葡萄皮和葡萄酒抗氧化活性與抑制斑馬魚(yú)血管生成研究

孫海燕 王 華 徐志民 李 華

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西楊凌 712100； 2.陜西理工大學(xué)陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 漢中 723000；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院， 陜西楊凌 712100； 4.路易斯安那州立大學(xué)食品科學(xué)系， 巴吞魯日 70803)

葡萄皮和葡萄酒抗氧化活性與抑制斑馬魚(yú)血管生成研究

孫海燕1,2王 華3徐志民4李 華3

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西楊凌 712100； 2.陜西理工大學(xué)陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 漢中 723000；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院， 陜西楊凌 712100； 4.路易斯安那州立大學(xué)食品科學(xué)系， 巴吞魯日 70803)

對(duì)2種葡萄皮及其釀造的葡萄酒中粗酚進(jìn)行提取，測(cè)定其體外DPPH清除率和總抗氧化能力，進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)對(duì)提取物進(jìn)行血管生成抑制活性檢測(cè)。提取物處理斑馬魚(yú)胚胎22 h后，統(tǒng)計(jì)斑馬魚(yú)體節(jié)間血管的生長(zhǎng)情況及提取物對(duì)斑馬魚(yú)體節(jié)間血管的抑制作用。試驗(yàn)結(jié)果顯示，葡萄酒和葡萄皮均具有一定的體外抗氧化活性，但葡萄酒的DPPH清除率和總抗氧化能力均高于葡萄皮，其中葡萄酒1的DPPH清除率最高，為89.42%；比葡萄酒2高1.29個(gè)百分點(diǎn)，總抗氧化能力葡萄酒2最高，為223.24 U/mL；葡萄酒粗酚提取物能明顯抑制斑馬魚(yú)血管生成，且節(jié)間血管數(shù)量較對(duì)照組明顯減少，其中葡萄酒1的背長(zhǎng)軸和體節(jié)間血管抑制效果更好；而葡萄皮粗酚提取物對(duì)斑馬魚(yú)血管生成無(wú)任何作用。

葡萄酒； 多酚類物質(zhì)； 抗氧化活性； 斑馬魚(yú)； 血管生成

引言

血管生成即從已有的毛細(xì)血管或毛細(xì)血管后靜脈發(fā)展而形成新血管的過(guò)程，內(nèi)皮細(xì)胞的激活、增殖和遷移在此過(guò)程中扮演重要角色。在正常情況下，生理性的血管生成是必要條件，如正常組織發(fā)育、生殖、傷口愈合修復(fù)等，而持續(xù)的血管生成即病理性血管生成則是某些病變，如腫瘤組織的惡性增長(zhǎng)、糖尿病性視網(wǎng)膜病變等[1]。因?yàn)槟[瘤的生長(zhǎng)對(duì)血管生成具有依賴性，一方面，腫瘤通過(guò)誘導(dǎo)新生血管生成為其提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；另一方面，新生血管的形成提供了腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)位轉(zhuǎn)移的通道。因此有效抑制腫瘤誘導(dǎo)的新生血管生成將有效防治癌癥。

目前，抗血管生成已成為腫瘤治療的良好策略，而開(kāi)發(fā)血管生成抑制劑也隨之成為腫瘤研究的焦點(diǎn)。與傳統(tǒng)抗腫瘤藥物相比，血管生成抑制劑優(yōu)點(diǎn)在于：抗腫瘤血管生成藥物起到通過(guò)減少或阻斷腫瘤組織的血液供應(yīng)而使腫瘤細(xì)胞增殖周期延長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞壞死作用，而不是直接殺死腫瘤細(xì)胞，故無(wú)明顯的毒副作用，并且應(yīng)用廣泛，可治療多種腫瘤，同時(shí)可克服化療過(guò)程中的抗藥性問(wèn)題[2-3]。

多酚物質(zhì)是紅葡萄酒的主要成分之一，具有延緩衰老、預(yù)防心血管疾病、預(yù)防癌癥、抗炎癥等作用[4-8]，但紅酒多酚是否具有抑制動(dòng)物血管生成活性，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)研究報(bào)道。本文利用內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系Tg(flk1：EGFP)，在熒光顯微鏡下觀察受精后22 h內(nèi)斑馬魚(yú)胚胎內(nèi)體節(jié)間血管的生成情況，從而對(duì)葡萄酒粗酚提取物抑制血管生成活性及機(jī)制進(jìn)行初步研究，為預(yù)防腫瘤和血液病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 葡萄外皮粗酚提取

