益氣化瘀解毒方治療內(nèi)毒素致ARDS大鼠的炎癥作用研究

黃瑞音 李雁 李昕 王謙 駱長永 程淼 萬茂婷 劉麗杰 吳元德 王欣

·論著·

益氣化瘀解毒方治療內(nèi)毒素致ARDS大鼠的炎癥作用研究

黃瑞音 李雁 李昕 王謙 駱長永 程淼 萬茂婷 劉麗杰 吳元德 王欣

目的 探討益氣化瘀解毒方(以下簡稱“復(fù)方”)對內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)誘發(fā)大鼠急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)的保護作用及對炎癥因子的影響。方法50只雄性健康SD大鼠隨機等分為5組，每組10只。5組大鼠按動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。中藥低、中、高劑量組，分別給予復(fù)方低、中、高劑量灌胃，每天1次，模型組及空白對照組每天予蒸餾水灌胃，每天灌胃量為1 mL/100 g，除空白對照組外其余4組7天后尾靜脈注射LPS(2 mg/kg)造模，空白對照組及造模4組16小時麻醉下處死。取肺組織及腹主動脈血，進行大鼠肺大體病理、病理組織光鏡觀察，并檢測血清中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白細胞介素1β( interleukin 1beta，IL-1β)、IL-6及肺組織中p65蛋白含量。結(jié)果與空白對照組比較，模型組TNF-α升高(P<0.05)。與模型組比較，低劑量組大鼠血清中TNF-α無明顯降低(P>0.05)，中藥中、高劑量TNF-α水平顯著降低(P<0.05)，但高、中劑量組之間無明顯差距(P>0.05)。與空白對照組比較，模型組IL-1β升高(P<0.05)；與模型組比較，低劑量組IL-1β降低(P<0.05)，中與高劑量組IL-1β水平明顯降低(P<0.05)。與空白對照組比較，模型組IL-6升高(P<0.05)；與模型組比較，低劑量組IL-6明顯降低(P<0.05)，中劑量組IL-6水平顯著降低(P<0.05)，高劑量組IL-6水平明顯降低(P<0.05)。與空白對照組比較，模型組p65升高(P<0.05)；與模型組比較，低劑量組p65明顯降低(P<0.05)，中劑量組p65水平顯著降低(P<0.05)，中藥高劑量組p65水平降低(P<0.05)。結(jié)論益氣化瘀解毒復(fù)方能夠減輕內(nèi)毒素致ARDS大鼠肺組織損傷，具有一定的預(yù)防保護作用，可能與降低大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平，抑制NF-κB通路激活，減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。在一定范圍內(nèi)，提高復(fù)方的給藥劑量，可以增強作用效果。

急性呼吸窘迫綜合征； 炎癥； 益氣化瘀解毒

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是臨床常見的急危重癥之一，發(fā)病機制復(fù)雜，治療效果不佳，是世界性的公共衛(wèi)生難題，其死亡率高達32%～55%[1]。臨床上主要采用呼吸支持療法，復(fù)張塌陷的肺泡，緩解呼吸窘迫，改善全身缺氧情況。在藥物治療方面，一般采用糖皮質(zhì)激素、一氧化氮吸入、肺表面活性物質(zhì)及對癥治療，但均無可靠的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。而中醫(yī)藥幾千年來的發(fā)展中，留下浩繁的文獻，其中記載的暴喘、喘證、肺衰等與本病密切相關(guān)。越來越多的中醫(yī)學(xué)者開始將傳統(tǒng)的中醫(yī)理論與現(xiàn)代研究方法相結(jié)合，對本病進行研究，并取得一定進展。本研究采用北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院杜懷棠教授經(jīng)驗方益氣化瘀解毒方(以下簡稱“復(fù)方”)，干預(yù)內(nèi)毒素致ARDS大鼠動物模型，探討復(fù)方對ARDS大鼠的的預(yù)防效果及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

健康雄性SD大鼠50只，8周齡，體質(zhì)量(200±10) g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號為SCXK(京)2012-0001。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院實驗動物中心屏障實驗室，溫度22～24℃，濕度50%～70%，普通顆粒飲食，分籠飼養(yǎng)，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實驗。全部動物實驗得到北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院實驗動物福利與倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號：14- 47。

