椰棗果醋的制備及抗氧化作用研究

王志煌，唐敏敏，陳衛(wèi)軍*，宋彥博，王富有

(1.海南大學(xué)，?？?570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所，海南 文昌 571339；3.國家重要熱帶作物工程技術(shù)研究中心，?？?571101)

椰棗果醋的制備及抗氧化作用研究

王志煌1，唐敏敏2,3，陳衛(wèi)軍1*，宋彥博1，王富有2,3

(1.海南大學(xué)，?？?570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所，海南 文昌 571339；3.國家重要熱帶作物工程技術(shù)研究中心，海口 571101)

文章采用液體發(fā)酵法制得椰棗果醋，并探討了在發(fā)酵過程中可溶性固形物、還原糖、酒精的變化，還測定了其對羥自由基、DPPH自由基、ABTS+自由基等的清除力以及對三價(jià)鐵離子的還原力。結(jié)果表明：在20 ℃下，椰棗汁發(fā)酵為椰棗酒的過程中，可溶性固形物、還原糖隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而降低，并在第12天時(shí)，還原糖降為0；酒精度則隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而增加。在本次發(fā)酵結(jié)束后，其總酚含量為1.437 mg/mL，總酸含量為8.628 g/100 g。椰棗果醋的羥自由基清除率在2%濃度時(shí)達(dá)到90%，DPPH自由基清除率在8%時(shí)達(dá)到97%，ABTS+自由基清除率在40%時(shí)達(dá)到92%。椰棗果醋擁有良好的抗氧化活性，具有開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。

椰棗果醋；液體發(fā)酵；物質(zhì)變化；抗氧化

椰棗(date palm)，又名海棗、伊拉克棗、波斯棗，是椰棗樹的果實(shí)，含有對人體有用的多種維生素和天然糖分，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值[1]。椰棗對阿拉伯人的生活至關(guān)重要，是沙特阿拉伯等中東地區(qū)的主要糧食作物，年產(chǎn)量超過450萬噸，在確保阿拉伯國家糧食安全和生態(tài)安全中發(fā)揮著重要作用。但是，椰棗加工產(chǎn)業(yè)起步晚，現(xiàn)有產(chǎn)品種類單一，且技術(shù)含量不高，嚴(yán)重影響了椰棗產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展。

果醋是利用水果及水果下腳料通過微生物發(fā)酵得到的一類新型飲品，多項(xiàng)研究[2]指出：因果醋發(fā)酵條件比較溫和，能夠有效保留果品中的營養(yǎng)成分和多酚類活性物質(zhì)，同時(shí)，微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了多種活性物質(zhì)，如琥珀酸等有機(jī)酸，這些物質(zhì)都具有一定的抗氧化能力，這使得果醋的抗氧化潛力值得開發(fā)研究。

本研究以椰棗果實(shí)為原料，研究了果醋發(fā)酵過程中的物質(zhì)變化及終產(chǎn)品的主要化學(xué)物質(zhì)含量，并對其抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為椰棗產(chǎn)品的深加工提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

椰棗 阿聯(lián)酋，F(xiàn)aud；菌種 酵母菌(安琪酵母)、醋酸菌(安琪酵母)；無水乙醇、3,5-二硝基水楊酸、ABTS、水楊酸、沒食子酸、DPPH、重鉻酸鉀 分析純，阿拉丁試劑；鐵氰化鉀、硫酸鐵銨 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑股份有限公司；Folin-Ciocalteu 分析純，廣州市生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

X1R臺(tái)式離心機(jī) Themo Scientific Heraeus Multifuge；DK98-Ⅱ恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司； N25紫外可見分光光度儀 上海精科儀器有限公司；XFB-400粉碎機(jī) 吉首市中誠制藥機(jī)械廠；SPX-250B-Z型培養(yǎng)箱 上海博訊試液有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 椰棗果醋釀造

椰棗果實(shí)→去核→加水打漿→用0.2%酶酶解→過濾→100 ℃滅菌15 min→自然冷卻至室溫→添加釀酒酵母(添加量為0.02%)→20 ℃發(fā)酵→還原糖完全消耗時(shí)，添加醋酸菌(添加量為0.02%)，20 ℃發(fā)酵→以酸度不再變化為發(fā)酵終點(diǎn)。

1.3.2 還原糖測定[3]

