CD106(1.3%)，見圖2。

圖2 第3代ASCs流式細(xì)胞術(shù)檢測表面抗原

2.3ASCs的成脂誘導(dǎo)和油紅O染色結(jié)果ASCs在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)兩周后脂滴形成較多，融合為較大脂滴，經(jīng)油紅O染色后可見脂滴被染成紅色，見圖3。

A:染色前；B:染色后。

圖3ASCs成脂誘導(dǎo)2周油紅O染色(倒置相差顯微鏡，×200)

2.4 纖維蛋白膠對ASCs增殖的影響檢測結(jié)果 通過CCK-8檢測實驗組和對照組1、2、3、5、7dA值，間接反映兩組細(xì)胞增殖情況，在坐標(biāo)上繪成曲線，各時間點實驗組和對照組組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.113、0.264、0.436、0.605、0.468)，顯示纖維蛋白膠對ASCs增殖無明顯毒害影響，見圖4。

圖4 CCK-8檢測實驗組和對照組ASCs增殖曲線

2.5ASCs與不同濃度的纖維蛋白膠支架復(fù)合后早期存活狀況 復(fù)合培養(yǎng)24h顯示細(xì)胞伸展受到一定限制，細(xì)胞變成細(xì)長，呈三維立體生長，并可見部分未伸展出來的死細(xì)胞。組間可見明顯差異，100.0、50.0mg/mL組中細(xì)胞形態(tài)極度變形，細(xì)胞伸展程度較小，并且活細(xì)胞數(shù)明顯偏少，25.0、12.5mg/mL組細(xì)胞形態(tài)較為飽滿規(guī)則，細(xì)胞伸出多個突起，細(xì)胞存活數(shù)明顯增多。細(xì)胞計數(shù)顯示隨支架濃度降低ASCs存活率增高，25.0、12.5mg/mL組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.956)，存活率趨于穩(wěn)定，濃度低于25.0mg/mL時ASCs存活良好，為適宜濃度，見圖5。

A：不同濃度的細(xì)胞支架復(fù)合物培養(yǎng)第24小時光鏡觀察(倒置相差顯微鏡，×100)；B:點計數(shù)各組中ASCs細(xì)胞數(shù)。

圖5ASCs與不同濃度的纖維蛋白膠復(fù)合后早期存活情況

2.6ASCs與不同濃度的纖維蛋白膠復(fù)合后期生長狀況 以上支架細(xì)胞復(fù)合物培養(yǎng)第5天，DEAD/LIVE試劑盒染色后可清晰地觀察到人ASCs在支架材料內(nèi)的形態(tài)特征和生長狀況。可見ASCs在支架材料中保持大致梭形外形，細(xì)胞突起明顯較前增多。綠色熒光圖片顯示隨著支架濃度的減低，細(xì)胞形態(tài)趨于正常培養(yǎng)形態(tài)，生長數(shù)量明顯增多；紅色熒光圖片顯示細(xì)胞凋亡隨著支架濃度的減低逐漸減少。細(xì)胞點計數(shù)顯示隨纖維蛋白膠支架濃度降低，ASCs增殖速率明顯增高，細(xì)胞健康程度(DEAD/LIVE)明顯提高，25.0、12.5mg/mL兩組間活細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.424)，濃度低于25.0mg/mL時ASCs增殖速率和健康程度良好，為適宜濃度，見圖6。

A：不同濃度的細(xì)胞支架復(fù)合物培養(yǎng)第5天DEAD/LIVE試劑盒染色觀察(熒光倒置顯微鏡，×100)；B:點計數(shù)DEAD/LIVE雙染后各組細(xì)胞數(shù)。

圖6ASCs與不同濃度的纖維蛋白膠復(fù)合后期生長情況

3 討 論

脂肪組織工程的構(gòu)建需要有合適的種子細(xì)胞，研究已經(jīng)證實脂肪組織中含有大量ASCs[7-9]。由于脂肪組織量大，由此推測其可能是人體中最大的成體干細(xì)胞庫。

