Obestatin在心肌梗死后心力衰竭大鼠循環(huán)和腎臟的表達及其生物學意義*

沈明，郭志福，鮑禮智，李然，鄭興

（第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院心內(nèi)科，上海200433）

論著

Obestatin在心肌梗死后心力衰竭大鼠循環(huán)和腎臟的表達及其生物學意義*

沈明，郭志福，鮑禮智，李然，鄭興

（第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院心內(nèi)科，上海200433）

目的探究obestatin在心肌梗死后心力衰竭（以下簡稱心衰）大鼠循環(huán)和腎臟組織中的表達及其可能的生物學意義。方法以冠狀動脈結(jié)扎法復(fù)制大鼠心肌梗死后心衰模型，酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠血漿obestatin濃度，免疫組織化學法檢測obestatin在腎臟組織的表達并分析累積光密度值，比較不同組的差異，Western blot檢測不同組腎臟組織表達obestatin水平，并進行半定量分析。結(jié)果心衰組大鼠循環(huán)血漿內(nèi)obestatin濃度較正常組及假手術(shù)組增高（P＜0.05），免疫組織化學法顯示，obestatin在大鼠腎臟腎小管和集合管表達，心衰組大鼠腎臟組織obestatin表達較正常組和假手術(shù)組升高（P＜0.05）。結(jié)論Obestatin在心力衰竭大鼠循環(huán)和腎臟表達增高，可能以內(nèi)分泌及自分泌或旁分泌形式參與心衰水潴留的發(fā)生、發(fā)展。

obestatin；心力衰竭；水平衡

Obestatin是由23個氨基酸殘基組成的多肽類激素[1]，主要在胃腸道組織表達，具有多種功能。腦室內(nèi)給予obestatin注射可以抑制口渴，減少飲水并呈劑量依賴性降低精氨加壓素（Argininevasopressin，AVP）的釋放[2-3]，揭示obestatin對機體水平衡具有調(diào)節(jié)作用。同時有研究表明，obestatin不能通過血腦屏障進入中樞[4]，因而obestatin在外周對于機體水平衡的作用值得進一步研究。前期研究發(fā)現(xiàn)，心力衰竭（以下簡稱心衰）患者循環(huán)中obestatin水平較心功能正常者明顯升高[5]，而水潴留是心衰發(fā)生、發(fā)展的重要機制[6]。本實驗以SD大鼠為研究對象，進一步證實obestatin在心肌梗死（以下簡稱心梗）后心衰大鼠循環(huán)中的表達，并探究其在心衰水潴留發(fā)展中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無特定病原體級雄性SD大鼠20只，體重180～200 g左右，購自上海第二軍醫(yī)大學實驗動中心（第二軍醫(yī)大學實驗動物中心代養(yǎng)）。實驗期間，動物房室溫保持22℃左右，相對濕度70％左右，08∶00～20∶00自動照明，自由進食和飲水。

Obestatin酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA）試劑盒（上海西塘生物公司），抗兔/鼠通用型免疫組織化學法試劑盒（丹麥Dako公司），RIPA裂解液、聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物公司，LDS sample buffer（芬蘭Thermo公司），obestatin抗體（美國Abcam公司），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（上海西塘生物公司），熒光標記的驢抗兔二抗（美國LI-COR公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

小動物呼吸機（上海奧爾科特生物科技有限公司），心電圖機（上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司），Vevo 707超聲儀（加拿大Visualsonics公司），酶標儀（芬蘭Thermo公司），臺式離心機（上海安亭科學儀器廠），石蠟切片機（上海徠卡儀器有限公司），烘箱（上海福瑪實驗設(shè)備有限公司），普通光學顯微鏡（重慶光電儀器有限公司），Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)（美國LI-COR公司）。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組及心衰模型復(fù)制與篩選實驗分為正常組、假手術(shù)組及心衰組3組，利用Excel表格隨機數(shù)生成法抽取5例為正常組，5例為假手術(shù)組，剩余大鼠用于心衰模型復(fù)制。

