神經(jīng)突起生長因子蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其臨床意義

童瑩，張嶠，單莉

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肺內(nèi)一病區(qū)，新疆省烏魯木齊市830011）

臨床論著

神經(jīng)突起生長因子蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其臨床意義

童瑩，張嶠，單莉

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肺內(nèi)一病區(qū)，新疆省烏魯木齊市830011）

目的探討Neuritin蛋白在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性。方法收集在該院行手術(shù)切除的87例NSCLC組織及其對應(yīng)的87例癌旁組織，采用免疫組織化學(xué)法檢測癌及癌旁組織中神經(jīng)突起生長因子（Neuritin）蛋白的表達(dá)，并根據(jù)二級計分法將其分為低表達(dá)和高表達(dá)部分，分析Neuritin蛋白表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)[病理類型、分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移、表皮生長因子受體（EGFR）表達(dá)等]的相關(guān)性。結(jié)果Neuritin蛋白的陽性表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)，NSCLC組織中Neuritin蛋白以高表達(dá)為主，其表達(dá)率為75.86％（66/87），遠(yuǎn)高于癌旁組織的31.03％（27/87），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；且NSCLC組織中Neuritin蛋白表達(dá)水平與NSCLC病理類型、分化程度、腫瘤大小、EGFR基因突變相關(guān)（P＜0.05），與年齡、性別、吸煙與否、腫瘤部位、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（P＞0.05）；Neuritin高表達(dá)組的中位疾病無進(jìn)展生存期（PFS）為16個月，低表達(dá)組的PFS為13個月，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；隨訪數(shù)據(jù)中Neuritin高表達(dá)組的中位總生存期為37個月，低表達(dá)組為47個月，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；結(jié)論Neuritin蛋白在NSCLC及其癌旁組織中均有表達(dá)，其中在NSCLC組織中呈高表達(dá)，且與NSCLC病理類型、分化程度、腫瘤大小、EGFR基因突變相關(guān)，提示Neuritin可能在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮一定作用。

神經(jīng)突起蛋白；非小細(xì)胞肺癌；免疫組織化學(xué)法

目前肺癌發(fā)病率居世界癌癥首位，20世紀(jì)以來，由于環(huán)境惡化、職業(yè)暴露和吸煙人口的上升，肺癌的發(fā)病率和死亡率也急劇的上升，其中有75％～80％患者為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[1]，其5年生存率較低，＞90％患者死于浸潤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，某些基因的異常表達(dá)是導(dǎo)致NSCLC不良預(yù)后的重要原因[2]。近年來，NSCLC的治療及其進(jìn)展是研究熱點之一。神經(jīng)突起生長因子（Neuritin）是一種與神經(jīng)系統(tǒng)可塑性相關(guān)的神經(jīng)營養(yǎng)因子[3]，既往多項研究顯示，Neuritin高表達(dá)于多種腫瘤組織中，其過表達(dá)對腫瘤血管的生長有促進(jìn)作用[4]，是一種潛在可能的促腫瘤生長因子。但Neuritin蛋白在實際肺癌組織中的表達(dá)情況及其與臨床病理資料的關(guān)系目前尚不明確。因此本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上，檢測Neuritin蛋白在NSCLC及其癌旁組織中的表達(dá)，并通過收集一般資料及隨訪生存情況，探討其與臨床病理參數(shù)和預(yù)后的相關(guān)性，為后續(xù)機制學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年8月-2014年2月在新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院經(jīng)病理確診的87例NSCLC患者，取經(jīng)手術(shù)切除的87例癌組織石蠟標(biāo)本及其87例對應(yīng)癌旁組織，標(biāo)本均按照術(shù)后外科病理分期收集。其中，男性54例，女性33例；年齡40～75歲，中位年齡62歲；病理類型：腺癌54例，鱗癌33例；分化程度：低分化24例，中分化33例，30例分化程度不明；TNM分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期21例，Ⅲ期42例，Ⅳ期6例；腫瘤部位：周圍型69例，中央型18例；腫瘤大?。骸? cm者15例，＞3 cm者72例；45例有吸煙史，51例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；行表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因檢測者60例，其中21例突變型，39例野生型。主要試劑：兔抗人Neuritin抗體購于美國Prosci公司，第二抗體購于為北京中衫金橋公司（pv-6000）。