研究顯示擴(kuò)增的ASCs表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記物如CD90、CD105，表達(dá)黏附分子CD49d；缺乏造血系統(tǒng)標(biāo)記物CD34、CD45，缺乏內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31及免疫抗原標(biāo)記組織相溶性抗原-DR(HLA-DR)，缺乏血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子CD106[10-13]，并且具有多向分化潛能[14-15]。本研究中獲取的ASCs綜合形態(tài)學(xué)特征、表面抗原標(biāo)記和分化能力，符合ASCs的多種特性。

纖維蛋白膠為從血漿中制備的纖維蛋白原和凝血酶混合后模擬凝血反應(yīng)最后通路聚合而成的纖維蛋白水凝膠。由于纖維蛋白膠具有良好的生物相容性和生物降解性，已經(jīng)作為生物支架用于平滑肌、骨、軟骨組織工程研究中[16-17]。另外，研究也顯示纖維蛋白膠可以明顯提高移植脂肪存活率和微血管化[18-19]。其次，交聯(lián)的纖維蛋白可以支撐起細(xì)胞生長的立體的物理空間，使得細(xì)胞在其內(nèi)呈現(xiàn)類似于體內(nèi)生長時的三維生長模式?，F(xiàn)有的研究已經(jīng)表面，二維培養(yǎng)時細(xì)胞的黏附、增殖、基因表達(dá)均不同于立體三維培養(yǎng)[20-21]，細(xì)胞處于三維培養(yǎng)將更接近細(xì)胞在體內(nèi)的生長環(huán)境[22]。這些構(gòu)成了纖維蛋白膠作為組織工程支架的理論基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示纖維蛋白膠對于二維培養(yǎng)下的ASCs的增殖沒有明顯影響，提示纖維蛋白膠對于二維培養(yǎng)的ASCs不產(chǎn)生直接的毒性作用，顯示了與ASCs良好的生物相容性。將ASCs與纖維蛋白膠支架復(fù)合后三維培養(yǎng)，可見ASCs在纖維蛋白膠支架內(nèi)沿著三維凝膠支架各個方向伸展。由于調(diào)節(jié)纖維蛋白聚合的濃度即可以產(chǎn)生不同的力學(xué)強(qiáng)度和纖維排列，因而不同濃度的纖維蛋白膠支架對于ASCs的三維生長具有重要影響，本研究結(jié)果也證實了這種顯著差異。復(fù)合24h后光鏡下觀察顯示100.0mg/mL、50.0mg/mL組中提示過高的濃度會使得細(xì)胞處于過大的力學(xué)壓迫，限制了細(xì)胞生長空間，也使得細(xì)胞獲取營養(yǎng)更加困難，造成了ASCs早期的大量死亡。25mg/mL、12.5mg/mL組細(xì)胞形態(tài)較為飽滿規(guī)則，細(xì)胞伸出多個突起，細(xì)胞存活明顯增多。早期總體表現(xiàn)為隨支架濃度降低細(xì)胞存活增加，纖維蛋白濃度低于25.0mg/mL時ASCs存活良好，為適宜濃度。

DEAD/LIVE試劑盒是通過Calcein-AM和PI分別將活細(xì)胞胞質(zhì)和死細(xì)胞核染成綠、紅色，可進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記，也用于檢測細(xì)胞存活率[23]。以上支架細(xì)胞復(fù)合物培養(yǎng)后期(第5天)，DEAD/LIVE試劑盒染色后清晰地觀察到ASCs在支架材料內(nèi)的形態(tài)特征和生長狀況。黃綠色熒光圖片中顯示隨著支架濃度的減低，細(xì)胞增殖速率明顯增高，細(xì)胞形態(tài)更符合正常培養(yǎng)形態(tài)；同一視野下紅色熒光圖片顯示細(xì)胞凋亡數(shù)隨著支架濃度的減低逐漸減少，顯示細(xì)胞健康程度(LIVE/DEAD)明顯升高。25.0、12.5mg/mL兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，細(xì)胞生長趨于相似，亦提示纖維蛋白濃度低于25.0mg/mL時ASCs的增殖速率及健康程度均較為良好。