參照既往相關(guān)文獻[7]，采用冠狀動脈結(jié)扎法復(fù)制大鼠心梗后心衰模型：以10％水合氯醛（0.3 ml/ 100 g）腹腔注射麻醉大鼠后固定在木板上，用24號筆型靜脈留置針套管行氣管插管，連接小動物呼吸機和心電圖機（潮氣量7～8 ml，呼吸頻率80次/min，吸呼比1∶2）。選取左前胸第三或第四肋間水平切口，逐層暴露心臟，在右心室流出道與左心房之間，距主動脈根部2～3 mm處用6號絲線穿過左冠狀動脈主干，連同小束心肌一起結(jié)扎，可見縫線下方心肌顏色變淺、蒼白。同時心電圖可記錄到R波升高及ST段抬高為結(jié)扎成功。隨后擠壓胸腔排氣，逐層關(guān)閉胸腔。假手術(shù)組采用同樣步驟，但僅將絲線繞過左冠狀動脈，不結(jié)扎。正常組及所有手術(shù)大鼠術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)，定期稱重。術(shù)后8周對大鼠心臟進行超聲檢查，采用射血分數(shù)（ejection fraction，EF）值≤45％作為心衰的評定標準[7-8]。共手術(shù)15例，其中假手術(shù)組5例全部存活；心梗手術(shù)10例，術(shù)中及術(shù)后1周內(nèi)死亡3例，EF值＞45％排除1例，共獲得心衰大鼠6例作為心衰組。

1.3.2 大鼠尿液收集將待測大鼠分別放入代謝籠內(nèi)，禁食。將裝有100 ml飲用水的水瓶放入飲水孔，集尿口下接集尿袋，環(huán)境溫度控制在25℃左右，適應(yīng)3 d后，收集24 h尿液并測量水瓶剩余水量，計算大鼠飲水量。分別收集術(shù)前及模型篩選完畢后各組大鼠24 h尿液及飲水量。

1.3.3 ELISA法檢測大鼠血漿obestatin的表達采用內(nèi)眥取血方法，大鼠麻醉后，左手拇指及食指抓住兩耳之間的皮膚，使其固定，并輕輕壓迫頸部兩側(cè)，阻礙靜脈回流，使眼球充分外突，提示眼眶后靜脈叢沖血。右手持毛細玻璃管，將尖端插入內(nèi)眼角與眼球之間，輕輕向眼底方向刺入，當感到有阻力時即停止刺入，旋轉(zhuǎn)玻璃管以切開靜脈叢，血液即流出，將血液流入含乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）的紫色真空采血管內(nèi)，4℃、3 000 r/min離心取上清待測。分別收集術(shù)前及模型篩選完畢后各組大鼠血漿待測。按試劑盒說明書檢測血漿內(nèi)obestatin含量。

1.3.4 免疫組織化學法和Western blot檢測腎臟obestatin表達所有大鼠術(shù)后8周模型篩選完畢取血尿樣本后即行處死，立即剖開大鼠腹腔取大鼠2個腎臟，用預(yù)冷的生理鹽水充分沖洗后分別用于免疫組織化學法和Western blot檢測。

新鮮腎臟固定于4％多聚甲醛＞24 h，常規(guī)石蠟包埋切片，片厚4μm。65℃烘箱中烘片2 h，脫蠟至水，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3次，5 min/次；置于EDTA緩沖液中微波修復(fù)，中火至沸后斷電，間隔10 min低火至沸，自然冷卻后PBS洗3次，5 min/次；隨后放入3％過氧化氫溶液，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；PBS洗3次，5 min/次，甩干后5％牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）封閉20 min；去除BSA液，滴加obestatin抗體（1∶200），4℃過夜后PBS洗3次，5 min/次；滴加二抗（試劑盒A液），4℃孵育50 min，PBS洗3次，5 min/次；滴加100μl新鮮配制3，3'-二氨基聯(lián)苯胺（3，3'-Diaminobenzidine，DAB）溶液，顯微鏡控制顯色。顯色完全后，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封固。顯微鏡觀察，拍照。各組內(nèi)每張切片隨機挑選3個200倍視野進行拍照。拍照時盡量讓組織充滿整個視野，保證每張照片的背景光一致。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統(tǒng)一標準，對每張照片進行分析得出其陽性的累積光密度（integral optical density，IOD）值，以IOD值反應(yīng)obestatin在組織表達水平。

將新鮮腎臟組織剪成細小碎片，濾紙吸干水分稱重，按每20 mg組織加入200μl RIPA裂解液裂解組織提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，配置12％的分離膠（GAPDH用）、15％的分離膠（obestatin用）及5％的濃縮膠，調(diào)整蛋白濃度30μg/孔加樣，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳分離蛋白（80 V恒壓電泳20 min至分離膠，110 V恒壓電泳至底），電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜300 mA恒流GAPDH（60 min），obestatin（25 min），5％牛奶室溫封閉2 h，三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水（triethanolamine buffered saline solution， TBST）洗膜10 min/次，共3次，加一抗obestatin（1∶1 000）、GAPDH（1∶20 000），4℃孵育過夜，TBST洗膜10 min/次，共3次，加熒光標記的驢抗兔二抗（1∶10 000），室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min/次，共3次。以O(shè)dyssey Infrared Imaging System掃膜，使用Quantity one軟件分別測定obestatin條帶及GAPDH條帶的密度值，并以obestatin/GAPDH比值表示蛋白表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，用單因素方差分析，若方差齊，則組間多重比較用最小顯著差異LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠飼養(yǎng)8周后出入量及心臟超聲檢查結(jié)果

