妊娠早期復發(fā)性流產患者妊娠組織增殖與凋亡的研究

孫 莉，陳 琳,馬繼紅

妊娠早期復發(fā)性流產患者妊娠組織增殖與凋亡的研究

孫 莉，陳 琳,馬繼紅

目的 分析妊娠早期復發(fā)性流產(recurrent spontaneous abortions, RSA)患者妊娠組織(絨毛滋養(yǎng)細胞及蛻膜細胞)增殖與凋亡的情況，并探討其可能致病機制。方法 選取我院2014年1月—2015年12月婦產科收治的妊娠12周內的RSA患者60例(RSA組)，藥物流產者60例(藥物流產組)，人工流產者60例(人工流產組)。采用DNA缺口原位末端標記技術檢測3組胎盤絨毛組織和蛻膜組織細胞凋亡情況，采用免疫組織化學染色法檢測3組胎盤絨毛和蛻膜組織中胎盤生長因子(placenta growth factor， PLGF)和凋亡相關因子Caspase-3的表達水平，并進一步分析RSA組中二者表達的相關性。結果 RSA組胎盤絨毛及蛻膜組織凋亡指數(apoptotic index, AI)均明顯高于藥物流產組和人工流產組，差異均有統計學意義(P均<0.01)。RSA組胎盤絨毛組織和蛻膜組織中PLGF表達水平均顯著低于藥物流產組和人工流產組(P<0.01)，Caspase-3表達水平均顯著高于藥物流產組和人工流產組(P<0.05)。相關性分析顯示，RSA組胎盤絨毛及蛻膜組織中Caspase-3與PLGF的表達呈負相關(r=-0.891,P=0.004;r=-0.927，P=0.001)。結論 妊娠早期RSA的發(fā)生可能與絨毛組織和蛻膜組織中，PLGF的表達不足導致絨毛及蛻膜細胞增殖障礙，以及Caspase-3表達增加導致絨毛及蛻膜細胞過度凋亡有關。

流產,習慣性；妊娠初期；絨毛；蛻膜；細胞增殖；細胞凋亡

復發(fā)性流產(recurrent spontaneous abortions, RSA)是指與同一性伴侶發(fā)生2次及其以上的自然流產[1-4]，其中早期流產占80%以上。導致RSA的原因除常見的遺傳、內分泌失調、生殖道解剖異常、免疫功能異常、血栓前狀態(tài)、感染及環(huán)境因素外[5]，仍有40%～60%的RSA原因不明[6]，故對妊娠早期RSA的發(fā)病機制進行探討有著重要的臨床意義。近年研究發(fā)現，胎盤組織凋亡和增殖的平衡狀態(tài)對維持正常妊娠至關重要，胎盤絨毛滋養(yǎng)細胞和蛻膜組織中凋亡增多及增殖不足均可導致病理性妊娠甚至自然流產的發(fā)生[7-8]。血管生成是創(chuàng)傷愈合、腫瘤生長和轉移等多種生理和病理現象均會涉及的重要過程[9]。胎盤生長因子(placenta growth factor， PLGF)主要由滋養(yǎng)細胞分泌，是血管生長因子及抗血管生成因子的重要代表物質[10-13]。細胞凋亡是正常體細胞維持穩(wěn)定的自我保護機制，Caspase-3是凋亡級聯反應過程中的一種活化酶，在細胞凋亡中起著重要作用。本研究通過免疫組織化學染色(組化)檢測妊娠早期RSA患者胎盤絨毛及蛻膜細胞中PLGF與Caspase-3的表達水平，以探討妊娠早期RSA患者胎盤絨毛及蛻膜細胞增殖及凋亡的關系。

1 資料與方法

1.1 納入及排除標準 ①納入標準：年齡在15～40歲，符合美國婦產科協會2010年關于RSA的診斷標準；未接受其他治療；臨床資料完整。②排除標準：合并子宮肌瘤及其他腫瘤疾??；合并嚴重呼吸、循環(huán)系統疾病[14]?；颊呔栽竻⒓硬⒑炇鹬橥鈺?，且本研究經醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核同意。

1.2 對象與分組 隨機選取我院婦產科2014年1月—2015年12月收治并確診的妊娠12周內RSA患者60例(RSA組)，藥物流產者60例(藥物流產組)，人工流產者60例(人工流產組)作為研究對象。3組基線資料比較差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 3組流產患者一般資料比較±s)