1.2 儀器及試劑

HC·TP11B·10架盤藥物天平(北京醫(yī)用天平廠)；SC-3612低速離心機(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；BH2生物顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；分光光度計尤尼柯(上海)儀器有限公司；紫外分析儀北京尚柏生物公司。

1.3 藥品與試劑

內(nèi)毒素(li popolysaccharide,LPS)(Escherichia coli，美國Sigma公司產(chǎn)品，批號L2880，100 mg)；復(fù)方藥物組成：黃芪30 g、三七10 g、赤芍15 g、炒枳實12 g、金銀花15 g，均購于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中藥房，中藥顆粒為首創(chuàng)藥業(yè)集團提供；白細胞介素-1β(interlenkin 1 beta,IL-1β) ELISA試劑盒(批號：A102453)、IL-6 ELISA試劑盒(批號：A106893)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、ELISA試劑盒(批號：A106897)均購于艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司；肺組織病理HE染色切片由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院病理室制作。

1.4 動物分組及造模

按隨機數(shù)字表法將50只動物分為5組(n=10)，即空白對照組、模型組，中藥低、中、高劑量組，分別稱重并記錄。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始灌胃給藥，低劑量組即6.1 g/(kg·d)(給藥劑量為生藥劑量)；中劑量組即12.2 g/(kg·d)(給藥劑量為生藥劑量)；高劑量組即24.4 g/(kg·d)(給藥劑量為生藥劑量)?？瞻捉M和模型組均灌服等量蒸餾水，每天灌胃量為1 mL/100 g。每天1次，連續(xù)7天。以上藥物均由蒸餾水配制，存放于4 ℃冰箱中。第7天灌胃后6小時，大鼠不禁食不禁水，中藥低、中、高劑量組、模型組一次性尾靜脈注射內(nèi)毒素LPS溶液(2 mg/kg)，空白對照組不予LPS，16小時后5組全部麻醉后處死。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 肺大體病理觀察 充分暴露胸腔，摘取完整左肺，以10%多聚甲醛固定，肉眼觀察肺臟的病理變化，包括瘀血程度、腫大程度、被膜色澤等。

1.5.2 肺組織鏡下病理學(xué)觀察 充分暴露胸腔，摘取全肺，分離右下肺，以10%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片和HE染色，制作HE染色病理切片。分離右中肺，以液氮固定保存。肺組織病理HE染色切片由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院病理室制作。在光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠肺泡間隔變化、炎癥細胞浸潤程度、肺毛細血管充血水腫狀況等組織形態(tài)學(xué)變化。

1.5.3 酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平 10%水合氯醛溶液(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，打開腹腔，暴露腹主動脈，取腹主動脈血4 mL，立即沿管壁注入肝素化的試管中，經(jīng)3000 rpm低溫離心20分鐘后，取血清置于-80℃冰箱中保存。往預(yù)先包被IL-1β、IL-6、TNF-α抗體的包被微孔中，分別依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度(optical density，OD)，分別計算樣品濃度。

1.5.4 免疫印跡實驗法(western blot)檢測肺組織中p65水平 按試劑盒說明書操作，采用Quantity One軟件進行圖像灰度分析，計算p65的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般情況

空白對照組大鼠精神狀態(tài)良好，活動敏捷，反應(yīng)迅速，毛發(fā)光亮柔順。模型組大鼠精神狀態(tài)差，活動較少，反應(yīng)較遲鈍，喜臥，毛色晦暗、枯黃、光澤度較差，口唇爪甲紫紺，排泄稀溏便。治療組大鼠均有類似模型組的的表現(xiàn)，但程度相對較輕。

2.2 肺組織大體觀察結(jié)果

空白對照組大鼠肺組織未見明顯異常改變，體積未增大，無水腫，色澤紅潤，無瘀血；模型組大鼠肺組織體積增大、水腫，色澤暗紅、表面可見散在分布的大小不等的暗紅色斑點狀病灶；低劑量組大鼠肺組織體積增大、水腫，色澤暗紅，表面有少量散在分布的點狀暗斑；中劑量組大鼠肺組織腫脹不明顯，體積增大不明顯，色略暗紅，出血點不明顯；高劑量組大鼠肺組織體積未見明顯增大，腫脹不明顯，色略暗，表面無明顯出血點。見圖1。

