系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者FAS和FASLGmRNA的表達及其與臨床特征的關系*

谷三煒，馬寧，趙令，劉濤，姜振宇

（吉林大學第一醫(yī)院風濕免疫科，吉林長春130021）

臨床論著

系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者FAS和FASLGmRNA的表達及其與臨床特征的關系*

谷三煒，馬寧，趙令，劉濤，姜振宇

（吉林大學第一醫(yī)院風濕免疫科，吉林長春130021）

目的探討系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者FAS和FAS配體基因（FAS ligand，F(xiàn)ASLG）mRNA的表達情況，及其與系統(tǒng)性紅斑狼瘡臨床特征的關系。方法選取2015年1月-2015年12月于吉林大學第一醫(yī)院風濕免疫科診斷為系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者47例作為系統(tǒng)性紅斑狼瘡組，健康者47例作為對照組，系統(tǒng)性紅斑狼瘡組又分為活動性系統(tǒng)性紅斑狼瘡組和非活動性系統(tǒng)性紅斑狼瘡組。觀察各組FAS和FASLGmRNA的表達，以及FAS和FASLGmRNA的表達與系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者臨床特點的關系。結果系統(tǒng)性紅斑狼瘡組FASmRNA相對表達量高于對照組（P＜0.05），活動期系統(tǒng)性紅斑狼瘡組FASmRNA相對表達量高于非活動期系統(tǒng)性紅斑狼瘡組（P＜0.05）。FASLGmRNA相對表達量在各組之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。系統(tǒng)性紅斑狼瘡有發(fā)熱和無發(fā)熱者FASmRNA表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；有面部紅斑和無面部紅斑者FAS和FASLGmRNA表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；有皮疹和無皮疹者FASLGmRNA表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單核細胞中FASmRNA水平升高，且與疾病活動期有關，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的部分臨床特點與FAS和FASLGmRNA的表達有關。

FAS基因；FASLG基因；系統(tǒng)性紅斑狼瘡

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是由環(huán)境和遺傳因素共同作用引起的機體免疫功能紊亂，系統(tǒng)性紅斑狼瘡的免疫功能紊亂與細胞凋亡異常關系密切[1-2]，細胞凋亡功能紊亂和細胞凋亡清除異常在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。細胞凋亡由多種信號途徑參與調節(jié)，其中FAS及其配體（FASLG）在細胞死亡受體途徑中起著重要作用，F(xiàn)AS/FASLG能夠誘導細胞凋亡，維持機體內環(huán)境穩(wěn)定和機體自身平衡，當FAS或者FASLG基因表達缺陷或者結構異常時，限制其介導的反應性淋巴細胞凋亡，生成大量抗體，打破免疫耐受，引起自身免疫性疾病的發(fā)生[3-4]。近年來不少研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AS/FASLG與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)生有關[5-6]，但研究主要集中在FAS/FASLG蛋白水平的檢測。本研究在基因轉錄水平探討系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者FAS和FASLGmRNA的表達，并分析其與系統(tǒng)性紅斑狼瘡臨床特征的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2015年1月-2015年12月于吉林大學第一醫(yī)院風濕免疫科診斷為系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者47例作為系統(tǒng)性紅斑狼瘡組，同期體檢中心健康體檢的健康者47例作為對照組，根據(jù)系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動性指數(shù)系統(tǒng)性紅斑狼瘡組又分為活動性系統(tǒng)性紅斑狼瘡組和非活動性系統(tǒng)性紅斑狼瘡組。系統(tǒng)性紅斑狼瘡組患者47例，其中男性45例，女性2例；年齡（33.4±12.3）歲。對照組患者47例，其中男性44例，女性3例；年齡（34.2±11.6）歲。對照組和系統(tǒng)性紅斑狼瘡組年齡和性別比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。所有患者簽署知情同意書，無其他全身性疾病，資料完整。

1.2 方法

1.2.1 資料收集收集兩組患者的年齡、性別、既往史、現(xiàn)病史等一般資料，系統(tǒng)性紅斑狼瘡組收集發(fā)熱、面部紅斑、皮疹、脫發(fā)及關節(jié)炎等資料。

1.2.2 疾病活動度評分根據(jù)系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動性指數(shù)量表進行系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動度評分，疾病緩解為0～9分，疾病活動為≥10分。