葡萄品種不同(標(biāo)記為葡萄1、葡萄2)，但均為歐亞屬，采于陜西省楊凌區(qū)曹辛莊，采收當(dāng)天于-80℃冰箱分別冷凍葡萄50粒，流水下剝?nèi)∑咸哑?，液氮冷凍粉碎成粉末，于凍干機(jī)中凍干24 h，取出裝于自封袋中，存放于-80℃冰箱。稱取1 g過(guò)60目篩干粉于50 mL離心管中(離心管需用黑膠帶或錫箔紙包裹)，加入10 mL 0.1%鹽酸甲醇溶液，于60℃水浴鍋中提取30 min取出，于10 000 r/min下離心10 min，收集上清液于離心管中，重復(fù)以上提取步驟2次，合并3次所有上清液于離心管中，上清液經(jīng)過(guò)濾后收集，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(小于40℃)蒸餾濃縮至體積小于原體積的5%，定容至5 mL備用。

1.1.2 紅葡萄酒的濃縮

由上述葡萄1、葡萄2自釀紅葡萄酒，得到對(duì)應(yīng)的葡萄酒1、葡萄酒2。分別取100 mL紅酒于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，在38℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至體積小于原體積的15%，于凍干機(jī)中凍干24 h得濃縮干塊，-80℃冰箱存放備用。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

采用轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系Tg(flk1:EGFP)，該轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)含有flk1啟動(dòng)子控制的增強(qiáng)綠色熒光蛋白，因而血管可在熒光顯微鏡下觀察，以便發(fā)現(xiàn)藥物對(duì)血管的作用。斑馬魚(yú)胚胎由Tg(flk1:EGFP)純合子或雜合子與野生型配對(duì)自然交配獲得，每次交配準(zhǔn)備4或5對(duì)成年斑馬魚(yú)，平均每對(duì)能產(chǎn) 200～300個(gè)胚胎。所用斑馬魚(yú)均由上海南方模式生物研究中心提供。斑馬魚(yú)飼養(yǎng)于全封閉循環(huán)系統(tǒng)，養(yǎng)殖和繁殖均參照Z(yǔ)ebrafish Book 標(biāo)準(zhǔn)[9]，魚(yú)房?jī)?nèi)光照、黑暗時(shí)間14 h、10 h，室內(nèi)溫度26℃，水溫28.5℃，每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導(dǎo)率480～510 μS/cm；pH值6.9～7.2，其各項(xiàng)水質(zhì)指標(biāo)均合要求。

1.1.4 試劑

二甲基亞砜(DMSO，分析純，上海西隴化工有限公司); 三卡因甲磺酸(分析純，Sigma-Aldrich公司)；斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)液(參照Z(yǔ)ebrafish Book標(biāo)準(zhǔn)，0.137 mol/L NaCl，5.4 mmol/L KCl，0.25 mmol/L Na2HPO4，0.44 mmol/L K2HPO4，1.3 mmol/L CaCl2，1.0 mmol/L MgSO4，4.2 mmol/L NaHCO3); PBS緩沖液(8.0 g NaCl，0.2 g KCl，0.24 g K2HPO4，3.62 g Na2HPO4·12H2O，先用少量超純水依次溶解，再加至1 000 mL，鹽酸調(diào)pH值至7.0)；固定液(用PBS緩沖液配制4%多聚甲醛固定液)；總抗氧化能力試劑盒(南京建成科技有限公司)；沒(méi)食子酸(標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院)；氫氧化鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉等(分析純，購(gòu)自上?？婆d商貿(mào)有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

XSE104型萬(wàn)分之一電子天平(上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司)；DZF-6090型真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；RQX-400智能型人工氣候箱(上海市百典儀器廠)；Nikon SMZ1500型高配置體式熒光顯微鏡(日本尼康公司)；TGL-18M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海盧湘離心機(jī)儀器有限公司)；R214-B3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)；UV-1700型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津貿(mào)易有限公司)；AL204型萬(wàn)分之一天平(瑞士梅特勒公司)；MP511型酸度計(jì)(上海精密儀器儀表有限公司)；WTY型手持糖度計(jì)(北京鑫潤(rùn)科諾儀器儀表有限公司)。

