針康法對腦缺血大鼠神經功能和細胞外信號調節(jié)激酶1/2信號通路的影響①

唐強，葉濤，朱路文，吳孝軍，李宏玉，田源

針康法對腦缺血大鼠神經功能和細胞外信號調節(jié)激酶1/2信號通路的影響①

唐強1，葉濤2，朱路文1，吳孝軍2，李宏玉2，田源2

目的探討針康法對腦缺血大鼠神經功能預后和細胞外信號調節(jié)激酶1/2(ERK1/2)信號通路的影響。方法90只雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分入假手術組(n=18)、模型組(n=18)、針刺組(n=18)、康復組(n=18)及針康組(n=18)，再分為術后3 d、7 d、14 d三個亞組(n=6)。線栓法制備永久性局灶性腦缺血模型。假手術組和模型組不進行治療，針刺組采用頭穴叢刺針法治療，康復組給予電動跑臺訓練，針康組采用針康法治療。各時間點，采用改良神經損害嚴重程度評分進行評定，Western blotting法檢測缺血半暗區(qū)皮層ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達。結果術后各時間點，與模型組比較，各治療組神經缺損評分降低(P＜0.05)；術后7 d、14 d，與針刺組、康復組比較，針康組評分降低(P＜0.05)。術后各時間點，與模型組比較，各治療組p-ERK1/2蛋白表達增加(P＜0.05)，(p-ERK1/2)/(ERK1/2)增加(P＜0.05)；與針刺組、康復組比較，針康組p-ERK1/2蛋白表達升高(P＜0.05)，(p-ERK1/2)/ (ERK1/2)增加(P＜0.05)。結論針康法治療可進一步改善腦缺血大鼠神經行為，可能與ERK1/2信號通路激活有關。

腦缺血；針康法；神經功能；細胞外信號調節(jié)激酶1/2；大鼠

[本文著錄格式] 唐強，葉濤，朱路文，等.針康法對腦缺血大鼠神經功能和細胞外信號調節(jié)激酶1/2信號通路的影響[J].中國康復理論與實踐,2017,23(1):27-31.

CITED AS:Tang Q,Ye T,Zhu LW,et al.Effects of acupuncture-rehabilitation therapy on neurological function and extracellular sig-nal-regulated kinase 1/2 signaling pathway after focal cerebral ischemia in rats[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(1):27-31.

缺血性腦卒中是由于動脈狹窄或閉塞，腦血流供應障礙造成大腦缺血、缺氧，最終導致局限性腦組織壞死的總稱，占全部腦卒中的60%～80%，發(fā)病率、死亡率、致殘率居高不下，并呈現(xiàn)年輕化趨勢[1]。針康法已經廣泛運用于腦卒中患者各類功能障礙的治療，臨床療效顯著，安全性和有效率得到大量臨床與基礎研究證實[2]。細胞外信號調節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated protein kinase1/2,ERK1/2)信號通路與腦缺血再灌注損傷修復關系密切[3-4]。本研究觀察針康法對腦缺血大鼠神經功能及ERK1/2信號通路的影響，探討針康法神經保護作用的機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠，初始體質量(250±20)g，鼠齡10～12周，由黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全性評價中心提供，合格證書編號SYXK(黑) 2010007。飼養(yǎng)條件：溫度23～25℃，濕度55%～65%，12 h/12 h明暗交替。實驗前所有大鼠經適應性喂養(yǎng)1周及適應性跑臺訓練3 d(速度15 m/min，每天30 min)后，篩選可完成跑臺訓練方案的大鼠90只。實驗過程中大鼠處置嚴格遵守動物倫理準則和指南的相關規(guī)定。

將90只大鼠編號，計算機生成含90個數(shù)的隨機數(shù)字表，任意選擇表中一個數(shù)為起始點對應大鼠編號1，從左至右，自上而下分別對應1～90號大鼠。用隨機數(shù)字除以5得余數(shù)確定每只大鼠的分組，余數(shù)0、1、2、3、4分別對應假手術組、模型組、針刺組、康復組及針康組，最終各組均有18只大鼠；同法將各組18只大鼠再分入3 d、7 d、14 d三個亞組(n=6)。