1.2 免疫組織化學(xué)法染色

切片開始前將組織蠟塊置于冰凍切片機內(nèi)復(fù)溫30 min，修整組織使組織面最大程度暴露，按照5μm厚度進(jìn)行連續(xù)切片，采用Envision兩步法：切片脫蠟至水，95℃加熱15 min以修復(fù)抗原，雙氧水H2O2孵育10 min以減少背景染色。4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）振洗3次，5 min/次；滴加第二抗體，37℃孵育30 min；PBS振洗3次，5 min/次。二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色后進(jìn)行蘇木素核復(fù)染、脫水、透明、封片、干燥。每次實驗均以PBS代替第一抗體作為陰性對照。

1.3 免疫組織化學(xué)法結(jié)果評判標(biāo)準(zhǔn)

均由兩位病理醫(yī)生采用雙盲法閱片，Neuritin陽性染色定位于胞漿，采用陽性細(xì)胞計數(shù)與染色強度相結(jié)合的二級計分法。染色強度分類（按切片中細(xì)胞顯色有無及深淺評分）：0分細(xì)胞無著色；1分顯色為淺黃色；2分為深黃色；3分為棕褐色。取10個高倍鏡視野中每100個細(xì)胞中陽性細(xì)胞所占百分比的平均值為陽性細(xì)胞計數(shù)，1分：顯色細(xì)胞占切片中細(xì)胞總數(shù)的1/3以下；2分：1/3～2/3細(xì)胞顯色；3分：2/3以上細(xì)胞顯色。將兩組評分相乘，按積分高低分為：＜1分：陰性（-）；2～4分：陽性（+）；＞5分：強陽性（++）。

1.4 評價指標(biāo)

分析NSCLC組織及對應(yīng)癌旁組織中Neuritin蛋白表達(dá)情況，并分析其與臨床病理參數(shù)（性別、年齡、吸煙與否、腫瘤部位、病理類型、分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移、EGFR表達(dá)）的相關(guān)性。

1.5 隨訪

采用電話、門診復(fù)診等手段對患者進(jìn)行隨訪，截止時間為2015年10月31日，87例NSCLC患者失訪6例，隨訪率為93.10％。疾病無進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS）的定義為自手術(shù)或治療當(dāng)日至患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展或死亡的時間?？偵嫫冢╫verall survival，OS）的定義為自手術(shù)或治療當(dāng)日至患者死亡的時間。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以率表示，用χ2檢驗，采用Person相關(guān)檢驗分析Neuritin與臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性，Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析并行Log-rank比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Neuritin蛋白在NCSLC組織及其癌旁組織中的表達(dá)

Neuritin表達(dá)的陽性部位均位于胞漿，著色為黃色、棕黃色或棕褐色；且NSCLC組織中Neuritin以高表達(dá)為主，本實驗87例NSCLC組織中有66例表達(dá)呈強陽性，21例為弱陽性，其高表達(dá)率為75.86％，遠(yuǎn)高于癌旁組織的31.03％（27/87），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=35.133，P=0.000）。見圖1。

2.2 Neuritin蛋白的陽性表達(dá)率與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

NSCLC組織中Neuritin蛋白表達(dá)水平與年齡、性別、吸煙與否、腫瘤部位、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（P＞0.05），與NSCLC病理類型、分化程度、腫瘤大小、EGFR基因突變相關(guān)（P＜0.05）；其中病理類型鱗癌的高表達(dá)率高于腺癌（90.91％vs 66.67％）；分化程度中低分化者高表達(dá)率高于中分化者（87.50％vs 63.64％）；腫瘤直徑＞3 cm者的高表達(dá)率高于腫瘤直徑≤3 cm者（40.00％vs 83.33％）；EGFR基因野生型者的高表達(dá)率高于EGFR基因突變型者（92.31％ vs 71.43％）。見附表。

2.3 Neuritin蛋白的陽性表達(dá)率與預(yù)后的關(guān)系

圖1 Neuritin在NSCLC組織及其癌旁正常組織中的表達(dá)（鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法×40）