1.2.3 血液采集采集所有研究對象空腹外周血4ml于抗凝管中，在采集的外周血中加入適量的淋巴細胞分離液，離心，取上層液面和中層液面之間的乳白色單個核細胞層；采用Trizol法提取外周血單個核細胞的總RNA，根據(jù)260 nm吸光度計算RNA含量，采用紫外分光光度計檢測提取的單個核細胞總RNA的純度；根據(jù)RNA逆轉錄合成cDNA；配制PCR的總反應體系為20 μl，空白對照組加入20 μl超純水，RTQ-PCR檢測FAS/FASLG及內參基因GAPDH的擴增情況；數(shù)據(jù)分析時，F(xiàn)AS/FASLG基因的相對定量用2-△Ct表示，△Ct為檢測基因的平均Ct值-內參基因的平均Ct值。

1.3 主要觀察指標

觀察各組FAS和FASLGmRNA的表達，以及FAS和FASLGmRNA的表達與系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者臨床特點的關系。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，非正態(tài)分布以M（P25，P75）描述，正態(tài)分布用t檢驗，非正態(tài)分布用Mann-whitney秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 提取的外周血白細胞總RNA

用紫外分光光度計檢測提取的外周血白細胞總RNA吸光度值，發(fā)現(xiàn)A260/A280在1.8～2.0，RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后見2條清晰條帶，亮度和寬度基本符合2︰1的比例，RNA沒有明顯降解，比較完整。見圖1。

2.2 各組的FASmRNA表達

外周血白細胞中，系統(tǒng)性紅斑狼瘡組患者FAS mRNA相對表達量為0.0182（0.0002～0.1879），對照組FASmRNA相對表達量為0.0089（0.0003-0.0874），經(jīng)Mann-whitney秩和檢驗，兩組差異有統(tǒng)計學意義（Z=4.012，P=0.009），系統(tǒng)性紅斑狼瘡組FASmRNA相對表達量高于對照組；活動期系統(tǒng)性紅斑狼瘡組FASmRNA相對表達量為0.0297（0.0062～0.1154），非活動期系統(tǒng)性紅斑狼瘡組FASmRNA相對表達量為0.0131（0.0003～0.0427），經(jīng)mann-whitney秩和檢驗，兩組差異有統(tǒng)計學意義（Z=3.276，P=0.043），活動期系統(tǒng)性紅斑狼瘡組FASmRNA相對表達量高于非活動期系統(tǒng)性紅斑狼瘡組（見圖2）。表明外周血白細胞FASmRNA表達量與系統(tǒng)性紅斑狼瘡及其嚴重程度相關。

圖1 外周血白細胞總RNA電泳圖

圖2 各組的FASmRNA表達比較

2.3 各組的FASLGmRNA表達

外周血白細胞中，系統(tǒng)性紅斑狼瘡組患者FASLG mRNA相對表達量為0.0019（0.0001～0.0786），對照組FASLGmRNA相對表達量為0.0017（0.003～0.0168），經(jīng)Mann-whitney秩和檢驗，兩組差異無統(tǒng)計學意義（Z=1.201，P=0.342）；活動期系統(tǒng)性紅斑狼瘡組FASLGmRNA相對表達量為0.0020（0.0003-0.0775），非活動期系統(tǒng)性紅斑狼瘡組FASLGmRNA相對表達量為0.0013（0.0001～0.0425），經(jīng)Mann-whitney秩和檢驗，兩組差異無統(tǒng)計學意義（Z=0.908，P=0.795）（見圖3）。表明外周血白細胞FASLGmRNA表達量與系統(tǒng)性紅斑狼瘡及其嚴重程度無關。

圖3 各組的FASLG mRNA表達

2.4 系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血白細胞中FAS mRNA表達及與臨床特點的關系