造模失敗或死亡大鼠另選大鼠補充。

1.2 實驗試劑與儀器

ERK1/2、p-ERK1/2多克隆抗體：SANTA CRUZ公司。β-actin抗體：WANLEIBIO公司。羊抗兔IgG-HRP：BEYOTIME公司。PVDF膜：MILLIPORE公司。TEMED：AMRESCO公司。預染蛋白分子量標準：FERMENTAS公司。

漢醫(yī)牌一次性無菌針灸針：北京漢醫(yī)醫(yī)療器械中心。Research plus移液器：EPPENDORF公司。ZH-PT型動物實驗跑臺：安徽正華生物儀器設備有限公司。Multiskan FC型酶標儀：THERMO公司。KDC-140HR高速冷凍離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司。Smart Simplicity型超純水系統(tǒng)：MERCK公司。DYCZ-24DN型蛋白凝膠電泳儀、DYCZ-40D型轉印電泳儀、DYY-7C型電泳儀電源、WD-9405B型脫色搖床：北京六一儀器廠。BIS910凝膠成像分析系統(tǒng)：北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.3 模型制備

參考Longa法[5]及前期實驗研究[6]，制備大腦中動脈永久性腦缺血大鼠模型。大鼠術前12 h禁食。10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉，術中動物保持自主呼吸，恒溫加熱板維持體溫(37.0±0.5)℃。頸部備皮，碘伏消毒后頸正中切口，暴露大鼠右頸總、頸外及頸內動脈，結扎頸總、頸外動脈，用微動脈夾阻閉分叉處血流，在其下方3～5 mm處用2 ml注射器針頭斜刺一個“V”型小口，將頭端2 mm過蠟，長3 cm的魚線送入血管，備活結以固定線栓；松開動脈夾，將魚線送入頸內動脈，阻斷大腦中動脈血流。將活結扎死以固定線栓。消毒，逐層縫合。

假手術組大鼠不插入線栓，其余操作相同。

術后1 d，采用Longa 5級4分制標準[5]篩選模型，評分1～3分大鼠納入實驗。

1.4 干預方法

假手術組及模型組術后回籠飼養(yǎng)，不進行任何治療，只給予同等條件抓取。

針刺組于術后24 h，采用頭穴叢刺針法治療。直徑0.25 mm、長25 mm一次性針灸針，取百會穴及其左、右各旁開2 mm處針刺，快速捻轉1 min后留針2 h，每天1次。

康復組于術后24 h，采用電動跑臺訓練模擬運動康復治療。坡度0°；速度：第1～3天8 m/min，第4～7天12 m/min，第7天后15 m/min。每次30 min，每天1次。

針康組于術后24 h，采用頭穴叢刺結合跑臺訓練進行治療，讓大鼠在頭穴叢刺針留針期間完成跑臺訓練。頭穴叢刺方案同針刺組，跑臺訓練方案同康復組。

1.5 神經行為學評估

術后各時間點，各組大鼠干預結束后，采用改良神經損害嚴重程度(modified Neurologic Severity Score, mNSS)[7]評估各組大鼠神經功能恢復情況。

1.6 Western blotting

術后各時間點，神經功能評分后，大鼠10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射，冰板上快速斷頭取腦，采集大腦中動脈梗死周邊皮層缺血組織，液氮速凍5 min后，-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

取一定量標本，加入細胞裂解液制成蛋白勻漿，低溫孵育后提取上清液。BCA法測定上清液中蛋白質總濃度。上樣體積20 μl，含蛋白50 μg。10% SDS-PAGE電泳分離目的蛋白(80 V，2.5 h)，轉移到PVDF膜上(70 V，1.5 h)。TTBS緩沖液配制5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h，加入ERK1/2(1∶200)、p-ERK1/2(1∶200)一抗，4℃孵育過夜。加入羊抗兔IgG-HRP二抗(1∶5000)，室溫孵育1 h。TBST洗膜，加入ECL發(fā)光孵育5 min，顯影，凝膠成像儀上照相，Gel-Pro Analyzer 4.0進行定量分析。以假手術組某一樣本蛋白相對表達量為1，其余樣本均為與其較正后的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析。mNSS評分和ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相對表達量及(p-ERK1/2)/ (ERK1/2)比值均以(±s)表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩之間比較采用LSD-t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 mNSS

