熱反應(yīng)豬肉香精的制備及其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析

崔曉紅，馬力，劉平

(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，成都 610039)

熱反應(yīng)豬肉香精的制備及其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析

崔曉紅，馬力*，劉平

(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，成都 610039)

文章主要以新鮮的豬瘦肉為原料，以水解度及對熱反應(yīng)產(chǎn)物的感官評定作為評價(jià)指標(biāo)，研究了不同的酶解條件對豬肉香精的影響，并通過正交試驗(yàn)優(yōu)化了酶解工藝條件。結(jié)果顯示：豬肉最佳的酶解條件為木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的比例1∶1(W/W)，總加酶量0.8%，最佳酶解時(shí)間3 h。最后采用固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(SPME-GC-MS)對所制備的豬肉香精中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，得出結(jié)論：揮發(fā)性香氣成分主要為呋喃類、醛類、烴類、酮類、噻吩和噻唑類等，其中呋喃類、醛類、酮類對豬肉香氣貢獻(xiàn)大。

熱反應(yīng)；豬肉香精；蛋白酶；揮發(fā)性香氣成分

肉味香精是食用香精的一類，按制備方法分為調(diào)配型香精和反應(yīng)型香精[1]。近40年來，熱反應(yīng)肉味香精得到了迅速的發(fā)展，且已形成獨(dú)立的產(chǎn)業(yè)。目前，我國肉味香精的生產(chǎn)企業(yè)已有150多家，年產(chǎn)量達(dá)到8000多噸[2]。我國食品工業(yè)“九五”計(jì)劃和“2010”規(guī)劃提出把方便營養(yǎng)食品和熟肉制品列為重點(diǎn)發(fā)展項(xiàng)目，肉類香精必然有很大的發(fā)展?jié)摿3]。熱反應(yīng)型肉味香精具有香氣自然、醇厚逼真、成本低等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到食品廠商及消費(fèi)者的喜愛，市場份額及發(fā)展空間也越來越大。我國肉類香精行業(yè)起步較晚，生產(chǎn)技術(shù)水平與國外相比還有很大差距。尤其在熱反應(yīng)肉味香精的形成途徑、機(jī)制等方面的研究相對比較落后，在風(fēng)味形成的控制方面存在盲區(qū)，造成產(chǎn)品的品質(zhì)差，且不穩(wěn)定[4-6]。

研究以豬瘦肉為原料，采用木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶四種水解酶，研究不同的酶解條件對水解度和熱反應(yīng)豬肉香精風(fēng)味的影響，確定最佳酶解工藝條件，并對豬肉香精的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，為熱反應(yīng)豬肉香精的生產(chǎn)工藝及風(fēng)味研究提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 原料與試劑

豬瘦肉、豬油(食用級) 市購；HVP(水解植物蛋白)、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶(均為食品級)、半胱氨酸(分析純) 上海華津生物科技有限公司；硼酸、乙醇、鹽酸、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、無水碳酸鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉、葡萄糖(均為分析純) 成都市科龍化工試劑廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

TB-214型電子天平 北京塞多利斯天平有限公司；DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；DF-101S型油浴鍋 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；75 μm CAR/PDMS固相微萃取頭 美國Supelco公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS) 日本島津公司；PHS-3C型酸度計(jì) 方舟科技有限公司；KDN-1型自動凱氏定氮儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHZ-GW恒溫振蕩水浴鍋 金壇市精達(dá)儀器制造有限公司；TDZ5-WS低速離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豬肉酶解工藝

稱取一定量豬肉，按肉水比1∶2配成混合液，置于150 mL錐形瓶中，在恒溫振蕩水浴鍋中振蕩酶解。選擇不同蛋白酶或其組合，酶解溫度為55～60 ℃，在各酶最適pH條件下進(jìn)行酶解，酶解后升溫至85 ℃左右，滅酶10 min。

1.3.2 制備方法

熱反應(yīng)配方：酶解液30 g，酵母膏5 g，HVP液10 g，半胱氨酸0.8 g，VB10.25 g，葡萄糖1 g，木糖0.2 g，氧化豬脂5 g，在熱反應(yīng)瓶中配好，然后將熱反應(yīng)瓶放入油浴鍋內(nèi)，同時(shí)打開磁力攪拌器，在100 ℃的條件下反應(yīng)1 h，冷卻后對產(chǎn)物進(jìn)行感官評價(jià)。

