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    厭氧氨氧化功能微生物PCR—DGGE分析方法優(yōu)化

    2017-02-05 18:10畢瑋李祥劉恒蔚黃勇袁怡
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年10期

    畢瑋++李祥++劉恒蔚++黃勇++袁怡++劉忻

    doi:10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.026

    摘要:基于厭氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation,Anammox)開發(fā)的相關(guān)工藝在污水脫氮處理中具有重要作用;但Anammox微生物是一類目前尚不能分離和純培養(yǎng)的微生物,分析其功能微生物的類型,對(duì)于研究其生物學(xué)機(jī)理并改良其工藝具有重要意義。本研究對(duì)變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)在Anammox微生物應(yīng)用中的分析條件進(jìn)行了優(yōu)化,以提高PCR-DGGE的分析效果。結(jié)果表明,采用針對(duì)16S rDNA V3區(qū)的 GC-F341/R518引物組合,PCR最佳退火溫度為64 ℃;DGGE電泳中,最佳上樣量為5~7 μL,最佳膠濃度為8%,最佳電壓/時(shí)間為80 V/16 h。優(yōu)化后的PCR-DGGE具有準(zhǔn)確性高和靈敏度好的特點(diǎn)。

    關(guān)鍵詞:厭氧氨氧化;PCR-DGGE;微生物類型;條件優(yōu)化

    中圖分類號(hào): S188文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號(hào):1002-1302(2016)10-0110-03

    收稿日期:2015-09-30

    基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(編號(hào):51478284);國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金(編號(hào):51408387)。

    作者簡(jiǎn)介:畢瑋(1990—),男,碩士研究生,主要從事環(huán)境生物催化機(jī)理研究。E-mail:1012296010@qq.com。

    通信作者:劉恒蔚,博士,副教授。E-mail:liuhw@mail.usts.edu.cn。厭氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation,Anammox)是指厭氧氨氧化細(xì)菌在厭氧條件下以羥胺和肼為中間產(chǎn)物,以NH+4 為電子供體、NO2-為電子受體,將NH+4 和NO-2 轉(zhuǎn)變?yōu)镹2 的過程[1]。該反應(yīng)顛覆了人們對(duì)自然界氮素循環(huán)的傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)。此前普遍認(rèn)為通過異養(yǎng)反硝化即硝酸鹽還原生成N2,是地表氮素生成N2的唯一自然途徑,而目前卻發(fā)現(xiàn)Anammox反應(yīng)的廣泛存在。據(jù)估計(jì)由AAOB完成了海洋生態(tài)系統(tǒng)氮轉(zhuǎn)化的30%~50%[2]。Anammox過程在地表氮素循環(huán),包括農(nóng)業(yè)水體氮素循環(huán)中起著重要作用。基于Anammox過程研究者開發(fā)了多種污水處理工藝[3-6]。與傳統(tǒng)的硝化-反硝化工藝相比,優(yōu)點(diǎn)在于不需要額外電子供體,同時(shí)也可使剩余污泥產(chǎn)量降至最低,從而節(jié)省大量污泥處置費(fèi)用。厭氧氨氧化細(xì)菌(即Anammox菌)是一類不可培養(yǎng)的微生物類型,難以使用傳統(tǒng)手段進(jìn)行研究。目前共發(fā)現(xiàn)了包括Candidates Kuenen stuttgartiensis、Candidatus Brocadia anammoxidans、Candidatus Anammoxoglobus sulfate在內(nèi)的5個(gè)屬12個(gè)種之多,而且不同的研究得到的優(yōu)勢(shì)種群不同[7]。分析其功能微生物的類型,對(duì)于研究其生物學(xué)機(jī)理并改良其工藝具有重要意義。

    PCR結(jié)合變性梯度凝膠電泳(deatring gradient gel electrophoresis,DGGE)技術(shù)不但克服了傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法的局限性,而且可以對(duì)微生物種群進(jìn)行定性和定量,以及預(yù)測(cè)微生物種群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,成為研究環(huán)境微生物多樣性的常用手段之一。其主要原理是序列不同的DNA雙鏈解鏈所需的變性劑(尿素和甲酰胺)濃度也不同,在含梯度變性劑的凝膠電泳中,不同的DNA序列在不同的濃度處發(fā)生解鏈,導(dǎo)致空間構(gòu)型改變,電泳速率急劇下降,從而停留在不同的位置,形成條帶分開的指紋圖譜。為了提高DGGE的分辨率,可在引物的一端加上1個(gè)含30~50個(gè)堿基的“GC夾板”(GC clamp)[8]。理論上,DGGE可以檢測(cè)出只有1個(gè)堿基差異的DNA序列。但是DGGE效果受多種因素影響,特別是對(duì)于不同的引物和不同的樣品,PCR-DGGE分析的參數(shù)差別很大。例如使用不同引物在對(duì)厭氧污泥樣本PCR-DGGE分析中[5-6,9-15],聚丙烯酰胺凝膠濃度從5%~10%、電泳電壓從75~200 V均有使用。DGGE的分辨率直接影響結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性,而分辨率又會(huì)受到電泳中的變性劑梯度范圍、時(shí)間、電壓以及上樣量等因素影響;因此針對(duì)具體的樣品類型和引物,需對(duì)DGGE試驗(yàn)各個(gè)關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,才能達(dá)到預(yù)期的效果。16S rDNA是細(xì)菌系統(tǒng)分類研究中最常用的分子指紋,分子大小適中,在結(jié)構(gòu)與功能上具有高度的保守性?;?6S rDNA的V3區(qū)是微生物種群分析最常采用的目標(biāo)序列之一,在分子生態(tài)研究中有廣泛的應(yīng)用。