1.3 研究方法 收集所有患者胎盤絨毛及蛻膜組織，將獲得的組織用無菌0.9%氯化鈉注射液沖洗，除去血凝塊后用10%甲醛固定。常規(guī)脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片，片厚4 μm，常規(guī)HE染色，觀察絨毛和蛻膜形態(tài)。將載玻片置于濃度為0.2%～0.5%的洗潔精中浸泡1 h后，沖洗風干。

采用末端脫氧核糖核酸轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL法)對絨毛及蛻膜組織中細胞凋亡情況進行檢測，并設定陽性和陰性對照。試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，操作按試劑盒說明書進行。光鏡下見細胞核有棕黃色顆粒計為陽性，即為凋亡細胞。每張切片隨機選取不重疊的5個高倍視野(200倍)計算凋亡指數(apoptotic index, AI)，AI=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

采用免疫組化SP法檢測胎盤絨毛及蛻膜組織中Caspase-3和PLGF含量[15]。Caspase-3兔抗人多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司，PLGF兔抗人多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司。按常規(guī)程序操作，一抗工作液濃度Caspase-3為1︰200，PLGF為1︰100，DAB顯色。陰性對照采用磷酸鹽緩沖液代替一抗。Caspase-3陽性表達為細胞質和細胞核中有黃色顆粒，PLGF陽性表達為胞質中有棕黃色顆粒，每張切片隨機選取5個不重疊的高倍視野(200倍)，用Motic Med數碼醫(yī)學影像軟件測定每個視野陽性染色部位的平均光密度值，代表絨毛及蛻膜組織中PLGF、Caspase-3表達水平，光密度值越大表示其表達越強[16]。

1.4 觀察指標 比較3組患者胎盤絨毛及蛻膜組織AI值和PLGF、Caspase-3的表達水平，并進一步分析RSA患者中PLGF與Caspase-3表達的相關性。

2 結果

2.1 AI值比較 TUNEL檢測顯示，RSA組胎盤絨毛及蛻膜組織AI值均明顯高于藥物流產組和人工流產組，差異均有統計學意義(P均<0.01)；藥物流產組和人工流產組胎盤絨毛及蛻膜組織AI值比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組流產患者胎盤絨毛 及蛻膜組織凋亡指數比較±s，%)

注：RSA組比較，bP<0.01

2.2 PLGF表達 PLGF主要表達于合體滋養(yǎng)細胞和蛻膜細胞的胞質內。RSA組胎盤絨毛組織和蛻膜組織中PLGF表達水平均顯著低于藥物流產組和人工流產組(P<0.01)；藥物流產組和人工流產組胎盤絨毛組織和蛻膜組織中PLGF表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

2.3 Caspase-3表達 Caspase-3主要表達于合體滋養(yǎng)細胞的胞質和蛻膜細胞的胞核及胞質中。RSA組胎盤絨毛組織和蛻膜組織中Caspase-3表達水平均顯著高于藥物流產組和人工流產組(P<0.05)；藥物流產組和人工流產組胎盤絨毛組織和蛻膜組織中Caspase-3表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表3 3組流產患者胎盤絨毛組織 和蛻膜組織中PLGF表達水平比較

注：與RSA組比較，bP<0.01

表4 3組流產患者胎盤絨毛組織 和蛻膜組織中Caspase-3表達水平比較

注：與RSA組比較，aP<0.05

2.4 相關性分析 RSA組胎盤絨毛組織和蛻膜組織中Caspase-3與PLGF的表達呈負相關(r=-0.891,P=0.004;r=-0.927，P=0.001)。

3 討論

近年來，隨著分子生物學關于細胞增殖與凋亡機制研究的深入，發(fā)現細胞的增殖和凋亡決定著組織細胞的數量。在妊娠生理過程中妊娠組織凋亡和增殖的平衡至關重要，妊娠組織凋亡或增殖異常會影響胎盤生長、成熟及功能，引起病理性妊娠甚至自然流產的發(fā)生[17]。有研究發(fā)現，RSA患者絨毛組織中可見特征性的細胞凋亡，且較正常妊娠患者絨毛組織中顯著增加，說明滋養(yǎng)細胞過度凋亡可能是RSA發(fā)病原因之一[18]。目前在細胞凋亡研究中廣泛采用TUNEL染色法，其可對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，準確反映細胞凋亡最典型的生物化學和形態(tài)特征，并可檢測出極少量的凋亡細胞。本研究即采用TUNEL染色法檢測妊娠組織的凋亡情況。