1.3.3 單一蛋白酶的選擇

將豬肉勻漿液先調(diào)pH至各酶的最適pH，然后分別采用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶，用量為0.8%，酶解溫度為55～60 ℃，在自然pH下酶解2 h，測定酶解物的水解度，并對酶解液按熱反應(yīng)配方進(jìn)行熱反應(yīng)，對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行感官評價(jià)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，確定較佳的單一蛋白酶。

1.3.4 復(fù)合蛋白酶酶解條件的選擇

1.3.4.1 最佳復(fù)合蛋白酶的選擇

將3種蛋白酶分別與風(fēng)味蛋白酶復(fù)合對豬肉進(jìn)行酶解，每種酶的用量均為0.4%，酶解溫度為55～60 ℃，在自然pH下酶解2 h，測定酶解物的水解度，并對酶解液按熱反應(yīng)配方進(jìn)行熱反應(yīng)，對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行感官評價(jià)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，確定較佳的復(fù)合蛋白酶。

1.3.4.2 復(fù)合蛋白酶酶配比的確定

將上述選出的較佳復(fù)合酶的復(fù)配比例(W/W)設(shè)為3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，酶解溫度為55～60 ℃，在自然pH下酶解2 h，測定酶解物的水解度，并對熱反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行感官評價(jià)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，確定較佳的酶配比。

1.3.4.3 復(fù)合蛋白酶總加酶量的確定

將兩種蛋白酶按最佳酶配比進(jìn)行酶解，酶解溫度為55～60 ℃，在自然pH下酶解2 h，總加酶量分別為0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%，測定酶解產(chǎn)物的水解度，對熱反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行感官評價(jià)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，確定較佳的總加酶量。

1.3.4.4 復(fù)合蛋白酶酶解時(shí)間的確定

將兩種蛋白酶按最佳酶配比和最佳總加酶量進(jìn)行酶解，酶解溫度控制在55～60 ℃，在自然pH下，酶解時(shí)間分別設(shè)定為1，2，3，4，5 h。測定酶解產(chǎn)物的水解度，對熱反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行感官評價(jià)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，確定較佳酶解時(shí)間。

1.3.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝條件

選擇L9(33)正交表對酶配比、總加酶量、酶解反應(yīng)時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行正交優(yōu)化，因素及水平表見表1[7]。

表1 蛋白酶酶解正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.6 豬脂氧化

準(zhǔn)確稱取8.0 g豬脂，然后將稱取好的豬脂放在電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，在120 ℃的條件下自然氧化7 h[8]。

1.3.7 檢測方法

蛋白質(zhì)含量測定：具體見GB 5009.5-2010[9]；水解度測定：采用甲醛滴定法[10]。

1.3.8 香氣感官評定

由8位品評人員對產(chǎn)品香氣進(jìn)行感官評定，8位品評人員均為食品相關(guān)專業(yè)人員，并且在感官評價(jià)之前對其進(jìn)行了豬肉香精感官評價(jià)的培訓(xùn)，足以對豬肉香精進(jìn)行準(zhǔn)確的評價(jià)。感官評定標(biāo)準(zhǔn)見表2[11]。最后取8人的平均分作為最終得分。

表2 豬肉香精感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.9 固相微萃取法提取香氣成分

在固相微萃取頂空瓶中加入5 mL樣品，放入磁力攪拌子，在磁力攪拌器下于50 ℃恒溫條件下平衡30 min。將老化好的萃取頭插入頂空瓶2 cm左右處，于50 ℃吸附30 min。

1.3.10 GC-MS 分析

GC條件：用氦氣作載氣，流速為1 mL/min。升溫程序：色譜柱起始柱溫30 ℃，保持2 min，以3 ℃/min升到60 ℃，隨后以5 ℃/min升到120 ℃，再以10 ℃/min升到230 ℃，然后在230 ℃下保持5 min。質(zhì)譜條件：電離方式為EI，離子源溫度為220 ℃，接口溫度達(dá)250 ℃，分流比5∶1，溶劑延遲時(shí)間1 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一蛋白酶的確定