    本研究基于Anammox微生物16S rDNA的V3區(qū)的 GC-F341/R518引物組合,對(duì)PCR的退火溫度和DGGE的時(shí)間/電壓、膠的濃度以及上樣量進(jìn)行了優(yōu)化,該結(jié)果對(duì)于 Anammox 反應(yīng)相關(guān)微生物的分析具有參考意義。

    1材料與方法

    1.1材料

    1.1.1試驗(yàn)材料樣品來自蘇州科技學(xué)院環(huán)境生物技術(shù)研究所亞硝酸鹽型Anammox污泥。

    1.1.2主要儀器與試劑DNA快速提取試劑盒購自MPBIO公司;NanoDrop2000儀;ExTaq酶購自TaKaRa公司;DGGE電泳儀(AD0412LS-C50)、DGGE電泳槽(DCode型)、凝膠成像系統(tǒng)(Gel DocTM XR+)購自美國伯樂公司;引物由上海生工生物工程有限公司合成。

    1.2方法

    1.2.1核酸提取與PCR-DGGE分析污泥取樣后立即使用液氮研磨成干粉,-80 ℃保存?zhèn)溆?。使用DNA快速提取試劑盒提取DNA,提取的DNA經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)和NanoDrop2000儀定量并檢測(cè)質(zhì)量后使用。使用針對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V3可變區(qū)通用引物進(jìn)行PCR,引物序列為:CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTA

    CGGGAGGCAGCAG(即GC-F341);ATTACCGCGGCTGCTGG(即R518)。

    PCR擴(kuò)增體系總體積為30 μL,包括15 ng模板DNA,ExTaq酶1.5 U,10 μmol/L引物各1.5 μL,dNTPs Mixture(各2.5 mmol/L)3 μL,ExTaq酶buffer 3 μL,ddH2O補(bǔ)足至 30 μL。PCR擴(kuò)增采用98 ℃預(yù)變性30 s;98 ℃變性10 s,根據(jù)設(shè)置的溫度退火30 s,72 ℃延伸5 s,共29個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳檢測(cè)后,按不同上樣量均加入15 μL上樣緩沖液,并使用ddH2O補(bǔ)足至25 μL,利用DGGE電泳儀和DGGE電泳槽在變性梯度為45%~65%的聚丙烯酰胺凝膠中電泳(100%的變性劑濃度為體積分?jǐn)?shù)40% 甲酰胺和7 mol/L 尿素)。參考樂曉萍等的銀染方法[16]進(jìn)行染色。銀染時(shí)凝膠在固定液(含體積分?jǐn)?shù)10%乙醇和0.5%的乙酸)輕搖固定10 min,超純水漂洗1 min后放入染色液(含體積分?jǐn)?shù)2%硝酸銀)中染色15 min,超純水快速?zèng)_洗2次后放入顯影液(含體積分?jǐn)?shù)1.5%氫氧化鈉、體積分?jǐn)?shù)02%甲醛)中至顯影清晰,用超純水沖去殘余的顯影液。銀染結(jié)果通過凝膠成像系統(tǒng)照相分析。

    1.2.2PCR-DGGE優(yōu)化(1)PCR退火溫度的優(yōu)化:退火溫度從61~66 ℃之間設(shè)置6個(gè)梯度,梯度為1 ℃,PCR產(chǎn)物通過2.0%瓊脂糖電泳,選擇最合適的退火溫度用于PCR-DGGE分析以及后續(xù)優(yōu)化過程。(2)電泳時(shí)間和電壓的優(yōu)化:制備8%聚丙烯酰胺凝膠,設(shè)置60、80、100、120 V共4個(gè)電壓梯度;每隔2 h上樣1次,共上樣5次,即各設(shè)置5個(gè)時(shí)間梯度;上樣量為4.0 μL。在60 ℃條件下對(duì)不同電壓下分別進(jìn)行不同時(shí)間進(jìn)程的電泳試驗(yàn),以確定最佳的電壓/時(shí)間組合。(3)電泳上樣量的優(yōu)化:配制總體積相同、但PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不同的上樣體系,上樣量(PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)為1~10 μL,梯度1 μL。使用最適變性劑梯度和已確定的最佳電壓/時(shí)間條件,在8%聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳。(4)凝膠濃度優(yōu)化:使用上述已確定的上樣量、最佳電泳時(shí)間和電壓組合,分別配制濃度為6%、8%和10%的聚丙烯酰胺凝膠,根據(jù)電泳效果來確定最適合的膠濃度。