本研究結(jié)果顯示ASCs與纖維蛋白膠具有良好的生物相容性，纖維蛋白膠支架可能作為脂肪組織工程優(yōu)良的可注射型三維支架材料；不同濃度的纖維蛋白膠支架對于ASCs的生長影響具有顯著差異，支架中纖維蛋白濃度低于25mg/mL為適宜濃度，由此為后續(xù)進(jìn)行以纖維蛋白膠作為支架材料的脂肪組織工程研究提供了重要參數(shù)指導(dǎo)。

[1]ChangQ,LuF.Anovelstrategyforcreatingalargeamountofengineeredfattissuewithanaxialvascularpedicleandaprefabricatedscaffold[J].MedHypotheses,2012,79(2):267-270.

[2]TanziMC,FarèS.Adiposetissueengineering:stateoftheart,recentadvancesandinnovativeapproaches[J].ExpertRevMedDevices,2009,6(5):533-551.

[3]陽水發(fā)，易陽艷．脂肪干細(xì)胞構(gòu)建可注射型組織工程脂肪的研究進(jìn)展[J]．中國修復(fù)重建外科雜志，2015，29(2)：245-249．

[4]MurphyKC,FangSY,LeachJK.Humanmesenchymalstemcellspheroidsinfibrinhydrogelsexhibitimprovedcellsurvivalandpotentialforbonehealing[J].CellTissueRes,2014,357(1):91-99.

[5]CatelasI,SeseN,WuBM,etal.Humanmesenchymalstemcellproliferationandosteogenicdifferentiationinfibringelsinvitro[J].TissueEng,2006,12(8):2385-2396.

[6]張云松，高建華，魯峰，等．人脂肪來源干細(xì)胞復(fù)合纖維蛋白膠構(gòu)建可注射型工程化脂肪組織的實驗研究[J]．中華醫(yī)學(xué)雜志，2008，88(38)：2705-2709．

[7]ZukPA,ZhuM,MizunoH,etal.Multilineagecellsfromhumanadiposetissue:implicationsforcell-basedtherapies[J].TissueEng,2001,7(2):211-228.

[8]MizunoH,TobitaM,UysalAC.Concisereview:adipose-derivedstemcellsasanoveltoolforfutureregenerativemedicine[J].StemCells,2012,30(5):804-810.

[9]StremBM,ZhuM,AlfonsoZ,etal.Expressionofcardiomyocyticmarkersonadiposetissue-derivedcellsinamurinemodelofacutemyocardialinjury[J].Cytotherapy,2005,7(3):282-291.

[10]TahaMF,HedayatiV.Isolation,identificationandmultipotentialdifferentiationofmouseadiposetissue-derivedstemcells[J].TissueCell,2010,42(4):211-216.

[11]BianchiF,MaioliM,LeonardiE,etal.Anewnonenzymaticmethodanddevicetoobtainafattissuederivativehighlyenrichedinpericyte-likeelementsbymildmechanicalforcesfromhumanlipoaspirates[J].CellTransplant,2013,22(11):2063-2077.

[12]KoMS,JungJY,ShinIS,etal.Effectsofexpandedhumanadiposetissue-derivedmesenchymalstemcellsontheviabilityofcryopreservedfatgraftsinthenudemouse[J].IntJMedSci,2011,8(3):231-238.

[13]MiranvilleA,HeeschenC,SengenèsC,etal.Improvementofpostnatalneovascularizationbyhumanadiposetissue-derivedstemcells[J].Circulation,2004,110(3):349-355.