2.3 肺組織病理觀察結(jié)果

空白對照組肺組織病理可見肺泡結(jié)構(gòu)清晰、完整；模型組可見肺泡欠清晰、結(jié)構(gòu)遭到破環(huán)，肺間質(zhì)水腫、肺泡壁增厚，肺泡腔縮小，且肺泡腔內(nèi)可見大量炎性滲出物及紅細胞，支氣管腔內(nèi)也可見大量分泌物，毛細血管壁充血水腫；低劑量組、中劑量組、高劑量組均較模型組改善，且改善情況逐漸明顯。見圖2。

2.4 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

與空白對照組比較，模型組TNF-α、IL-1β、IL-6水平均升高(P<0.05)。與模型組比較，中藥低劑量組TNF-α無明顯降低(P>0.05)，IL-1β、IL-6降低(P<0.05)；而中劑量與高劑量組TNF-α、IL-1β、IL-6均顯著降低(P<0.05)，但高劑量與中劑量組之間均無明顯差異(P>0.05)。見表1。

2.5 各組大鼠肺組織中p65水平比較

與空白對照組相比，模型組p65升高(P<0.05)。與模型組比較，中藥低、中、高劑量組p65明顯降低(P<0.05)，但中藥低、中、高劑量三組之間無明顯差異(P>0.05)。見表2、圖3。

圖1 各組肺組織大體觀察圖

圖2 各組肺組織病理觀察圖(×20倍)

組別nTNF?αIL?1βIL?6空白對照組1020．54±1．62285．71±42．1324．28±4．08模型組1023．76±1．58a417．48±68．88a31．58±8．26a低劑量組1021．38±1．47355．39±112．24b24．59±3．76b中劑量組1017．31±4．11b321．39±87．68b24．56±6．13b高劑量組1016．36±3．95b305．47±54．02b24．67±5．11b

注： 與空白對照組比較，aP<0.05； 與模型組比較，bP<0.05。

表2 各組大鼠肺組織中p65含量比較

注： 與空白對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

圖3 各組大鼠肺組織中p65含量

3 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)與ARDS的關(guān)系十分密切。炎性反應(yīng)，特別是急性炎癥反應(yīng)在ARDS早期階段有著重要的作用。機體受到損傷刺激后，釋放大量的炎性因子，炎性因子激活巨噬細胞及中性粒細胞等效應(yīng)細胞，在效應(yīng)細胞的刺激下，導(dǎo)致肺泡Ⅱ型上皮細胞損傷，發(fā)生腫脹變性壞死，而中性粒細胞的凋亡延遲，導(dǎo)致組織損傷，及肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡過多[2]。

急性炎性反應(yīng)過程中出現(xiàn)各種血漿蛋白和炎性細胞因子水平的變化，如腫瘤壞死因子α、白細胞介素1β、白細胞介素6等細胞的促炎性因子表達上調(diào)，一方面啟動了炎性級聯(lián)反應(yīng)，激活核轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)細胞調(diào)亡；另一方面抑炎性因子表達增加，促進損傷修復(fù)。NF-κB作為一種具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核因子，廣泛參與免疫、炎癥、氧化應(yīng)激等生理病理過程，是ARDS中重要的調(diào)控反應(yīng)。由于炎癥因子(如TNF-α、IL-1β、IL-6)與NF-κB之間又能夠相互激活[3]，導(dǎo)致NF-κB活化，并進一步刺激機體釋放大量炎癥相關(guān)性物質(zhì)，炎癥瀑布反應(yīng)發(fā)生，加重肺部損傷。經(jīng)典的NF-κB是p65/p50二聚體結(jié)構(gòu)，p50上含有與DNA結(jié)合的位點，p65則主要參與基因轉(zhuǎn)錄的起始環(huán)節(jié)，同時也是NF-κB的主要活性形式，LPS通過激活NF-κB誘發(fā)大量炎癥因子釋放成為ARDS發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，NF-κB是炎癥反應(yīng)的終末控制點[4]，而抑制NF-κB信號通路的激活，降低NF-κB的活性則有利于減少肺部炎癥、水腫及肺泡細胞的壞死，從而降低肺損傷程度，故通過阻斷NF-κB信號通路的激活，很有可能成為治療ARDS的一個有效方案。