Caspase家族是一系列含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，在細胞凋亡中起著重要作用。Caspase-3處于Caspase凋亡傳導通路的下游，其高表達可啟動線粒體/細胞色素c及Fas介導的凋亡通路，一旦活化將促使胎盤絨毛細胞大量凋亡，阻礙孕卵的發(fā)育，流產將不可避免[19]。血管發(fā)生和血管化是妊娠早期胚胎發(fā)育和胎盤形成的基礎，此過程主要由血管生成因子調控。血管生成因子調節(jié)異常會影響胚泡發(fā)育、受精卵著床、滋養(yǎng)細胞侵入、胎盤血管生成及網絡構建等一系列妊娠生理過程[20-21]。PLGF屬血管內皮生長因子家族成員，作為參與血管發(fā)生和血管通透性調節(jié)的重要因子，其參與生殖過程各階段，具有誘導內皮細胞增殖、抗內皮細胞凋亡、增加血管通透性、促進滋養(yǎng)細胞增殖與分化等多種生物學作用[22]。有研究顯示，PLGF可促進絨毛外滋養(yǎng)細胞的浸潤活性及胎盤血管網絡形成，有助于正常胎盤的形成，并維持妊娠生理過程[23]。

本研究結果顯示，RSA組胎盤絨毛組織及蛻膜組織中Caspase-3水平顯著高于藥物流產組和人工流產組，提示Caspase-3可能與RSA的發(fā)生有關。因為Caspase-3是細胞凋亡過程中的關鍵“誘導者”和“執(zhí)行者”，其高表達可使大量細胞凋亡，阻礙絨毛生長，極有可能是導致自然流產的重要原因之一。本研究結果還顯示，RSA組胎盤絨毛組織及蛻膜組織中PLGF表達水平顯著低于其他兩組，提示PLGF可能與RSA的發(fā)生有關，其在胎盤組織中的異常表達可能參與了早期胚胎停育的發(fā)生。本研究相關性分析顯示，RSA組胎盤絨毛組織及蛻膜組織中Caspase-3與PLGF的表達呈負相關，提示凋亡因子與PLGF兩因素間存在潛在相互作用。

綜上所述，RSA的發(fā)生可能與Caspase-3表達增加導致胎盤絨毛及蛻膜細胞過度凋亡，以及PLGF表達不足導致胎盤絨毛及蛻膜細胞增殖障礙有關，兩因素綜合作用使得維持絨毛正常發(fā)育的平衡狀態(tài)遭受破壞。本研究因病例采集范圍及時間有限，病例數較少，有待進一步大樣本的深入研究。

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A Study on Proliferation and Apoptosis of Pregnancy Tissues in Early Recurrent Spontaneous Abortion Patients

SUN Li， CHEN Lin， MA Ji-hong

(Department of Gynecology and Obstetrics, Bethune International Peace Hospital of PLA， Shijiazhuang 050082， China)

Objective To analyze proliferation and apoptosis conditions of pregnancy tissues (villi nutrient and decidua cells) in early recurrent spontaneous abortion (RSA) patients and to investigate the possible pathogenic mechanisms. Methods A total of 60 early RSA patients within 12 weeks of pregnancy (group A), medical abortion of 60 patients (group B) and 60 patients with induced abortion (group C) during January 2014 and December 2015 were recruited in this study. In three groups, apoptosis conditions of villi nutrient cells and decidual cells were detected by using DNA in situ end labeling method, and then expressions of placenta growth factor (PLGF) and apoptosis related factors Caspase-3 were detected by using immunohistochemical staining method. The correlation between PLGF and Caspase-3 expressions was analyzed in group A. Results In group A, values of apoptosis index (AI) of villi and decidual cells were significantly higher (P<0.01); expressions of Caspase 3 and PLGF were significant lower (P<0.01), and Caspase-3 expressions in villi and decidua cells were significantly higher than those in group B and C (P<0.05). Correlation analysis showed that Caspase-3 and PLGF expressions were negative correlation in group A (r=-0.891,P=0.004;r=-0.927,P=0.001). Conclusion The pathogenesy of early RSA may be related to proliferation disorder of villi and decidua cells induced by PLGF poor expression and excessive apoptosis of villi and decidua cells induced by increasing Caspase-3 expression.

Abortion, habitual; Pregnancy trimester, first； Villi； Decidua; Cell proliferation; Apoptosis

河北省計劃生育委員會2011年科研計劃課題(2011-A21)

050082 石家莊,解放軍白求恩國際和平醫(yī)院產科

R714.21

A

1002-3429(2017)01-0094-04

10.3969/j.issn.1002-3429.2017.01.031

2016-08-20 修回時間：2016-10-30)