1.3 方法

總糖測(cè)定參照斐林試劑滴定法[10]；總酸測(cè)定參照氫氧化鈉滴定法[10]；pH值參照酸度計(jì)法測(cè)定[10]；可溶性固形物測(cè)定參照手持糖度計(jì)法[10]；色度測(cè)定[11]方法為：將葡萄原酒經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后分別測(cè)其pH值，并用相同pH值的磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液稀釋10倍，測(cè)定其在420、520、620 nm下的吸光度(A1、A2、A3)，吸光度之和乘以吸光倍數(shù)即為該葡萄酒的色度。

酒精度、干浸出物測(cè)定參照文獻(xiàn)[12]；總酚含量測(cè)定參照福林-消卡法，結(jié)果以沒(méi)食子酸計(jì)[13]；DPPH清除率測(cè)定參考孟江飛[14]的方法稍做調(diào)整后進(jìn)行。DPPH自由基清除率公式為

U=(A2-A)/A×100%

式中A2——樣品吸光度測(cè)定值A(chǔ)——蒸餾水代替樣品時(shí)的空白測(cè)定值

總抗氧化能力測(cè)定參照試劑盒法；斑馬魚(yú)胚胎血管生成活性測(cè)定方法如下：

轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)受精后在光照、黑暗時(shí)間為14 h、10 h，28.5℃的人工氣候箱內(nèi)孵育22 h后對(duì)胚胎進(jìn)行清理，移除已死亡胚胎，并根據(jù)胚胎的發(fā)育階段挑選合適的胚胎[15]。因?yàn)榕咛タ梢詮淖陨淼穆腰S囊中獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所以在受精后9 d內(nèi)不需要喂食。用三卡因甲磺酸對(duì)各個(gè)發(fā)育階段的斑馬魚(yú)進(jìn)行過(guò)度暴露處理，從而將斑馬魚(yú)麻醉處死；麻醉處死的操作步驟符合美國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)(AVMA)對(duì)動(dòng)物麻醉處死的規(guī)范要求。為了評(píng)估斑馬魚(yú)胚胎血管生成活性，稱取一定量的葡萄干粉和葡萄酒提取物濃縮干塊，稀釋于0.1%二甲基亞砜(DMSO)中制成100 μg/mL的初始質(zhì)量濃度，加入到12孔板中，將孵化22 h的胚胎也同時(shí)分配到上述12孔板中，每孔30胚胎，于人工氣候箱中繼續(xù)孵化26 h，即為其治療期，觀察血管生成情況。同時(shí)設(shè)定陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，其中沒(méi)有添加藥物的胚胎作為陰性對(duì)照，本試驗(yàn)采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的DMSO，在這個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)下不會(huì)對(duì)斑馬魚(yú)的生長(zhǎng)和發(fā)育產(chǎn)生形態(tài)上的影響，而一種VEGFR抑制劑即5 μm新型酪氨酸激酶抑制劑vatalanib(即PTK787)作為陽(yáng)性對(duì)照[16-17]。篩選出有效葡萄酒的標(biāo)準(zhǔn)為：處理后斑馬魚(yú)胚胎活力較好，且節(jié)間血管數(shù)量顯著減少。試驗(yàn)結(jié)束后，胚胎用三卡因甲磺酸處理，再用胚胎培養(yǎng)液潤(rùn)洗，4%多聚甲醛液固定，4℃冰箱放置12 h，用PBS液沖洗，然后將斑馬魚(yú)取出分別置于載玻片上，熒光顯微鏡下成像觀察拍照體節(jié)間血管生長(zhǎng)情況以及對(duì)節(jié)間血管形成進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄和葡萄酒的理化性質(zhì)結(jié)果

總糖、總酸、pH值、可溶性固形物、總酚含量等指標(biāo)一般用來(lái)評(píng)價(jià)釀酒葡萄和葡萄酒的品質(zhì)；在一定范圍內(nèi)，葡萄含糖量越高，所釀葡萄酒的質(zhì)量越好。李明記等[18-19]認(rèn)為，釀酒葡萄的適宜總酸質(zhì)量濃度為6～10 g/L；適宜的pH值應(yīng)在3.00～3.60之間。適當(dāng)?shù)奶撬岜葢?yīng)為32左右。