[14]楊平，尹爍，崔磊，等．脂肪干細(xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)的實驗研究[J]．中國修復(fù)重建外科雜志，2008，22(4)：481-486．

[15]ChoiYS,MatsudaK,DustingGJ,etal.Engineeringcardiactissueinvivofromhumanadipose-derivedstemcells[J].Biomaterials,2010,31(8):2236-2242.

[16]IkariY,FujikawaK,YeeKO,etal.Alpha(1)-proteinaseinhibitor,alpha(1)-antichymotrypsin,oralpha(2)-macroglobulinisrequiredforvascularsmoothmusclecellspreadinginthree-dimensionalfibringel[J].JBiolChem,2000,275(17):12799-12805.

[17]MeinhartJ,FusseneggerM,H?blingW.Stabilizationoffibrin-chondrocyteconstructsforcartilageReconstruction[J].AnnPlastSurg,1999,42(6):673-678.

[18]Kara?alN,CobanogluU,AmbarciogluO,etal.Theeffectoffibringlueonfatgraftsurvival[J].JPlastReconstrAesthetSurg,2007,60(3):300-303.

[19]BeckerJC,DomschkeW,PohleT.Biologicalinvitroeffectsoffibringlue:fibroblastproliferation,expressionandbindingofgrowthfactors[J].ScandJGastroenterol,2004,39(10):927-932.

[20]NelsonWJ.Adaptationofcoremechanismstogeneratecellpolarity[J].Nature,2003,422(6933):766-774.

[21]TibbittMW,AnsethKS.Hydrogelsasextracellularmatrixmimicsfor3Dcellculture[J].BiotechnolBioeng,2009,103(4):655-663.

[22]KraehenbuehlTP,LangerR,FerreiraLS.Three-dimensionalbiomaterialsforthestudyofhumanpluripotentstemcells[J].NatMethods,2011,8(9):731-736.

[23]ZhouS,CuiZ,UrbanJ.Deadcellcountsduringserumcultivationareunderestimatedbythefluorescentlive/deadassay[J].BiotechnolJ,2011,6(5):513-518.

Compatibility between human adipose derived stem cells and different concentrations of fibrin gel*

YangShuifa,YiYangyan△,HuangYan,WuShu,WangZhaohui

(DepartmentofPlasticSurgery,SecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330000,China)

Objective To research the in vitro compatibility between adipose-derived stem cells (ASCs) and fibrin gel scaffold.Methods The human primary ASCs were obtained and identified.The toxicity of fibrin gel on ASCs was detected by CCK-8 test.The light microscopy and DEAD/LIVE double labelled staining fluorescence were used to observe the ASCs growth situation after three dimensional culture of ASCs with 4 concentrations of 100.0,50.0,25.0,12.5 mg/mL fibrin gel scaffold.Results The CCK-8 test showed no significant toxicity of fibrin gel on ASCs.The light microscopy and DEAD/LIVE double labelled staining fluorescence direct observation revealed that ASCs showed a stereo three-dimensional cell growth pattern after cultivation with fibrin gel scaffold,the ASCs proliferation rate and health degree(DEAD/LIVE value) were elevated with the fibrin concentration decrease,in the fibrin concentration less than 25 mg/mL,the cellular proliferation rate and health degree tended to be better.Conclusion ASCs and fibrin gel scaffold have favorable in vitro biocompatibility,and the fibrin gel concentration which is less than 25.0 mg/mL is appropriate for ASCs three-dimensional culture.

stem cells；fats；fibrin tissue adhesive；tissue engineering;scaffold;histocompatibility

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.02.006

江西省科技支撐計劃(2010BSA15100,2010BSB00201)；江西省自然科學(xué)基金(20151BAB205034)。

陽水發(fā)(1989-)，在讀碩士，主要從事組織工程和脂肪移植方面研究?！?/p>

E-mail:yyy0218@126.com。

R

A

1671-8348(2017)02-0165-04

2016-06-18

2016-09-26)