附表NSCLC臨床病理參數(shù)與Neuritin蛋白表達(dá)水平的關(guān)系例

全組隨訪18～49個月，中位隨訪時間27個月。全組失訪6例，隨訪率為93.10％；另有3例因術(shù)后感染等嚴(yán)重并發(fā)癥死亡出組，84例NSCLC隨訪數(shù)據(jù)中有51例疾病進(jìn)展，33例無疾病進(jìn)展，21例死亡，57例至隨訪結(jié)束仍然存活。①Neuritin高表達(dá)組的中位疾病PFS為16個月，95％CI為（4.791，27.209），低表達(dá)組的PFS為13個月，95％CI為（7.019，18.981），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.086）；②Neuritin高表達(dá)組的中位OS為37個月，低表達(dá)組的為47個月，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.092）。見圖2、3。

圖3 Neuritin表達(dá)水平的總生存曲線分析

3 討論

Neuritin是一種與長期可塑性相關(guān)的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，最早由NEDIVI等[5]從大鼠海馬齒狀回中分離得到的，又稱cpg15。以往研究多集中于神經(jīng)系統(tǒng)中，其表達(dá)產(chǎn)物參與神經(jīng)發(fā)育的多個過程[3，6]，也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的一個潛在靶點[7]。而RAGGO等[8]在卡波氏肉瘤的研究中，首次發(fā)現(xiàn)裸鼠體內(nèi)注射穩(wěn)定表達(dá)Neuritin的細(xì)胞一段時間后，在相應(yīng)部位有腫瘤形成，且Neuritin過表達(dá)的腫瘤體積較對照組明顯增大，是卡波氏肉瘤發(fā)生一個重要環(huán)節(jié)。近年來國內(nèi)外不斷有研究發(fā)現(xiàn)，Neuritin不僅表達(dá)于肺、肝等一些血供豐富的正常組織中，同時也高表達(dá)于多種腫瘤如肺癌、胃癌、腎母細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌等組織中，且其過表達(dá)對腫瘤血管尖端細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長有促進(jìn)作用，而腫瘤細(xì)胞失去控制的異常增殖需依賴新生血管網(wǎng)的形成，為其提供充分的血供及營養(yǎng)，這提示Neuritin是一種潛在的可能促進(jìn)腫瘤血管生長因子[9-12]。陳友林[13]發(fā)現(xiàn)，Neuritin在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)強度與膠質(zhì)瘤的病理分級、惡性程度呈正相關(guān)。曹健等[14]發(fā)現(xiàn)，Neuritin在乳腺癌組織中Neuritin的陽性表達(dá)率與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及ER/PR/HER2高陽性率有關(guān)，提示Neuritin在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮一定作用。

本研究初步發(fā)現(xiàn)，Neuritin在NSCLC及其癌旁組織中均有表達(dá)，其表達(dá)部位均位于胞漿。顯微鏡下大部分癌旁組織切片中Neuritin著色為黃色或淡黃色，著色細(xì)胞比例為30％～60％，而NSCLC組織切片中Neuritin著色為棕黃色或棕褐色，著色細(xì)胞比例多＞60％，提示Neuritin在NSCLC組織中存在高表達(dá)，而在癌旁組織為低表達(dá)。Neuritin在多種惡性腫瘤組織中存在高表達(dá)，提示Neuritin本身可能作為一種腫瘤相關(guān)生長因子在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮一定作用。本研究相關(guān)性分析顯示，NSCLC組織中Neuritin蛋白表達(dá)水平與年齡、性別、吸煙與否、腫瘤部位、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，但與NSCLC病理類型、分化程度、腫瘤大小、EGFR基因突變相關(guān)。其中在鱗癌中的表達(dá)高于腺癌，在低分化NSCLC中表達(dá)高于中分化者，在腫瘤直徑＞3 cm的NSCLC中表達(dá)高于腫瘤直徑≥3 cm者，在EGFR基因野生型中表達(dá)高于EGFR基因突變型。該結(jié)果與陳友林[13]、曹健等[14]的在乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤等腫瘤中表達(dá)趨勢一致。對于惡性腫瘤，其與供養(yǎng)血管關(guān)系密切，腫瘤分化程度越低、體積越大者，供養(yǎng)血管越豐富，微血管密度越高。也有體外實驗證實Neuritin在人非小細(xì)胞肺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞株中表達(dá)明顯高于肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞株[15]，提示Neuritin可能作為一種潛在的促腫瘤血管生長因子在NSCLC的發(fā)展中發(fā)揮一定作用。而Neuritin與EGFR基因關(guān)系的具體機制尚不明確，兩者可能有共同的相關(guān)傳導(dǎo)通路，有待進(jìn)一步明確。