各時間點，假手術組mNSS評分均為0；與假手術組比較，模型組評分升高(P＜0.05)；與模型組比較，各治療組評分降低(P＜0.05)。術后7 d、14 d，與康復組、針刺組比較，針康組mNSS評分降低(P＜0.05)。見表1。

表1 各時間點各組大鼠mNSS評分比較

2.2 Western blotting

術后3 d、7 d，模型組p-ERK1/2蛋白水平較假手術組下降(P＜0.05)，術后14 d上升(P＜0.05)。與模型組比較，各治療組各時間點p-ERK1/2蛋白水平升高(P＜0.05)。與針刺組、康復組比較，針康組p-ERK1/2蛋白水平進一步升高(P＜0.05)；針刺組與康復組也有顯著性差異(P＜0.05)。見表2。

表2 各時間點各組大鼠p-ERK1/2蛋白相對表達量比較

術后3 d、7 d，各組間ERK1/2蛋白水平無顯著性差異(P＞0.05)。術后14 d，針康組ERK1/2蛋白表達上升(P＜0.05)。見表3。

術后3 d、7 d，模型組(p-ERK1/2)/(ERK1/2)較假手術組降低(P＜0.05)，術后14 d升高(P＜0.05)。與模型組比較，各治療組各時間點(p-ERK1/2)/(ERK1/2)升高(P＜0.05)，針康組較針刺組、康復組升高(P＜0.05)；術后3 d、7 d，針刺組較康復組下降(P＜0.05)。見表4。

表3 各時間點各組大鼠ERK1/2蛋白相對表達量比較

表4 各時間點各組大鼠(p-ERK1/2)/(ERK1/2)比較

3 討論

針康法作為腦卒中康復的新方法，集頭穴叢刺療法與現(xiàn)代康復于一體，具有“針康同步、動態(tài)治療、整體康復”的優(yōu)勢，被廣泛運用于腦卒中患者運動、平衡、言語、認知等功能障礙的康復，可明顯改善其功能，提高日常生活活動能力，優(yōu)于單純頭穴叢刺或康復[8-11]。針康法可改善腦缺血大鼠神經功能，減輕腦水腫，縮小腦梗死體積，促進運動功能恢復等，機制涉及突觸可塑性、神經再生、血管新生、細胞凋亡及炎癥級聯(lián)反應等多個環(huán)節(jié)[12-15]。

mNSS從運動、感覺、反射三個方面評定神經功能。本研究顯示，針康法可以加速神經功能恢復，優(yōu)于單純頭穴叢刺或康復，且遠期功能恢復更佳。

ERK信號傳導通路是主要的細胞存活和增殖信號途徑之一，與缺血性腦卒中關系密切，但目前對其發(fā)揮保護作用還是損害作用尚存有爭議[4,16]。大量研究肯定ERK1/2通路的激活對缺血性腦卒中有保護作用：腦缺血后上調p-ERK蛋白表達可發(fā)揮抗炎作用，降低腦梗死體積，減輕腦水腫[17]；促進骨橋蛋白分泌，降低興奮性氨基酸毒性，促進小膠質細胞存活[18]；激活缺氧誘導因子-1α表達，對抗缺氧性腦損傷，發(fā)揮神經保護作用[19]等。作為有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)的一個主要亞家族，正常情況下ERK位于胞質內，細胞因子、生長因子、G蛋白偶聯(lián)性配體、射線、滲透壓改變及微管解體等細胞內外刺激因素，均可通過Raf-MEK-ERK途徑，磷酸化ERK1/2Ⅷ區(qū)上絲氨酸/蘇氨酸雙位點，從而激活ERK；活化的ERK(p-ERK)能將胞外刺激信號傳遞至胞核，調控轉錄因子、細胞骨架蛋白及蛋白激酶等表達，調節(jié)細胞存活、增殖、分化、凋亡及組織侵襲等多種生物學效應[3]。電針可促進腦缺血后細胞增殖，發(fā)揮腦保護作用，其機制與激活ERK信號通路有關[20]。