采用DNS法。

1.3.3 乙醇含量

采用重鉻酸鉀比色法[4]。

1.3.4 可溶性固形物

采用手持折光儀測定。

1.3.5 總酚測定

Folin-Ciocalteu 酚法[5]。

1.3.5.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

Folin-Ciocalteu 試劑：取2 mol/L Folin-Ciocalteu 試劑10 mL，加蒸餾水 90 mL，充分混勻，得0.2 mol/L的Folin-Ciocalteu試劑，共100 mL。

質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的Na2CO3溶液：精密稱取10.0 g無水Na2CO3，用蒸餾水溶解后，定容至100 mL。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液：稱取0.0050 g，用蒸餾水溶解并定容至50 mL，得到濃度為0.10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。

操作方法：分別精密吸取0，1，2，3，4，5 mL于10 mL比色管中，加入2.0 mL Folin-Ciocalteu 試劑，混勻，5 min后加入1 mL 1.0%的碳酸鈉溶液，加水補(bǔ)足至10 mL，充分混勻后，室溫反應(yīng)1 h，在700 nm下測定吸光度,以蒸管水做空白調(diào)零。

1.3.5.2 樣品測定

分別配制濃度為0.01%，0.1%，1%，10%，40%，60%，100%的樣品各5 mL。取2 mL待測液于10 mL比色管中，再加入2 mL Folin-Ciocalteu 試劑，搖勻，5 min后加入1 mL 1.0%的碳酸鈉溶液，加水補(bǔ)足至10 mL，充分混勻后，室溫反應(yīng)1 h，在700 nm下測定吸光度，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其總酚含量。

1.3.6 總酸測定[6，7]

1.3.7 羥自由基清除率[8-10]

本體系利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由，即H2O2與Fe2+混合后產(chǎn)生·OH，當(dāng)體系存在水楊酸時(shí)，能有效俘獲·OH當(dāng)體并生成紅色產(chǎn)物，此物質(zhì)在510 nm處有最大吸收。根據(jù)文獻(xiàn)[8-11]，修改如下：依次向試管中加入0.5 mL FeSO4溶液(0.15 mol/L)，2 mL水楊酸鈉溶液(2 mmol/L)，2.5 mL蒸餾水和1 mL不同體積分?jǐn)?shù)(0，2%，4%，6%，8%，10%，20%，40%，60%，80%，100%)的椰棗醋，最后加入1 mL H2O2(6 mmol/L)啟動(dòng)反應(yīng)，37 ℃下反應(yīng)1 h，離心取上清液于510 nm處測吸光度。按下式計(jì)算清除率：

式中：E為羥自由基清除率，%；A0為空白對照液的吸光度；Ai為對照-加入樣品后的吸光度；Aj為樣品溶液的本底吸光度。

1.3.8 DPPH自由基清除率：

根據(jù)文獻(xiàn)[11]和[13]，修改如下：準(zhǔn)確移取5 mL DPPH溶液(DPPH 6.0 mol/L)，加入0.6 mL不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0，2%，4%，6%，8%，10%，20%，40%，60%，80%，100%)的樣液，混勻，黑暗中放置30 min后，離心取上清液，517 nm處測吸光度。按下式計(jì)算DPPH自由基的清除率：

式中：E為DPPH自由基清除率，%；A0為蒸餾水加DPPH溶液的吸光度；Ai為樣液加DPPH溶液的吸光度；Aj為樣液加乙醇溶劑的吸光度。

1.3.9 Fe3+還原力測定[14]

操作方法：在試管中分別加入0.5 mL不同濃度的樣品。同時(shí)加入1.0 mL的磷酸緩沖液(0.2 mol/L，pH 6.8)和2.0 mL 1%的鐵氰化鉀溶液?；旌衔镉?0 ℃水浴20 min后加入1.0 mL 10%的三氯乙酸，室溫靜置10 min。取2.5 mL反應(yīng)液，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%的氯化鐵溶液。反應(yīng)10 min后測定700 nm處的吸光值，該值越高說明樣品的還原性越強(qiáng)，以Vc為陽性對照。

1.3.10 ABTS+法測定總抗氧化能力[15-18]

將5 mL 7 mmol/L ABTS鹽溶液和88 μL 140 mmol/L過硫酸鉀混勻于試管中，在室溫、避光的條件下靜置過夜，形成ABTS+自由基儲(chǔ)備。按1∶50的比例用超純水稀釋，使其在30 ℃，734 nm波長處的吸光度為0.74±0.02。在樣品管中加入200 μL樣品液和3 mL ABTS溶液，對照管用超純水代替ABTS溶液，空白管用蒸餾水代替樣品溶液。以上3組在室溫、避光條件下放置1 h，于734 nm處測定其吸光值。