另外本研究預(yù)后分析顯示，從Neuritin不同表達(dá)水平的中位PFS和OS生存曲線圖可見，兩條曲線差異無統(tǒng)計學(xué)意義。由于本研究受標(biāo)本數(shù)量、隨訪時間的限制，刪失數(shù)據(jù)偏多，以及影響OS的因素眾多，需后續(xù)進(jìn)一步增加樣本量及延長隨訪時間加以證實。

綜上所述，本研究初步顯示，Neuritin蛋白在NSCLC組織與癌旁正常組織中的表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。NSCLC組織中Neuritin存在高表達(dá)，并且與NSCLC病理類型、分化程度、腫瘤大小、EGFR基因突變相關(guān)。后續(xù)進(jìn)一步探討NSCLC與Neuritin的相互關(guān)系，將有助于對NSCLC的認(rèn)識，進(jìn)而為腫瘤基因治療提供新的靶點和理論依據(jù)。

綜上所述，Neuritin蛋白在NSCLC組織中存在高表達(dá)，且與NSCLC的病理類型、分化程度、腫瘤大小及EGFR基因突變相關(guān)，提示Neuritin蛋白可能在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮一定作用，可能成為肺癌預(yù)防和治療的一個新靶點。但Neuritin蛋白在腫瘤組織中的具體作用機制還需大量臨床隨機、多中心的相關(guān)研究。

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（童穎丹 編輯）

Expression and clinical significance of neuritin protein in non-small cell lung carcinoma

Ying Tong,Qiao Zhang,Li Shan
(The First Department Of Lung Cancer,Tumor Hospital Affiliated To Xinjiang Medical Univercity,Urumq,Xinjiang 830011,China)

ObjectiveTo investigate the expression status of neuritin protein and its association with clinical pathological features and prognosis in non-small cell lung carcinoma(NSCLC).MethodsNSCLC tissues and the corresponding para-cancerous tissues were collected from 87 cases in our hospital.SP immunohistochemistry was used to detect neuritin expression in both NSCLC and para-cancerous tissues.The neuritin expression level was divided into low expression and high expression according to the two-grade scoring method. The relationships between neuritin expression level and clinical pathological parameters(pathological type, differentiation,tumor size,lymph node metastasis and EGFR gene)were analyzed.ResultsThe positive particles of neuritin were located in the cytoplasm.The positive rate of neuritin in the NSCLC tissues(75.86％, 66/87)was significantly higher than that in the para-cancerous tissues(31.03％,27/87;P＜0.05).Neuritin expression in the NSCLC tissues was correlated with pathological type,differentiation,tumor size andEGFR gene mutation(P＜0.05);and had no relationship with gender,age,smoking history,tumor location or lymph node metastasis(P＞0.05).The median progression free survival(PFS)had no statistical significance betweenthe high-expression(16 months)and low-expression(13 months)groups(P＞0.05).The median overall survival(OS)was 37 months in the neuritin high-expression group and 47 months in the neuritin low-expression group without significant difference(P＞0.05).ConclusionsNeuritin protein is expressed in both NSCLC and para-carcinoma tissues,but highly expressed in NSCLC tissues.Neuritin expression is correlated with pathological type,differentiation,tumor size andEGFRgene mutation in NSCLC.It may play an important role in the occurrence and development of NSCLC.

neuritin;non-small cell lung carcinoma;immunohistochemistry

R734.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.01.015

1005-8982（2017）01-0077-05

2015-12-28

單莉，E-mail：84972673@qq.com