3.1 益氣化瘀解毒方的組方與配伍

ARDS屬于中醫(yī)“暴喘”“肺衰”“喘證”等范疇，其發(fā)病在早期多表現(xiàn)為實證，中、晚期則多為虛證，但杜懷棠教授認為，“邪之所湊，其氣必虛”，早期多以邪實為主，兼有氣虛，而正氣之盛衰與疾病進展密切相關(guān)，在疾病早期階段補益正氣，有利于抗邪外出，疾病恢復(fù)。

毒瘀內(nèi)阻，氣機壅閉是本病的關(guān)鍵病機，因此，杜懷棠教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗研制了具有益氣化瘀，解毒平喘之功效的益氣化瘀解毒方。本方主要藥物組成為黃芪、三七、金銀花、炒枳實、赤芍等，以黃芪、三七為君藥，金銀花為臣藥，炒枳實、赤芍等共為佐藥?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將黃芪列入上品，認為其“味甘，微溫”，具有“補虛，排膿止痛之功效”；《名醫(yī)別錄》認為黃芪“無毒”，并強調(diào)其益氣?，F(xiàn)代藥理研究黃芪的主要成分為黃芪多糖，具有抗炎作用，可以抑制巨噬細胞合成，并抑制促炎因子IL-1β、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、IL-6的分泌，同時促進抗炎因子IL-10的釋放，從而抑制炎癥反應(yīng)[5]。三七具有活血化瘀、益氣補虛之功效，《本草綱目》中言“止血散血，定痛”。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其主要成分是三七總皂苷，具有降低ARDS大鼠血清及肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-10含量，緩解低氧血癥[6]。黃芪與三七二者共為君藥，共奏益氣化瘀之功效。

《名醫(yī)別錄》將金銀花列為上品，并稱其久服輕身，有延年益壽之功效，主要用于寒熱身腫。在清朝，其解毒之功效被一致肯定[7]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明金銀花具有抗炎，抗內(nèi)毒素的作用[8]，且其對TNF-α、IL-6均具有調(diào)控作用[9]。以金銀花為臣藥，發(fā)揮其清熱解毒、透營轉(zhuǎn)氣之功效，解同時協(xié)同黃芪、三七發(fā)揮本方益氣化瘀解毒之功。

赤芍為活血涼血藥，《本草綱目》中提到，“赤芍散邪，能行血中之滯”；《日華子本草》言赤芍可補氣?，F(xiàn)代藥理學(xué)提出，赤芍總苷具有改善凝血功能的作用。研究表明，凝血纖溶系統(tǒng)的功能異常與ARDS的炎性反應(yīng)在疾病發(fā)展過程中有著密切的關(guān)系，常具有相互促進的作用[10]。改善凝血功能，不僅有利于改善瘀血狀況，還可減輕炎癥反應(yīng)。枳實為理氣藥，《藥性賦》中言其功用有四：“消心下痞塞之痰，泄腹中滯塞之氣，推胃中隔宿之食，削腹內(nèi)連年之積。”氣血關(guān)系密切，氣行則血行，理氣可以活血，改善瘀血狀態(tài)。大腸與肺互為表里，ARDS的發(fā)生后除出現(xiàn)進行性呼吸困難、喘憋等肺氣壅滯，氣機不暢的表現(xiàn)外，還常表現(xiàn)為大便失調(diào)，腑氣不通等大腸失于傳導(dǎo)的癥狀，在治療時肺腸同治可以提高其療效。方中其他配伍藥物具有抗氧化利水之功效。

3.2 益氣化瘀解毒復(fù)方對ARDS大鼠炎性因子的影響

本實驗結(jié)果顯示：ARDS大鼠肺組織病理學(xué)可見肺組織損傷，肺臟組織正常結(jié)構(gòu)遭破壞，肺間質(zhì)水腫，肺泡內(nèi)可見炎性滲出物，血清中IL-1β、IL-6、TNF-α，肺組織中p65蛋白表達均明顯增加，而本方能夠改善大鼠肺組織病理受損情況，并且可以顯著降低血清中IL-1β、IL-6、TNF-α及肺組織中p65蛋白表達含量，具有減輕炎癥反應(yīng)的作用，這可能是復(fù)方防治ARDS的有效途徑之一。