本研究顯示，腦缺血后，p-ERK1/2蛋白表達呈現(xiàn)先降后升趨勢，原因可能是由于急性缺血缺氧環(huán)境造成ERK1/2途徑激活失敗；隨著損傷程度減弱，ERK1/2信號通路活性逐漸增強。隨著治療手段介入，p-ERK1/2蛋白表達大致呈現(xiàn)先升后降趨勢，在較長時間內維持ERK1/2信號途徑活化；其中，針刺后p-ERK1/2蛋白表達高峰低于康復，但可持續(xù)較長時間；針康治療后，p-ERK1/2蛋白表達則呈持續(xù)升高趨勢，且表達水平始終高于單一的針刺或康復治療。值得注意的是，干預后期針康法上調ERK1/2蛋白的表達水平，具體機制仍需進一步研究闡明。

綜上所述，針康法治療后，腦缺血大鼠神經功能明顯改善，可能與其激活ERK1/2信號通路有關。但具體激活途徑，以及激活后的作用途徑仍有待進一步研究。

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Effects of Acupuncture-rehabilitation Therapy on Neurological Function and Extracellular Signal-regulated Kinase 1/2 Signaling Pathway after Focal Cerebral Ischemia in Rats

TANG Qiang1,YE Tao2,ZHU Lu-wen1,WU Xiao-jun2,LI Hong-yu2,TIAN Yuan2
1.Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin,Heilongjiang 150001,China;2.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin,Heilongjiang 150040,China

TANG Qiang.E-mail:tangqiang1963@163.com

ObjectiveTo explore the effects of acupuncture-rehabilitation therapy on neurological function recovery and extracellular signal-regulated kinase 1/2(ERK1/2)signaling pathway activation after permanent focal cerebral ischemia in rats.MethodsNinty male Sprague-Dawley rats were divided into five groups,namely sham group,model group,acupuncture group,rehabilitation group and acupuncture-rehabilitation group,and 18 in each group.Each group was further divided into 3 days,7 days and 14 days subgroups(n=6).Their middle cerebral arteries were occluded except those of sham group.The sham and model groups accepted no treatment,while the acupuncture group accepted cluster needling of scalp acupuncture,rehabilitation group accepted treadmill training,and the acupuncture-rehabilitation group accepted both acupuncture and treadmill training.They were assessed with modified Neurologic Severity Score(mNSS)3,7 and 14 days after modeling,while the expression of ERK1/2 and p-ERK1/2 were determined with Western blotting.ResultsThe neurologic severity score reduced in all three treatment groups(P＜0.05)compared with that of the model group at every time point,and was the least in the acupuncture-rehabilitation group(P＜0.05)7 and 14 days after modeling among the treatment groups.Meanwhile,the expression of p-ERK1/ 2 increased in all three treatment groups(P＜0.05),and was the most in the acupuncture-rehabilitation group(P＜0.05),as well as the rate of (p-ERK1/2)/(ERK1/2)(P＜0.05).ConclusionAcupuncture-rehabilitation therapy can promote the neurological function recovery,which may be associated with activation of ERK1/2 signaling pathway.

cerebral ischemia;acupuncture-rehabilitation therapy;neurological function;extracellular signal-regulated kinase 1/2;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.01.007

R743.3

A

1006-9771(2017)01-0027-05

2016-10-10

2016-10-31)

1.國家自然科學基金項目(No.81273818;No.81473762)；2.黑龍江中醫(yī)藥大學領軍人才計劃項目(No.2012RCL02)。

1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱市150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江哈爾濱市150040。作者簡介：唐強(1963-)，男，漢族，四川大竹縣人，博士，教授，主要研究方向：神經系統(tǒng)疾病中醫(yī)康復基礎與臨床研究。E-mail:tangqiang1963@163.com。