表3 不同單一蛋白酶對水解度及產(chǎn)物香氣的影響

由表3可知，在相同的酶解條件下，3種蛋白酶的水解度大小為堿性蛋白酶>中性蛋白酶>木瓜蛋白酶。但從產(chǎn)物的感官評價(jià)看，木瓜蛋白酶的酶解液熱反應(yīng)產(chǎn)物的感官得分最高，而堿性蛋白酶熱反應(yīng)產(chǎn)物有生腥味，香氣不協(xié)調(diào)，從而選定木瓜蛋白酶為較佳的單一蛋白酶。但從整體上看，經(jīng)單酶酶解的所有產(chǎn)物的肉香都不是很突出，原因可能是單蛋白酶酶解位點(diǎn)單一，并不利于底物短肽及氨基酸的形成。風(fēng)味酶為外肽酶加內(nèi)肽酶，即可以通過內(nèi)切的作用來切斷肽鏈內(nèi)部的肽鍵，從而形成短鏈肽，也可以通過外切從多肽鏈的末端切斷釋放一個(gè)氨基酸，從而把苦肽徹底降解為氨基酸[12]。因此，考慮將風(fēng)味蛋白酶和其他3種蛋白酶復(fù)配進(jìn)行酶解。

2.2 復(fù)合蛋白酶酶解條件的確定

2.2.1 最佳復(fù)合酶選擇

表4 復(fù)配酶的種類對水解度及產(chǎn)物香氣的影響

由表4和表3對比可知，風(fēng)味蛋白酶與其他3種蛋白酶復(fù)配酶解比單一蛋白酶酶解的效果更好。水解度方面有了明顯的提高，說明復(fù)配后酶切位點(diǎn)增多，更有利于豬肉的酶解，并且提高了產(chǎn)物的香氣評分值。風(fēng)味蛋白酶與堿性蛋白酶復(fù)配所得酶解液的水解度最大，而風(fēng)味蛋白酶與中性蛋白酶復(fù)配所得酶解液的水解度最小。結(jié)合熱反應(yīng)產(chǎn)物的感官評價(jià)，可知木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶復(fù)配時(shí)，所得最終產(chǎn)物的感官評分最好。因此，選擇木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶作為復(fù)配蛋白酶。

2.2.2 最佳酶配比選擇

圖1 酶配比對水解度及產(chǎn)物香氣的影響

由圖1可知，隨著木瓜蛋白酶含量減少，風(fēng)味蛋白酶含量增大，水解度和產(chǎn)物的感官評分均先上升后下降，并且可以看出木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的復(fù)配比為1∶1時(shí)水解度最大，此時(shí)所得的最終熱反應(yīng)產(chǎn)物肉感飽滿，肉香和脂香突出且香氣濃郁協(xié)調(diào)，得分最高。所以，最終選擇酶配比1∶1，這樣熱反應(yīng)產(chǎn)物的香氣最好。

2.2.3 總加酶量的選擇

圖2 總加酶量對水解度及產(chǎn)物香氣的影響

由圖2可知，總加酶量增加，水解度也越來越大，原因可能是增加的酶量對于底物質(zhì)量比來說并未飽和，隨著加酶量的增大，酶解反應(yīng)速率及蛋白質(zhì)的水解率也不斷增大。產(chǎn)物感官評分方面，當(dāng)加酶量由0.4%增加到0.6%時(shí)，評分值呈上升趨勢；但加酶量超過0.6%后，評分值反而逐漸下降。其中，加酶量為0.6%時(shí)熱反應(yīng)產(chǎn)物肉味突出，且香氣協(xié)調(diào)度好；加酶量為0.8%，1.2%時(shí)產(chǎn)物出現(xiàn)了輕微的硫臭味及刺激性氣味，這可能與水解出一定量的苦味肽有關(guān)[13]。所以，選擇0.6%的總加酶量，這時(shí)熱反應(yīng)產(chǎn)物香氣最好。