由表1可知，所選2種葡萄糖酸比分別為31.79和33.15，均在32左右，屬于適宜糖酸比；對(duì)應(yīng)釀制的葡萄酒酒精度最大值為13.34%，干浸出物質(zhì)量濃度最大值為36.92 g/L；總糖質(zhì)量濃度分別為3.52 g/L和3.85 g/L，上述指標(biāo)均符合國(guó)標(biāo)規(guī)定的干型酒標(biāo)準(zhǔn)；pH值分別為3.53和3.36，屬于適宜pH值范圍。葡萄和葡萄酒的所有測(cè)定指標(biāo)均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[12]。測(cè)定葡萄理化性質(zhì)一方面可以直接反映對(duì)應(yīng)釀制的葡萄酒品質(zhì)，另一方面也可以間接說(shuō)明葡萄皮的一些性質(zhì)。

表1 葡萄和葡萄酒理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果
Tab.1 Physical and chemical properties of grape and wine

類別總糖質(zhì)量濃度/(g·L-1)總酸質(zhì)量濃度/(g·L-1)pH值可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%色度酒精度/%干浸出物質(zhì)量濃度/(g·L-1)總酚質(zhì)量濃度/(mg·L-1)葡萄1165±0.860a5.19±0.112c3.73±0.0120b7.43±0.058c94.21±5.58a葡萄2178±1.260b5.37±0.220b3.67±0.0058a7.83±0.153b101.34±5.06b葡萄酒13.52±2.570a5.25±0.057a3.53±0.0150c5.20±0.200a3.54±0.050ab12.87±0.062a35.08±2.566c213.96±6.05c葡萄酒23.85±1.155c5.07±0.078b3.36±0.0058c4.07±0.062b6.53±0.208b13.34±0.020a36.92±1.155a234.05±6.06b

2.2 體外抗氧化結(jié)果

2.2.1 葡萄皮和葡萄酒DPPH清除率的測(cè)定結(jié)果

DPPH是一種典型的用于體外抗氧化性評(píng)價(jià)的化學(xué)物質(zhì)[20]，本試驗(yàn)對(duì)葡萄皮和葡萄酒粗酚提取液的DPPH自由基消除率進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知葡萄皮2的DPPH清除率更高，為60.97%，比葡萄皮1高16.61個(gè)百分點(diǎn)；而對(duì)應(yīng)的葡萄酒提取液的DPPH自由基消除率相當(dāng)，葡萄1釀制的葡萄酒1清除率更好，為89.42%；比葡萄酒2高1.29個(gè)百分點(diǎn)。由表2可知，葡萄酒的DPPH清除率遠(yuǎn)大于葡萄皮(p<0.05)。

圖1 葡萄和葡萄酒的DPPH清除率Fig.1 DPPH free radical scavenging activities of grape and wine

因素偏差平方和自由度FF臨界值顯著性葡萄134.48217.244.8794*葡萄240.2628.374.8794*葡萄酒151.22225.614.8794*葡萄酒250.73225.374.8794*誤差4.117

注：*表示在α=0.05水平下差異顯著，下同。

圖2 葡萄和葡萄酒的總抗氧化能力測(cè)定結(jié)果Fig.2 Total antioxidant capability of grape and wine

2.2.2 葡萄皮和葡萄酒總抗氧化能力的測(cè)定結(jié)果

由圖2和表3可知，葡萄酒總抗氧化能力遠(yuǎn)大于葡萄皮(p<0.05)，其中葡萄酒2總抗氧化能力最高，為223.24 U/mL，其次為葡萄酒1，總抗氧化能力為178.98 U/mL，最低為葡萄皮1總抗氧化能力，僅為105.30 U/mL，比葡萄酒2低117.94 U/mL。由此進(jìn)一步證明，葡萄酒具有較強(qiáng)的抗氧化能力，適當(dāng)飲用對(duì)人體健康有益。

表3 總抗氧化方差分析結(jié)果
Tab.3 Variance analysis result of total antioxidant capability

有抗氧化作用的物質(zhì)在一定程度上也具有抑制腫瘤的功能[21]，而腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤血管[22]，為了研究具有抗氧化作用的葡萄酒是否也具有抑制血管生成的功能，進(jìn)行了血管生成試驗(yàn)。