外周血白細胞中，有發(fā)熱和無發(fā)熱患者FASmRNA表達量分別為0.0148（0.0003～0.0357）和0.0271（0.0061～0.1031），經(jīng)Mann-whitney秩和檢驗，兩組差異有統(tǒng)計學意義（Z=3.756，P=0.015），無發(fā)熱組FASmRNA表達量高于有發(fā)熱組；有面部紅斑和無面部紅斑患者FASmRNA表達量分別為0.0272（0.0103～0.1078）和0.0157（0.0005～0.0978），經(jīng)Mannwhitney秩和檢驗，兩組差異有統(tǒng)計學意義（Z=3.426，P=0.037），有面部紅斑患者FASmRNA表達量高于無面部紅斑患者；有脫發(fā)和無脫發(fā)患者FASmRNA表達量分別為0.0243（0.0003～0.1054）和0.0171（0.0047～0.1042），兩組差異無統(tǒng)計學意義（Z=1.029，P=0.563）；有關節(jié)炎患者和無關節(jié)炎患者FASmRNA表達量分別為0.0181（0.0003～0.1052）和0.0224（0.0054～0.1143），兩組差異無統(tǒng)計學意義（Z=0.968，P=0.634）；有皮疹和無皮疹患者FASmRNA表達量分別為0.0187（0.0121～0.1213）和0.0214（0.0007～0.1124），兩組差異無統(tǒng)計學意義（Z=1.215，P=0.523）（見圖4）。表明外周血白細胞中FASmRNA表達與系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者發(fā)熱和面部紅斑相關。

圖4 FASmRNA表達和臨床特點的關系

2.5 系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血白細胞中FASLG mRNA表達及與臨床特點的關系

外周血白細胞中，有發(fā)熱和無發(fā)熱患者FASLG mRNA表達量分別為0.0012（0.0001～0.0296）和0.0018（0.0003～0.0374），經(jīng)Mann-whitney秩和檢驗，兩組差異無統(tǒng)計學意義（Z=1.065，P=0.512）；有面部紅斑和無面部紅斑患者FASLGmRNA表達量分別為0.0039（0.0004～0.0323）和0.0011（0.0002～0.0378），經(jīng)Mann-whitney秩和檢驗，兩組差異有統(tǒng)計學意義（Z=4.204，P=0.021），有面部紅斑患者FASLGmRNA表達量高于無面部紅斑患者；有脫發(fā)和無脫發(fā)患者FASLGmRNA表達量分別為0.0018（0.0002～0.0231）和0.0015（0.0001～0.0315），兩組差異無統(tǒng)計學意義（Z=0.783，P=0.748）；有關節(jié)炎患者和無關節(jié)炎患者FASLGmRNA表達量分別為0.0014（0.0002～0.0314）和0.0023（0.0006～0.0324），兩組差異無統(tǒng)計學意義（Z=0.879，P=0.623）；有皮疹和無皮疹患者FASLG mRNA表達量分別為0.0034（0.0007～0.0324）和0.0011（0.0001～0.0364），兩組差異有統(tǒng)計學意義（Z=4.026，P=0.025），有皮疹患者FASLGmRNA表達量高于無皮疹患者（見圖5）。表明外周血白細胞中FASmRNA表達與系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者面部紅斑及皮疹相關。

圖5 系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血白細胞中FASLGmRNA表達及與臨床特點的關系

3 討論

系統(tǒng)性紅斑狼瘡作為一種自身免疫性疾病，其發(fā)病機制與機體內的自身免疫耐受和免疫平衡被打破有關[7-8]。細胞凋亡是指在特定信號的誘導下和特定基因的調控下，細胞發(fā)生的主動性死亡，細胞的凋亡能夠清除體內生長異常的細胞及體內老化的細胞，對機體的組織穩(wěn)態(tài)、免疫耐受及免疫平衡具有一定意義，F(xiàn)AS/FASLG在自身免疫性疾病中介導細胞的凋亡[9-10]。FAS屬于神經(jīng)生長因子和腫瘤壞死因子受體家族成員之一，具有膜受體特性，胞漿區(qū)有死亡域，死亡域在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用[11]。FAS基因由8個內含子和9個外顯子組成，位于第10號染色體上，其翻譯的產(chǎn)物sFAS能夠和FASLG結合，對FAS介導的細胞凋亡具有抑制作用。FASLG屬于腫瘤壞死因子家族成員之一，F(xiàn)ASLG含有3個內含子和5個外顯子，位于第1號染色體上。在機體的病原體或者抗原被清除后，F(xiàn)AS相關的凋亡清除激活的T細胞，在FADD、Caspase-8和10的參與下，F(xiàn)AS引起死亡誘導信號復合物聚集，誘導細胞的凋亡。FAS介導的細胞凋亡參與機體免疫調節(jié)，維持機體內環(huán)境的穩(wěn)定，機體內淋巴細胞過度活化和細胞凋亡的異常產(chǎn)生大量自身抗體及免疫復合物，引起組織損傷[12-13]。