計(jì)算公式如下:

2 結(jié)果與討論

2.1 酒精發(fā)酵過程中還原糖含量變化

圖1 酒精發(fā)酵過程中還原糖含量變化

由圖1可知，發(fā)酵過程中還原糖含量不斷呈下降趨勢，發(fā)酵開始時(shí)含量為135 g/L，在發(fā)酵進(jìn)行12天時(shí)本次發(fā)酵還原糖消耗完畢。釀酒酵母通過糖酵解等途徑的代謝作用將還原糖轉(zhuǎn)化為酒精以及一些有機(jī)酸等發(fā)酵產(chǎn)物，還原糖含量曲線可以一定程度上反映發(fā)酵活動(dòng)的活躍程度。

2.2 酒精發(fā)酵過程中乙醇含量變化

圖2 酒精發(fā)酵過程中乙醇含量變化

由圖2可知，酒精發(fā)酵過程中乙醇含量不斷呈上升趨勢，在發(fā)酵進(jìn)行12天左右達(dá)到10%左右。果醋的乙醇含量在10%左右酵母菌仍然能夠生長繁殖，如果發(fā)酵原料未消耗完畢，乙醇含量有可能會(huì)繼續(xù)上升。

2.3 酒精發(fā)酵過程中可溶性固形物含量變化

在20 ℃下發(fā)酵的椰棗醋的可溶性固形物含量見圖3。

圖3 酒精發(fā)酵過程中可溶性固形物含量變化

由圖3可知，可溶性固形物含量呈下降趨勢，并且在發(fā)酵跟蹤檢測的12天中可溶性固形物從22 °Brix下降到12.1 °Brix?？扇苄怨绦挝锇殡S著發(fā)酵進(jìn)行而消耗，但到發(fā)酵結(jié)束時(shí)仍具有較高的可溶性固形物含量。

2.4 總酚含量

椰棗醋發(fā)酵完成后總酚含量通過Folin-Ciocalteu 酚法測定為1.437 mg/mL。果醋經(jīng)歷二次發(fā)酵會(huì)導(dǎo)致多酚類物質(zhì)有一定損失，但仍具有較高的多酚含量。

2.5 椰棗總酸含量

總酸經(jīng)過GB/T 12456-2008酸堿滴定法測定為7.727 g/dL(換算乙酸系數(shù)0.060)，符合ZBX 66004-86《液態(tài)法食醋質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(≥3.5 g/dL，以醋酸計(jì))。與之相比，各種果醋的總酸含量沙棘果醋為12.6 g/dL，柿子醋為4.4 g/dL，蘋果醋為5.58 g/dL，陳醋為9.75 g/dL。

2.6 椰棗體外抗氧化能力

2.6.1 清除羥自由基(·OH)能力

圖4 椰棗醋清除羥自由基(·OH)能力

由圖4可知，椰棗果醋對羥自由基具有極其優(yōu)良的清除能力，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，其清除能力隨濃度增加而增強(qiáng)。當(dāng)果醋體積分?jǐn)?shù)在0.8%左右時(shí)，清除率約為50%。隨著濃度增大至2%時(shí)，果醋對羥自由基的清除率高達(dá)90%。 當(dāng)濃度大于4%時(shí)，椰棗醋對羥自由基的清除率達(dá)到100%。與之相對應(yīng)的Vc在40 μg/mL時(shí)已達(dá)到50%左右的羥自由基清除率，并在100 μg/mL時(shí)對羥自由基的清除率達(dá)到87%。因此對于羥自由基的清除能力，每1 mL果醋中約相當(dāng)于含有5 mg/mL的Vc。

2.6.2 清除DPPH自由基能力

DPPH自由基是一種很穩(wěn)定的自由基，是以氮為中心，特點(diǎn)是可以捕獲“清除”其他的自由基。如果受試物能將其清除，則意味著受試物具有降低烷自由基或過氧化自由基的能力，同時(shí)能打斷脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)的作用。

圖5 椰棗醋清除DPPH自由基能力

由圖5可知，椰棗醋在濃度為2%時(shí)對于DPPH自由基清除率約為50%，在8%時(shí)達(dá)到97%的清除率。與之相比，Vc在6 μg/mL時(shí)清除率約為50%左右，而在80 μg/mL時(shí)達(dá)到95%的清除率。因此，對于DPPH自由基清除能力，每1 mL果醋中約相當(dāng)于含有1 mg/mL的Vc。