2.3 葡萄皮和葡萄酒粗酚提取物對(duì)斑馬魚(yú)模型的安全性分析結(jié)果

把葡萄酒作為藥物進(jìn)行試驗(yàn)，一般情況下，大劑量的藥物會(huì)對(duì)斑馬魚(yú)造成明顯的毒害，引起斑馬魚(yú)的死亡，因此在試驗(yàn)前應(yīng)該篩選待測(cè)物質(zhì)葡萄皮和葡萄酒對(duì)斑馬魚(yú)的毒性作用，從而得到測(cè)試葡萄皮和葡萄酒的最適濃度，即可抑制斑馬魚(yú)血管生成而無(wú)明顯毒副作用的最小劑量。

由表4可以看出葡萄皮提取物對(duì)斑馬魚(yú)及胚胎無(wú)明顯毒性，因此認(rèn)為100 μg/mL的提取物質(zhì)量濃度對(duì)斑馬魚(yú)及胚胎是安全的，而且葡萄皮提取物與血管生成抑制劑PTK787同樣具有抑制血管生成作用。

表4 葡萄皮、葡萄酒提取物的斑馬魚(yú)篩選試驗(yàn)Tab.4 Screening experiment of grape skin and wine extracts in zebrafish model %

2.4 葡萄皮粗酚提取物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎體節(jié)間血管生成的抑制作用

無(wú)論是原發(fā)腫瘤還是轉(zhuǎn)移性腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)散均與血管形成密切相關(guān)，腫瘤血管除向腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)外，還不斷地向人體其他部位輸送腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致惡性腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[23-24]。因此，抑制血管生成是抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的有效手段。

圖3 葡萄果皮粗酚提取物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎體節(jié)間血管生成的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of grape skin on trunk angiogenesis in zebrafish

由圖3可以看出，葡萄皮1、葡萄皮2粗粉提取物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎體節(jié)間血管生成均無(wú)明顯作用，尤其葡萄皮2喂食斑馬魚(yú)，胚胎放大后影像與對(duì)照組結(jié)果完全一致，葡萄皮1放大后斑馬魚(yú)胚胎體節(jié)間血管影像稍有弱化。由此可見(jiàn)，葡萄皮1、葡萄皮2粗粉提取物對(duì)斑馬魚(yú)血管生成沒(méi)有抑制作用。

圖4 葡萄酒1粗酚提取物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎體節(jié)間血管生成的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of wine 1 on trunk angiogenesis in zebrafish

2.5 葡萄酒粗酚提取物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎體節(jié)間血管生成的抑制作用

斑馬魚(yú)節(jié)間血管發(fā)育時(shí)間為24～48 h[25]，本試驗(yàn)中選擇胚胎發(fā)育22 h血管尚未發(fā)育的斑馬魚(yú)作為受試對(duì)象，于胚胎培養(yǎng)液中加入葡萄酒提取物，繼續(xù)培養(yǎng)26 h后剝除卵膜，在熒光顯微鏡下觀察血管生成情況。

圖5 葡萄酒2粗酚提取物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎體節(jié)間血管生成的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of wine 2 on trunk angiogenesis in zebrafish

由圖4、5可以看出，葡萄酒粗酚提取物處理斑馬魚(yú)胚胎26 h后，斑馬魚(yú)背長(zhǎng)軸血管和體節(jié)間血管基本消失，均已模糊看不出，與對(duì)照組相比，斑馬魚(yú)胚胎飲用葡萄酒粗酚提取物后背長(zhǎng)軸血管和體節(jié)間血管形態(tài)不完全或部分缺失，僅隱約能見(jiàn)背主動(dòng)脈的肉芽，且體節(jié)間血管數(shù)量較對(duì)照組明顯減少，血管生成受到明顯抑制。試驗(yàn)結(jié)果表明葡萄酒粗酚提取物具有部分抑制血管異常生成的作用，但又不影響背主動(dòng)脈和靜脈血管的完整性，即葡萄酒粗酚提取物具有抗血管生成的藥理活性，且葡萄酒1粗酚提取物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎體節(jié)間血管生成的抑制作用大于葡萄酒2。由對(duì)照組可以看出，背長(zhǎng)軸血管和體節(jié)間血管均完整，由對(duì)照組用抑制劑PTK787后的表象圖可以看出，PTK787 具有明顯抑制背長(zhǎng)軸血管和體節(jié)間血管生成的作用，使用后已經(jīng)完全看不到2種血管，說(shuō)明抑制效果非常明顯。