經(jīng)單因素方差分析，3組大鼠出入量平衡比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=29.215，P=0.000），經(jīng)LSD-t檢驗，心衰組與正常組及假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.950和6.979，P=0.000），心衰組較正常組及假手術(shù)組水潴留增多。假手術(shù)組與正常組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=-0.985，P=0.343）。見附表。

2.2 大鼠循環(huán)血漿內(nèi)obestatin ELISA檢測結(jié)果

ELISA結(jié)果顯示，正常組、假手術(shù)組及心衰組大鼠血漿obestatin濃度分別為（1 700.862±146.867）、（1 713.007±128.377）和（1 923.331±145.243）pg/ml，經(jīng)方差分析，組間差異有統(tǒng)計學意義（F=4.439，P= 0.034），經(jīng)LSD-t檢驗，心衰組與正常組及假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.610和2.467，P=0.022和0.028），心衰組大鼠循環(huán)血漿內(nèi)obestatin含量高于正常組及假手術(shù)組。假手術(shù)組與正常組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.136，P=0.894）。見圖1。

2.3 Obestatin在大鼠腎臟的表達

附表大鼠出入量平衡及心功能改變（±s）

附表大鼠出入量平衡及心功能改變（±s）

注：出入量平衡=入量-出量，?與正常組比較，P＜0.05

組別短軸縮短率/％正常組（n=5）386.40±11.725.80±2.593.18±0.516.81±0.7482.37±5.8953.25±7.37假手術(shù)組（n=5）404.80±55.903.00±4.692.80±0.456.34±0.5085.33±3.8756.03±4.70心衰組（n=6）374.50±28.4822.00±5.44?7.32±0.54?8.47±0.83?27.22±6.56?13.33±3.47?F值0.95629.215138.93113.773189.320113.977 P值0.4100.0000.0000.0010.0000.000 體重/g 出入量平衡/ml 左室收縮末期內(nèi)徑/mm 左室舒張末期內(nèi)徑/mm 左室射血分數(shù)/％

采用DAB染色，并行核復(fù)染，陽性結(jié)果為棕黃色顆粒，結(jié)果顯示，obestatin在腎小管與集合管豐富表達。統(tǒng)計分析各組陽性IOD值，正常組、假手術(shù)組、心衰組分別為（32386.546±5862.752）、（31322.416± 4 911.751）和（42 675.848±7 640.683），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=5.463，P=0.019），經(jīng)LSD-t檢驗，心衰組與正常組及假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.672和2.948，P=0.019和0.011），obestatin在心衰組的表達較正常組及假手術(shù)組增高。假手術(shù)組與正常組比較，經(jīng)LSD-t檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（t= -0.265，P=0.796）。見圖2。

各組大鼠腎臟組織提取總蛋白后，Western blot檢測obestatin蛋白表達相對水平，結(jié)果顯示，正常組、假手術(shù)組、心衰組相對表達水平分別為（0.542± 0.055）、（0.506±0.043）和（0.812±0.070），經(jīng)方差分析，心衰組與正常組及假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=46.190，P=0.000），經(jīng)LSD-t檢驗，心衰組與正常組及假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.641和8.666，P=0.000），心衰組大鼠腎臟obestatin表達高于正常組及假手術(shù)組。假手術(shù)組與正常組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=-0.982，P=0.344）。見圖3。

圖13 組大鼠血漿obestatin濃度比較（x±s）

圖2 Obestatin在不同組大鼠腎臟組織的表達（免疫組織化學×200）

圖3 Western blot檢測各組大鼠腎臟組織的obestatin表達（x±s）

3 討論

心力衰竭時，腎臟集合管水通道蛋白2（Aquaporin 2，AQP2）在集合管管腔側(cè)質(zhì)膜分布及合成上調(diào)，進而增加水的重吸收，是心衰水潴留最重要的病理生理機制之一[9-10]。AQP2也被稱為AVP依賴性蛋白，心衰時AVP合成和分泌增加，同時其V2受體敏感性增加，進而上調(diào)AQP2合成與分布，增加水潴留[11]；近年來多項研究顯示，除AVP外，尚有其他因素參與AQP2的調(diào)控，例如血管緊張素Ⅱ、高滲狀態(tài)及降鈣素等通過不同的機制參與AQP2的合成及分布，進而調(diào)控腎臟對水的重吸收[12-14]。