2.6.3 Fe3+還原力

當(dāng)一種物質(zhì)具有較強(qiáng)的還原能力時(shí)，相應(yīng)地也具有較強(qiáng)的抗氧化能力。若樣液在700 nm處吸光值越大，則其將Fe3+轉(zhuǎn)化Fe2+的量及生成的普魯士藍(lán)的量越多，表明其還原能力越強(qiáng)，即抗氧化能力越好。

圖6 椰棗醋Fe3+還原力

由圖6可知，椰棗醋的還原能力相對較高。椰棗醋在20%濃度時(shí)吸光值為2.5，應(yīng)是此次試驗(yàn)體系飽和值。Vc在100 μg/mL時(shí)吸光值為1.2。

2.6.4 ABTS+法測定總抗氧化能力

ABTS+自由基清除法被廣泛用于生物樣品的總抗氧化能力測定。在反應(yīng)體系中，經(jīng)氧化后生成相對穩(wěn)定的藍(lán)綠色的水溶性自由基?？寡趸瘎┡c自由基反應(yīng)后使其溶液褪色，特征吸光度降低，吸光度越低表明所檢測物質(zhì)的總抗氧化能力越強(qiáng)。

圖7 椰棗醋和Vc的ABTS+總抗氧化能力

由圖7可知，椰棗醋的清除率在濃度為10%時(shí)達(dá)到50%左右，在濃度為40%時(shí)趨于穩(wěn)定并達(dá)到92%。同比，Vc清除率在40 μg/mL左右達(dá)到56%，在80 μg/mL時(shí)達(dá)到穩(wěn)定，并達(dá)到93%左右。因此，對于ABTS+自由基清除能力，每1 mL果醋中約相當(dāng)于含有200 μg/mL的Vc。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)制備的椰棗醋總酚含量為1.437 mg/mL，總酸含量為8.628 g/100 g。此外，在發(fā)酵過程中還原糖和可溶性固形物含量不斷降低，乙醇含量不斷增多。清除羥基自由基、ABTS+自由基法測定總抗氧化能力、Fe3+還原力測定以及清除DPPH自由基能力的測定結(jié)果表明：椰棗果醋原醋抗氧化活性極好，并具有良好的調(diào)配潛力，很有開發(fā)價(jià)值。

后續(xù)試驗(yàn)擬進(jìn)行椰棗醋發(fā)酵條件優(yōu)化來保護(hù)原椰棗汁中的有效成分，或通過淺度發(fā)酵果酒并制備醋酸含量相對較低的椰棗果醋來縮短發(fā)酵時(shí)間以保護(hù)楊梅汁中的酚類成分，使椰棗果醋抗氧活性進(jìn)一步提高。

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Research on Preparation and Antioxidant Activities of Date Palm Fruit Vinegar

WANG Zhi-huang1,TANG Min-min2,3,CHEN Wei-jun1*,SONG Yan-bo1,WANG Fu-you2,3

(1.Hainan University, Haikou 570228, China;2.Coconut Research Institute of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Wenchang 571339,China;3.National Center of Important Tropical Crops Engineering and Technology Research, Haikou 571101, China)

Discuss the changes of soluble solids, reducing sugar and alcohol in the process of liquid fermentation of date palm fruit vinegar. The fruit vinegar is researched using four different methods: hydroxyl radical scavenging,1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging, ABTS+radical scavenging and reducing capacity assay. The results show that soluble solids and reducing sugar are decreased with the increase of fermentation time in the fermentation process of date palm fruit vinegar under 20 ℃.In addition, reducing sugar runs out after 12 days. However, alcohol concentration increases with time. After the fermentation, the total polyphenols content is 1.437 mg/mL; the total acid content is 8.628 g/100 g. The antioxidant capacity of date palm fruit vinegar is significant. The hydroxyl radical scavenging rate is 90% when the testing concentration is 2%.The DPPH radical scavenging rate is 97% when the testing concentration is 8%, and the ABTS+radical scavenging power is 92% when the testing concentration is 40%. Strategically, the date palm fruit vinegar has potential application value because of its favorable antioxidant power.

date palm fruit vinegar;liquid fermentation; material changes; antioxidant

2016-08-11 *通訊作者

寧夏自治區(qū)科技特派員項(xiàng)目

王志煌(1991-)，男，福建泉州人，碩士，研究方向：食品工程。

TS264.22

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.01.012

1000-9973(2017)01-0052-05