3 討論

斑馬魚(yú)是幅鰭亞綱鯉科短擔(dān)尼魚(yú)屬的一種熱帶淡水硬骨魚(yú)，主要分布于印度恒河流域[26]。2009年斑馬魚(yú)全基因組測(cè)序完成，斑馬魚(yú)體內(nèi)存在的人類同源基因比例高達(dá)87%，某些疾病相關(guān)基因與人類基因保守性高達(dá)99%，這意味著在其身上做藥物試驗(yàn)所得到的結(jié)果在多數(shù)情況下也適用于人體[26-28]。因此斑馬魚(yú)成為一種公認(rèn)的新型模式生物[29-30]。

抑制血管生成是抗腫瘤治療研究的熱點(diǎn)，文獻(xiàn)[31]也證實(shí)了血管生成是腫瘤生長(zhǎng)的關(guān)鍵。實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)必須依賴持續(xù)和廣泛的血管生成，無(wú)血管狀態(tài)的腫瘤極少超過(guò)2～3 mm，新生的腫瘤血管可持續(xù)不斷地為腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)及氧氣，帶走代謝產(chǎn)物，而且腫瘤血管也是腫瘤轉(zhuǎn)移的主要途徑。血管的生成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，受血管刺激因子和血管抑制因子的調(diào)節(jié)[23-24]。因此研究血管生成調(diào)節(jié)與腫瘤的關(guān)系有著重要的理論意義及臨床價(jià)值，針對(duì)腫瘤血管形成的某些因子及其關(guān)鍵步驟進(jìn)行干預(yù)，可切斷腫瘤血供及轉(zhuǎn)移途徑，對(duì)腫瘤的治療具有重要的意義。

4 結(jié)束語(yǔ)

以斑馬魚(yú)為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，表明葡萄酒能有效抑制斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的體節(jié)間血管生成。試驗(yàn)選取與血管生成關(guān)系密切的節(jié)間血管、背長(zhǎng)軸血管和肉芽作為指標(biāo)，對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的血管生成進(jìn)行研究，結(jié)果顯示葡萄皮粗酚提取物對(duì)抑制斑馬魚(yú)體節(jié)間血管生成則無(wú)明顯作用，而斑馬魚(yú)胚胎飲用 2 種葡萄酒后的體節(jié)間血管的生成明顯減少，說(shuō)明葡萄酒粗酚提取物對(duì)抑制血管生成，即對(duì)抑制腫瘤發(fā)生有一定的作用。

1 JEMAL A, SIEGEL R, WARD E, et al. Cancer statistics, 2008 [J]. CA: A Cancer Journal for Clinicians,2008, 58(2): 71-96.

2 王春陽(yáng).斑馬魚(yú)化學(xué)遺傳學(xué)篩選抑制血管生成藥物治療前列腺癌的實(shí)驗(yàn)研究[D].天津:天津醫(yī)科大學(xué),2010. WANG Chunyang. Chemical genetics screening of zebra fish experimental study on antiangiogenesis drugs for prostate cancer[D]. Tianjin: Tianjin Medical University,2010. (in Chinese)

3 楊勐航,藏遠(yuǎn)勝,李兵. 肺癌新生血管生成機(jī)制研究進(jìn)展[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,34(4):434-438. YANG Menghang, ZANG Yuansheng, LI Bing. Mechanism of lung cancer angiogenesis:recent advance[J]. Academic Journal of Second Military Medical University,2013,34(4):434-438. (in Chinese)

4 史紅梅,丁燕,孫玉霞,等.葡萄酒中多酚物質(zhì)抗氧化活性測(cè)定方法的研究[J].釀酒科技,2011(7):94-98. SHI Hongmei, DING Yan，SUN Yuxia,et al. Research on the determination of antioxidationactivity of polyphenols in grape wine[J].Liquor-making Science & Technology,2011(7):94-98. (in Chinese)

5 高川,繆冰旋,馬三梅,等.葡萄酒抗氧化的研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2013,39(5): 149-151. GAO Chuan, MIU Bingxuan,MA Sanmei, et al.Research progress of antioxidant in wine[J].Food and Fermentation Industry,2013,39(5): 149-151. (in Chinese)