在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者體內，F(xiàn)AS介導的細胞凋亡紊亂，T淋巴細胞凋亡增加，外周血B細胞和T細胞FAS蛋白表達增加；系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者淋巴細胞過度活化，F(xiàn)AS參與的淋巴細胞的凋亡功能亢進，細胞凋亡產(chǎn)生的抗原在機體免疫系統(tǒng)中引起自身抗體的產(chǎn)生，使免疫耐受被打破[14]。關于FAS/FASLG和系統(tǒng)性紅斑狼瘡關系的研究主要集中在血清FAS/ FASLG表達和FAS/FASLG抗原蛋白水平[15]，關于FAS/FASLGmRNA和系統(tǒng)性紅斑狼瘡關系的研究比較少，WU等[16]發(fā)現(xiàn)FASmRNA可能參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病過程。本研究筆者在基因轉錄水平探討系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者FAS和FASLGmRNA的表達，并分析其與系統(tǒng)性紅斑狼瘡臨床特征的關系，發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡組FASmRNA相對表達量高于對照組，活動期系統(tǒng)性紅斑狼瘡組FASmRNA相對表達量高于非活動期系統(tǒng)性紅斑狼瘡組。FASLG mRNA相對表達量在各組間比較差異無統(tǒng)計學意義。系統(tǒng)性紅斑狼瘡有發(fā)熱和無發(fā)熱者FASmRNA表達差異有統(tǒng)計學意義；有面部紅斑和無面部紅斑者FASmRNA和FASLGmRNA表達差異有統(tǒng)計學意義；有皮疹和無皮疹者FASLG mRNA表達差異有統(tǒng)計學意義。本研究結果表明，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單核細胞中FASmRNA水平升高，且與疾病活動期有關，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的部分臨床特點和FAS和FASLGmRNA的表達有關。FAS和FASLG結合后，通過調節(jié)腫瘤壞死因子相關因子的相互作用激活NF-κB通路和細胞外信號調節(jié)激酶，引起炎癥反應的發(fā)生，同時能夠釋放大量炎癥細胞因子，誘導FAS在細胞上表達升高，因此FAS/FASLG與系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的部分臨床特點相關可能和上述機制有關。

[1]MAHIEU M,YOUNT S,RAMSEY-GOLDMAN R.Patient-reported outcomes in systemic lupus erythematosus[J].Rheum Dis Clin North Am,2016,42(2):253-263.

[2]WILLIAMS E M,ORTIZ K,ZHANG J,et al.The systemic lupus erythematosus travel burden survey:baseline data among a South Carolina cohort[J].BMC Res Notes,2016,9(1):246.

[3]NABHANI S,GINZEL S,MISKIN H,et al.Deregulation of Fas ligand expression as a novel cause of autoimmune lymphoproliferative syndrome-like disease[J].Haematologica,2015,100(9): 1189-1198.

[4]GARCíA GARCíA GM,BUREO DACAL JC,SUáREZ-VARELA PINEDA S,et al.Adult onset autoimmune lymphoproliferative syndrome due to somatic FAS mutation[J].Intern Med J,2015, 45(4):462-464.

[5]AL-SEBAEI MO,DAUKSS D M,BELKINA A C,et al.Role of Fas and Treg cells in fracture healing as characterized in the fas-deficient(lpr)mouse model of lupus[J].J Bone Miner Res, 2014,29(6):1478-1491.

[6]LIPHAUS B L,KISS M H,CARRASCO S,et al.Reduced expressions of Fas and Bcl-2 proteins in CD14+monocytes and normal CD14 soluble levels in juvenile systemic lupus erythematosus[J].Lupus,2013,22(9):940-947.

[7]BARNETT R.Systemic lupus erythematosus[J].Lancet,2016, 387(10029):1711.

[8]ZHANG L,WU X,WANG L,et al.Clinical features of systemic lupus erythematosus patients complicated with evans syndrome:a case-control,single center study[J].Medicine(Baltimore),2016, 95(15):e3279.