    2結(jié)果與分析

    2.1土壤基因組DNA的提取

    提取的Anammox樣品DNA經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果(圖1)表明,DNA樣品質(zhì)量較好,適合進(jìn)行PCR-DGGE分析。

    2.2PCR擴(kuò)增的退火溫度優(yōu)化

    圖2是61~66 ℃不同退火溫度下的PCR電泳結(jié)果。圖2表明,退火溫度為64 ℃時(shí),擴(kuò)增效率高,效果最好,是本研究的最佳退火溫度。電泳結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物大小與預(yù)計(jì)結(jié)果(230 bp)基本一致。

    2.3電泳時(shí)間和電壓的優(yōu)化

    本試驗(yàn)在預(yù)試中使用了200 V電壓進(jìn)行DGGE電泳,結(jié)果發(fā)現(xiàn),該電壓下條帶有彌散嚴(yán)重,分離效果較差,因此選擇在低電壓區(qū)進(jìn)行優(yōu)化。通過比較120 V(圖3-A)、100 V(圖3-B)、80 V(圖3-C)和60 V(圖3-D)的電泳結(jié)果說明,電壓高低對(duì)條帶的分離效果影響較為明顯,隨著電壓降低,彌散減弱,且條帶數(shù)增加,條帶更為清晰銳利。在80 V(圖3-C)和60 V(圖3-D)之間差異不大,均能得到數(shù)目較多且清晰銳利的條帶。隨著電泳時(shí)間延長(zhǎng),條帶分離更加明顯,易于區(qū)分,在80 V電壓時(shí),多數(shù)條帶在16 h時(shí)分離效果最好,延長(zhǎng)電泳時(shí)間變化不明顯,與60 V的電壓時(shí)18 h的電泳效果基本一致。鑒于此,選擇80 V/16 h作為最佳的電壓/時(shí)間組合。

    2.4電泳上樣量的優(yōu)化

    從圖4可以看出上樣量對(duì)DGGE圖譜也有著重要的影響。上樣量過少,部分條帶不清晰,染色后可見的條帶數(shù)偏少;上樣量過多,則圖譜的背景過重,不利于后續(xù)的分析。考慮到二者的平衡,在Anammox微生物的PCR-DGGE分析中選擇5~7 μL的上樣量效果最好。

    2.5凝膠濃度優(yōu)化

    本試驗(yàn)通過3種不同濃度的凝膠[分別是6%(圖5-A)、8%(圖5-B)、10%(圖5-C)]來判斷最佳的凝膠濃度。從圖5的3個(gè)濃度對(duì)比可以看出,8%凝膠的分離度最好,條帶清晰銳利,為最佳凝膠濃度選擇。

    3討論

    DGGE技術(shù)被廣泛用于分析環(huán)境樣本微生物群落的生物多樣性,適合調(diào)查種群的時(shí)空變化,并可以通過對(duì)目的條帶進(jìn)行序列分析來鑒定群落組成。理想的PCR引物和DGGE分析條件應(yīng)適合探測(cè)更多的微生物類型。例如王寧等對(duì)厭氧顆粒污泥PCR-DGGE分析進(jìn)行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)古菌和細(xì)菌在80 V/10 h的電泳條件下均能得到分離效果較好的DGGE 圖譜[17]。而本研究結(jié)果說明對(duì)于Anammox活性污泥,采用GC-F341/R518通用引物,PCR最佳退火溫度為64 ℃;變性劑濃度為45%~65%的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行DGGE電泳的最佳上樣量為5~7 μL,膠濃度為8%,最佳電壓/時(shí)間為80 V/16 h。由于本研究采用針對(duì)16S rDNA的V3區(qū)的特異引物,對(duì)于環(huán)境樣本的不同微生物種類將具有更廣泛的適用性。

    PCR和電泳是PCR-DGGE分析的2個(gè)最關(guān)鍵環(huán)節(jié),本試驗(yàn)研究表明適當(dāng)提高退火溫度有利于減少非特異性擴(kuò)增,上樣量的多少與膠濃度的大小也對(duì)DGGE的分辨率有重要影響。此外,與一般的PCR對(duì)模板DNA要求低不同,本研究中還發(fā)現(xiàn)DNA質(zhì)量對(duì)PCR影響較大,且PCR擴(kuò)增質(zhì)量顯著影響DGGE的分辨率。

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