6 王曉宇,杜國(guó)榮,李華.抗氧化能力的體外測(cè)定方法研究進(jìn)展[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2012,31(3):247-250. WANG Xiaoyu, DU Guorong,LI Hua. Progress of analytical methods for antioxidant capacity in vitro[J]. Journal of Food and Biotechnology,2012,31(3):247-250. (in Chinese)

7 NAKATA R, TAKAHASHI S, INOUE H. Recent advances in the study on resveratrol[J].Biological & Pharmaceutical Bulletin,2012,35(3):273-279.

8 TANGNEY C C, RASMUSSEN H E.Polyphenols, inflammation, and cardiovascular isease[J].Curremt Atherosclerosis Reports, 2013,15(5):1-10.

9 WESTERFIELD M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish[M]. Eugene: The University of Oregon Press,1993.

10 王華.葡萄酒分析檢驗(yàn)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2011.

11 張軍賢.不同整形方式對(duì)赤霞珠葡萄酒質(zhì)量的影響[D]. 楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2010:22. ZHANG Junxian.Different ways of shaping influence on quality ofCabernetsauvignonwine[D].Yangling: Northwest A&F University,2010:22. (in Chinese)

12 GB/T 15037—2006 葡萄酒[S].2006.

13 岳泰新.不同生態(tài)區(qū)釀酒葡萄與葡萄酒品質(zhì)的研究[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2015. YUE Taixin.In different ecological areas of study on quality of wine grape and wine[D].Yangling: Northwest A&F University,2015. (in Chinese)

14 孟江飛.山西鄉(xiāng)寧地區(qū)葡萄采收時(shí)間對(duì)葡萄及葡萄酒酚類物質(zhì)與抗氧化活性影響[D]. 楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2011. MENG Jiangfei. Effect of harvest time on phenolic and antioxidant properties of grape and wine in Xiangning County,Shanxi Province[D].Yangling: Northwest A&F University,2011. (in Chinese)

15 KIMMEL C B, BALLARD W W, KIMMELl S R, et al. Stages of embryonic development of the zebrafish[J]. Developmental Dynamics, 1995,203(3):253-310.

16 CHAN J, BAYLISS P E, WOOD J M, et al. Dissection of angiogenic signaling in zebrafish using a chemical genetic approach[J]. Cancer Cell, 2002,1(3):257-267.

17 BAYLISS P E, BELLAVANCE K L, WHITEHEAD G G, et al. Chemical modulation of receptor signaling inhibits regenerative angiogenesis in adult zebrafish[J]. Nature Chemical Biology,2006, 2(5):265-273.

18 李明記,李華.不同地區(qū)釀酒葡萄成熟度與葡萄酒質(zhì)量的研究[J].落葉果樹(shù),1995(1):3-6. LI Mingji,LI Hua.Wine quality in relation to maturity of wine grape grown in different regions[J]. Deciduous Fruits,1995(1):3-6. (in Chinese)

19 HAGGERTY L M.Ripening profile of grape berry acids and sugars in university of minnesota wine grape cultivars, select vitis vinifera, and other hybrid cultivars[M]. Minnesota:Dissertations & Theses-Gradworks, 2013.

20 GHOSH S,BHATEJA P,RANI J,et al.In vitro evaluation of antioxidant activity of bitter melon (MomordicacharantiaL.) [J].International Journal of Pharmtech Research,2014,6(4):1374-1382.

21 彭呂楊.七種水果提取物抗氧化和抑制腫瘤活性研究[D].天津:天津大學(xué),2014. PENG Lüyang. Investigation on antioxidant and anti-tumor capacity of seven fruits extracts[D].Tianjin:Tianjin University,2014. (in Chinese)

22 王耀焓,張培彤.腫瘤血管正?；难芯楷F(xiàn)狀[J].中國(guó)腫瘤,2015,24(6):494-500. WANG Yaohan, ZHANG Peitong. Research progress of normalization of tumor vasculature[J].Chinese Tumour,2015,24(6):494-500. (in Chinese)

23 SZALA S,JAROSZ M. Tumor blood vessels[J]. Postepy Higieny i Medycyny Dowiadczalnej,2011,65(4):437-446.

24 WU H C,CHANG D K.Peptide-mediated liposomal drug delivery system targeting tumor blood vessels in anticancer therapy[J].Journal of Oncology, 2010:723-730.