[9]LEE YH,BAE SC,SONG GG.Association between the CTLA-4,CD226,FAS polymorphisms and rheumatoid arthritis susceptibility:a meta-analysis[J].Hum Immunol,2015,76(2/3):83-89.

[10]NABHANI S,H?NSCHEID A,OOMMEN P T,et al.A novel homozygous Fas ligand mutation leads to early protein truncation,abrogation of death receptor and reverse signaling and a severe form of the autoimmune lymphoproliferative syndrome[J]. Clin Immunol,2014,155(2):231-237.

[11]AUDO R,CALMON-HAMATY F,PAPON L,et al.Distinct effects of soluble and membrane-bound fas ligand on fibroblastlike synoviocytes from rheumatoid arthritis patients[J].Arthritis Rheumatol,2014,66(12):3289-3299.

[12]TREVI?O-TALAVERA BA,PALAFOX-SáNCHEZ CA,MU?OZVALLE J F,et al.G promoter polymorphism is associated with soluble Fas levels in primary Sj?gren's syndrome[J].Genet Mol Res,2014,13(3):4831-4838.

[13]RENSING-EHL A,V?LKL S,SPECKMANN C,et al.Abnormally differentiated CD4+or CD8+T cells with phenotypic and genetic features of double negative T cells in human Fas deficiency[J].Blood,2014,124(6):851-860.

[14]LU MM,YE Q L,FENG C C,et al.Association of FAS gene polymorphisms with systemic lupus erythematosus:A case-con trol study and meta-analysis[J].Exp Ther Med,2012,4(3):497-502.

[15]XIANG N,LI X M,WANG G S,et al.Association of Fas gene polymorphisms with systemic lupus erythematosus:a meta-analysis[J].Mol Biol Rep,2013,40(1):407-415.

[16]WU J,XIE F,QIAN K,et al.FAS mRNA editing in Human Systemic Lupus Erythematosus[J].Hum Mutat,2011,32(11): 1268-1277.

（童穎丹 編輯）

Expressions of FASmRNA and FASLGmRNA in patients with systemic lupus erythematosus and their relationships with clinical features*

San-wei Gu,Ning Ma,Ling Zhao,Tao Liu,Zhen-yu Jiang
(Division of Rheumatology,the First Hospital of Jilin University, Changchun,Jilin 130021,China)

ObjectiveTo explore the expressions of FASmRNA and FAS ligand(FASLG)mRNA in patients with systemic lupus erythematosus(SLE),and to analyze their relationships with the clinical features of SLE.MethodsForty-seven patients treated for systemic lupus erythematosus in the Division of Rheumatology of the First Hospital of Jilin University between Jan.2015 and Dec.2015 were selected as SLE group,47 healthy people as control group.The SLE group was further divided into active SLE group and inactive SLE group.The expressions of FASmRNA and FASLGmRNA,as well as the relationships of the expressions of FASmRNA and FASLGmRNA with the clinical characteristics of SLE patients were observed in each group.ResultsThe relative expression of FASmRNA in the SLE group was higher than that of the control group(P＜0.05).The relative expression of FASmRNA in the active SLE group was higher than that in the inactive SLE group(P＜0.05).There was no significant difference in relative expression of FASLGmRNA between any two groups(P＞0.05).The difference of FASmRNA expression had no significant difference between the sys－temic lupus erythematosus patients with fever and those without fever(P＜0.05).The differences in theFAS mRNA and FASLGmRNA expressions were statistically significant between the SLE patients with facial erythema and those without(P＜0.05).The difference of the FASLGmRNA expression was statistically significant between the SLE patients with rash and those without rash(P＜0.05).ConclusionsThe FASmRNA level in the peripheral mononuclear cells of systemic lupus erythematosus patients elevates and is related to disease activity.Part of the clinical features of the patients are correlated to the expressions of FASmRNA and FASLGmRNA.

FASgene;FASLGgene;systemic lupus erythematosus

R593.241

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.01.011

1005-8982（2017）01-0055-05

2016-05-18

國家自然科學基金青年基金（No：81401332）

姜振宇，E-mail：buksbbdk@126.com；Tel：13804354389