2.2.4 最佳酶解時(shí)間的選擇

圖3 酶解時(shí)間對水解度及產(chǎn)物香氣的影響

由圖3可知，在酶解物的水解度方面，隨著酶解時(shí)間的增加，水解度不斷增大，酶解時(shí)間在1～3 h內(nèi)，水解度的增加速度很快，而3～5 h內(nèi)增長速度趨于平緩。從熱反應(yīng)產(chǎn)物感官評價(jià)上看，酶解時(shí)間在1～3 h內(nèi)香氣越來越濃，并且特征香氣明顯增加，但在3～5 h內(nèi)香氣的品質(zhì)開始下降，可能是因?yàn)榉磻?yīng)時(shí)間過長，美拉德反應(yīng)產(chǎn)生了一些短肽類的苦味物質(zhì)及硫臭味物質(zhì)[14]。所以，將酶解時(shí)間定在3 h為宜，此時(shí)產(chǎn)物的感官評分值最高，香氣最佳。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝條件

表5 酶解正交試驗(yàn)結(jié)果

由表5可知，極差大小順序?yàn)镽A>RB>RC，所以各因素主次順序?yàn)锳(酶配比)> B(總加酶量)> C(酶解時(shí)間)，所得的最優(yōu)方案為A2B3C2，即酶配比為1∶1、總加酶量為0.8%、酶解時(shí)間為3 h，在此酶解條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到豬肉酶解液的水解度為32.52%，所制備的豬肉香精肉感飽滿，特征香氣突出，整體的協(xié)調(diào)度好，且使人愉悅，香氣評分值可達(dá)到93分。

2.4 熱反應(yīng)豬肉香精中的揮發(fā)性風(fēng)味分析

所得最佳熱反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)GC-MS分析，分離鑒定出的風(fēng)味物質(zhì)組成與相對峰面積見表6。

表6 豬肉香精揮發(fā)性風(fēng)味成分鑒定結(jié)果

由表6可知，經(jīng)GC-MS分析后，共檢測出54種揮發(fā)性風(fēng)味成分，主要包括烴類(6種)、酮類(3種)、醛類(9種)、醇類(9種)、呋喃類(5種)、吡咯、吡嗪、噻吩及噻唑類(5種)、其他化合物(4種)。在檢出的揮發(fā)性風(fēng)味成分中，羰基化合物對豬肉香精特征風(fēng)味的形成十分重要[15]。

所鑒定出的醛類化合物能夠賦予豬肉香精清香、果香和堅(jiān)果的芳香氣味，例如苯甲醛具有令人愉快的杏仁香、堅(jiān)果香和水果香。醛類主要來自于脂肪氧化和氨基酸反應(yīng)，所檢測出的苯甲醛主要來自于脂肪氧化，其中(E，E)-2，4-壬二烯醛是由不飽和脂肪酸氧化所得，壬醛(清香)、己醛(清香、草香)等共同形成了豬肉香氣的主要特征成分[16]。

雜環(huán)類化合物是肉中最重要的呈味物質(zhì)，它們主要來源于氨基酸和還原糖之間的美拉德反應(yīng)，多數(shù)雜環(huán)類化合物具有肉香味。本次鑒定出的雜環(huán)類化合物比較少，主要有5-甲基-2-噻吩甲醛等。噻吩類物質(zhì)是美拉德反應(yīng)前期階段生成的，噻吩類化合物風(fēng)味特征比較顯著，對肉的總體風(fēng)味具有最基本的貢獻(xiàn)。呋喃類化合物主要經(jīng)美拉德反應(yīng)由1，2-烯醇產(chǎn)生，對肉香的生產(chǎn)貢獻(xiàn)顯著，是肉風(fēng)味形成作用的最大化合物之一。

3 結(jié)論

豬肉酶解時(shí)酶的選擇對豬肉香精有一定的影響，本研究確定的復(fù)配酶為風(fēng)味蛋白酶與木瓜蛋白酶。通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，確定了酶解條件最佳酶配比：木瓜蛋白酶∶風(fēng)味蛋白酶為1∶1；總加酶量為0.8%；最佳酶解時(shí)間為3 h。對熱反應(yīng)產(chǎn)物的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了鑒定，結(jié)果共檢測出54種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，主要包括呋喃類、醛類、烴類、酮類、噻吩類和噻唑類，其中呋喃類、醛類、酮類對豬肉香精的香氣貢獻(xiàn)大。

[1]牛云蔚,肖作兵,朱建才,等.一種耐高溫型豬肉香精的制備技術(shù)研究[J]. 食品工業(yè),2011(10):73-75.