25 朱亞杰,程朋,蘇曉妹.紅景天甙對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及斑馬魚(yú)血管生成作用的研究[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2012,20(11):2239-2241. ZHU Yajie,CHENG Peng,SU Xiaomei. Effect of salidroside on proliferation of carcinoma cell and angiogenesis of zebrafish[J]. Journal of Modern Oncology,2012,20(11):2239-2241. (in Chinese)

26 LITTLETON R M, HOVE J R. Zebrafish: a nontraditional model of traditional medicine[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2013,145(3):677-685.

27 WANG C, TAO W, WANG Y, et al. Rosuvastatin, identified from a zebrafish chemical genetic screen for antiangiogenic compounds, suppresses the growth of prostate cancer[J]. European Urology,2010,58(3):418-426.

28 OAK M H, BEDOUI E L J, SCHINI-KERTH V B. Antiangiogenic properties of natural polyphenols from red wine and green tea[J]. The Journal of Nutritional Biochemistry,2005,16(1):1-8.

29 VLIEGENTHART A D B, TUCKER C S,POZO J D, et al. Zebrafish as model organisms for studying drug-induced liver injury[J].British Journal of Clinical Pharmacology,2014,78(6):1217-1227.

30 BELIAEVA N F, KASHIRTSEAVA V N, MEDVEDEVA N V, et al. Zebrafish as a model organism for biomedical studies[J].Biomeditsinskaia Khimiia,2010,56(1):120-131.

31 ABDOLLAHI A, FOLKMAN J. Evading tumor evasion: current concepts and perspectives of anti-angiogenic cancer therapy [J].Drug Resistance Updates Reviews & Commentaries in Antimicrobial & Anticancer Chemotherapy, 2010,13(13):16-28.

Effect of Crude Phenol Extract in Grape Skin and Wine on Angiogenesis Activity of Zebrafish

SUN Haiyan1,2WANG Hua3XU Zhimin4LI Hua3

(1.CollegeofFoodScienceandEngineering,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100，China2.ShaanxiKeyLaboratoryofResourceBiology,ShaanxiSci-TechUniversity,Hanzhong723000，China3.CollegeofEnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100，China4.DepartmentofFoodScience,LouisianaStateUniversity,BatonRouge,LA70803,USA)

Crude polyphenols were extracted from two types of grape skins and two wines. Total antioxidant activities and in vitro DPPH free radical scavenging activities of the extracts were evaluated. Meanwhile, the effect of those extracts on angiogenesis inhibition was investigated by using transgenic zebrafish model. After zebrafish embryos were treated with the crude polyphenol extracts for 22 h, the inhibitory effect on the intersegmental vessel (ISV) of zebrafish was investigated. The results indicated that the wines and grape skins all had in vitro antioxidant activities. However, the DPPH free radical scavenging activity and total antioxidant activity of wines were higher than those of grape skins. Wine 1 had the highest DPPH free radical scavenging activity (89.42%), which was 1.29 percentage points higher than that of wine 2. Wine 2 had the highest total antioxidant activity of 223.24 U/mL. Compared with control groups, zebrafish treated with crude polyphenol extracts of wines had significantly less ISV formation. Wine 1 had better inhibitory activity on ISV and dorsal longitudinal anastomotic vessel (DLAV) formation. However, the crude polyphenol extracts of grape skins showed little inhibitory effects on ISV and DLAV formation of zebrafish.

wine; polyphenol; antioxidant activity; zebrafish; angiogenesis

10.6041/j.issn.1000-1298.2017.01.034

2016-05-18

2016-11-19

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD31B00)、西北農(nóng)林科技大學(xué)2013年試驗(yàn)成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(XNY2013-64)和國(guó)家火炬計(jì)劃項(xiàng)目(2011GH551976)

孫海燕(1979—)，女，博士生，陜西理工大學(xué)講師，主要從事食品功能與化學(xué)研究，E-mail： diyson2008@163.com

王華(1959—)，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事葡萄與葡萄酒學(xué)研究，E-mail： wanghua@nwsuaf.edu.cn

TS201.2; R730.1

A

1000-1298(2017)01-0260-07