本次實驗中，中、高劑量組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α及肺組織中P65蛋白表達均較模型組有明顯下降，表明本方在中劑量時就可達到預(yù)期療效。但是中、高劑量組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異，僅可看到下降趨勢，考慮本方在中劑量時就可達到較滿意療效，增量增效并無明顯證據(jù)。而低劑量組大鼠血清中TNF-α較模型組并無明顯下降，考慮低劑量的中藥濃度在抑炎方面療效并不理想。綜上所述，中劑量是較為理想劑量，在今后實驗中可以對中劑量的治療效果及機制進行進一步的研究。

本實驗中模型組大鼠炎癥因子與p65含量均升高，而中藥干預(yù)后均有所下降，考慮有三種可能：一方面，中藥復(fù)方主要通過抑制炎癥因子的產(chǎn)生，而減少NF-κB通路激活，從而減輕炎癥反應(yīng)；另一方面，復(fù)方通過抑制NF-κB通路激活，減少炎癥因子釋放；第三減輕炎癥反應(yīng)，中藥復(fù)方有多靶點治療的特點，復(fù)方是否在抑制了炎癥因子產(chǎn)生的同時也阻斷了NF-κB通路的激活，這需要在接下來的實驗中做進一步的研究。

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(本文編輯： 董歷華)

Study on the therapeutic effect ofYiqiHuayuJiedurecipe on endotoxin induced ARDS rats

HUANGRuiyin，LIYan，LIXin，etal.

DongzhimenHospital，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100700，ChinaCorrespondingauthor：LIYan，E-mail：13011097949@126.com

Objective To study protective effect ofYiqiHuayuJiedurecipe on acute respiratorydistress syndrome (ARDS) rats induced by lipopolysaccharide and to observe the influence of inflammatory factor. Methods 50 healthy male SD rats were randomly divided into 5 groups(n=10). All rats were fed for one week to adapt the environment. The rats were intragastric administration with corresponding drug. The ARDS model was injected with LPS (2mg/kg) after 7 days. The rats were sacrificed after 16 hours of modeling. Lung tissue was collected to observed the pathology organization, and the TNF-α, IL-1β, IL-6, p65 protein in serum were detected. Results TNF- alpha: compared with the blank control group, serum TNF-α of rats in the model group was increased(P<0.05). Compared with the model group, TNF-α of low dose of Chinese medicine group was decreased non-significantly, TNF-α of medium and high dose of Chinese medicine group was decreased significantly (P<0.01), but there was no significant between two groups； Compared with the blank control group, IL-1, IL-6 and p65 protein of model group rats was increased(P<0.05). Compared with the model group, IL-1, IL-6 and p65 protein of Chinese medicine groups were decreased (P<0.05).ConclusionYiqiHuayuJiedurecipe can reduce the lung tissue injuries of ARDS rats induced by LPS, and can reduce the level of TNF-α, IL-1β, IL-6, can inhibit the NF-κB pathway activation and reduce inflammation reactions. In a certain range, improve the dosage of compound, and enhance the effect.

Respiratory distress syndrome； Inflammation；YiqiHuayuJiedurecipe

北京中醫(yī)藥大學(xué)2015年度自主課題(2015-JYB-JSMS059)；北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院橫向課題(廣東駿豐頻譜有限公司項目)(HX-DZM-2015002)

100700 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院急診科(黃瑞音、李雁、劉麗杰)，教育處(李昕)，呼吸科(程淼)；北京朝陽區(qū)中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)二科(黃瑞音)；北京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院[駱長永(碩士研究生)、萬茂婷(碩士研究生)]，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(王謙)；北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院(吳元德)；廣東駿豐頻譜有限責(zé)任公司(王欣)

黃瑞音(1989- )，女，碩士，住院醫(yī)師。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合急診方向。E-mail:eagle2003@foxmai.com

李雁 (1967- )女，碩士，主任醫(yī)師，教授。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合急診。E-mail:13011097949@126.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.02.003

2016-10-22)