[2]沈軍衛(wèi).大豆蛋白酶解物制備豬肉香精的研究[D].洛陽：河南科技大學(xué),2010.

[3]陳坤,宋煥祿.肉味香精的研究概況及其應(yīng)用[J].食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào),2004,22(2):1-4.

[4]朱新生,霄霖,劉立國.熱反應(yīng)肉類香精反應(yīng)底物——豬肉酶解物制備的研究[J].中國調(diào)味品,2005 (1):7-11.

[5]李沛,劉政,芳李庫.酵母抽提物應(yīng)用研究新進(jìn)展[J].中國食品添加劑,2006(c00):124-129.

[6]Mottram D S.The effect of cooking conditions on the formation of volatile heterocyclic compounds in pork [J].J. Sci. Food Agric,1985,36:377-382.

[7]陳海濤.雞肉酶解工藝對熱反應(yīng)雞肉香精香氣的影響[J]. 食品科學(xué),2013,34(9):150-154.

[8]趙文紅,白衛(wèi)東,汪薇,等.豬肉香精生產(chǎn)中脂肪氧化的應(yīng)用研究[J]. 中國食品學(xué)報(bào),2009,9(2):132-137.

[9]GB 5009.5-2010,食品中蛋白質(zhì)的測定[S].

[10]王劍鋒,孫爽,李瑤, 等.甲醛滴定法測定牛血清白蛋白的酶解度[J].大連民族學(xué)院學(xué)報(bào),2012,14(5):441-444.

[11]孫佳,王超,曹雁平，等.雙酶法豬脂氧化改善天然豬肉香精風(fēng)味的應(yīng)用[J].食品科學(xué),2012(16):84-90.

[12]朱俊,童軍茂,周曉宏，等.豬肉酶解對熱反應(yīng)豬肉香精香氣的影響[J].食品工業(yè)科技,2009, 30(5):203-204.

[13]Taylor A J. The basic chemistry and process conditions underpinning reaction flavor production[J].Food Flavor Technology,2002(5):27-58.

[14]Wu Y G, Cadwallader K R. Characterization of the aroma of a meatlike process flavoring from soybean-based enzyme-hydrolyzed vegetable protein[J].Journal of Agricultral and Food Chemistry,2002,50(10):2900-2907.

[15]綦艷梅,孫金沅,陳海濤，等.美拉德反應(yīng)制備醬牛肉香精的揮發(fā)性成分分析[J].食品科學(xué),2012,33(8):199-202.

[16]錢敏,白衛(wèi)東,趙文紅，等.SPME-GC-MS法分析豬肉味香精中的揮發(fā)性成分[J].中國食品添加劑,2011(6):141-147.

Preparation of Pork Flavor by Thermal Reaction and Analysis of Its Volatile Flavor Compounds

CUI Xiao-hong, MA Li*, LIU Ping

(School of Food and Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China)

With fresh pig lean meat as the raw material, the degree of hydrolysis and sensory evaluation of thermal reaction products as the evaluation indicator, study the influence of different hydrolysis conditions to pork flavor. The enzymatic hydrolysis conditions of thermal reaction are optimized through orthogonal experiment. The results show that the optimal hydrolysis conditions are as follows: the ratio of papain and flavourzyme is 1∶1 (W/W), the total amount of enzyme is 0.8%, and the best hydrolysis time is 3 h. In the end, use the SPME and GC-MS technology to analyze the volatile flavor components of pork flavor. It is concluded that the volatile aroma components mainly are furans, aldehydes, hydrocarbons, ketones, thiophene and thiazole, etc., and the furans, aldehydes and ketones have great contribution on pork aroma.

thermal reaction; pork flavor; protease; volatile aroma components

2016-07-07 *通訊作者

崔曉紅(1991-)，女，碩士，研究方向：食品風(fēng)味化學(xué)； 馬力(1956-)，男，教授，研究方向：食品生物技術(shù)。

TS202.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.01.011

1000-9973(2017)01-0047-05