Ghrelin/obestatin是近年來進入心血管研究領(lǐng)域的新的因子。斯坦福大學博士ZHANG等[1]于2005年推測并證實ghrelin的前體原除可產(chǎn)生ghrelin外，還可以產(chǎn)生另一種多肽，命名為obestatin，由23個氨基酸殘基組成，經(jīng)酰胺化修飾后成為生物活性形式，在機體食欲和體重調(diào)節(jié)中與ghrelin功能完全相反。近年來研究發(fā)現(xiàn)，obestatin除參與調(diào)節(jié)機體的物質(zhì)和能量代謝外，其在心血管系統(tǒng)亦發(fā)揮作用[15-16]。既往研究顯示，腦室內(nèi)注射obestatin可抑制飲水并且可抑制脫水導致的AVP釋放[2-3]，提示obestatin是機體水、電解質(zhì)平衡的重要調(diào)控因子。Obestatin在腎臟可以引發(fā)基因表達的早反應(yīng)，同時可以激活人胚腎細胞表面G蛋白偶聯(lián)受體GPR39信號通路，提示GPR39為obestatin的受體[17]。

本研究結(jié)果顯示，慢性心衰大鼠循環(huán)中obestatin表達增高，這與在人類心衰患者循環(huán)中發(fā)現(xiàn)obestatin增高一致[5，18]，提示循環(huán)中obestatin紊亂參與心衰的發(fā)生、發(fā)展。結(jié)合GPR39在腎臟表達及obestatin不能通過血腦屏障影響中樞調(diào)節(jié)機體水平衡，推測循環(huán)中obestatin以內(nèi)分泌形式作用于腎臟，參與機體水平衡的調(diào)控。同時免疫組織化學法結(jié)果證實，obestatin在腎臟的腎小管和集合管表達，并通過分析光密度值及Western blot檢測半定量證實心衰大鼠腎臟obestatin表達升高，提示obestatin除內(nèi)分泌外，尚可能通過旁分泌及自分泌的方式參與腎臟對機體水平衡的調(diào)控，進而調(diào)控心衰的水潴留。

綜上所述，心梗后心衰大鼠循環(huán)及腎臟表達obestatin增多，通過腎臟調(diào)節(jié)機體水平衡參與心衰水潴留的發(fā)生、發(fā)展。結(jié)合腎臟AQP2的調(diào)控，可以提出如下設(shè)想：obestatin通過調(diào)節(jié)腎臟水通道蛋白2的合成及其在集合管管腔側(cè)質(zhì)膜的分布，進而調(diào)控機體的水平衡，參與心衰的水潴留。進一步研究可以從動物和細胞實驗的整體和分子水平來驗證obestatin是否參與AQP2的調(diào)控及其具體機制。

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（童穎丹 編輯）

Expression of obestatin in circulation and kidneys of rats with heart failure after myocardial infarction and its biological significance*

Ming Shen,Zhi-fu Guo,Li-zhi Bao,Ran Li,Xing Zheng
(Department of Cardiovasology,Changhai Hospital,the Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)

ObjectiveTo investigate the expression of obestatin in the circulation and kidneys of heart failure rats after myocardial infarction and its possible biological significance.MethodsA heart failure rat model was induced by coronary artery ligation.Enzyme-linked immunosorbent assay was used to test the plasma concentration of obestatin.Immunohistochemistry was used to detect the expression of obestatin in the rats' kidneys and integral optical density(IOD)was measured to analyze the difference among different groups. The expression level of obestatin in the kidneys was measured by Western blot and compared among different groups.ResultsThe plasma concentration of obestatin in the heart failure group was significantly higher than that in the normal group and the sham group(P＜0.05).Immunohistochemistry proved that obestatin was expressed in renal tubules and collecting tubules.The level of obestatin in the kidneys of the heart failure group was significantly higher than that in the normal group and the sham group(P＜0.05).ConclusionsThe expression of obestatin increases in the circulation and kidneys of rats with heart failure.Obestatin might participate in the development of water retention in heart failure by endocrine and autocrine or paracrine secretion.

obestatin;heart failure;water balance

鄭興，E-mail：zhengxing57530@163.com

R541.6

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.01.002

1005-8982（2017）01-0006-05

2016-06-15

國家自然科學基金項目（No：81470517）