蘋果炭疽菌DNA改良提取法及PCR體系的優(yōu)化

陳 汝,王金政,薛曉敏,王貴平

(山東省果樹研究所,山東 泰安 271000)

蘋果炭疽菌DNA改良提取法及PCR體系的優(yōu)化

陳 汝,王金政*,薛曉敏,王貴平

(山東省果樹研究所,山東 泰安 271000)

以蘋果炭疽病膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)為試材,采用改良的SDS法、改良的CTAB法和改良的尿素法等對基因組DNA進(jìn)行了提取和比較,并對ITS1-5.8S-ITS2區(qū)基因PCR擴(kuò)增體系中模板的添加量以及退火溫度進(jìn)行了調(diào)整和優(yōu)化。結(jié)果表明：采用這3種方法均能提取得到目的DNA,但采用改良的SDS法提取的基因組DNA產(chǎn)率最高、質(zhì)量最好;當(dāng)在25 μL PCR體系中添加0.75 μL粗提DNA 10倍稀釋液以及退火溫度設(shè)定為51 ℃時PCR產(chǎn)物的質(zhì)量最高。

蘋果炭疽病菌; DNA提取; PCR體系優(yōu)化

近年來,炭疽菌屬分類研究一直是國內(nèi)外研究的熱點,炭疽菌的準(zhǔn)確鑒定對于炭疽病的流行研究及防控策略的制定意義重大。通?；谛螒B(tài)學(xué)的鑒定是不夠準(zhǔn)確的。近年來,隨著分子生物學(xué)的發(fā)展, rDNA序列分析等分子生物學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于炭疽菌的鑒定與分類研究[1-4]。膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)會引起蘋果生長期和貯藏期侵染性病害的發(fā)生，造成蘋果產(chǎn)量和品質(zhì)的重大損失[5-7]。在分子生物學(xué)研究中,快速高效地提取質(zhì)量優(yōu)良的DNA是研究的基礎(chǔ)。目前常用液氮研磨法、玻璃珠機(jī)械破壁法、酶解法、氯化芐法和尿素法等來溶解細(xì)胞壁[8-9]。筆者以蘋果炭疽病膠孢炭疽菌為試材,改良并對比篩選出合適的DNA提取方法，得到了較高純度和產(chǎn)量的全基因組DNA,可以滿足后續(xù)的分子生物學(xué)實驗的要求。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

蘋果炭疽病膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides由本課題組提供,分離自紅富士蘋果果實。

1.2 病原菌菌絲的培養(yǎng)與預(yù)處理

將蘋果炭疽病菌移至PDA平板上活化,在25 ℃下培養(yǎng)32～48 h；切取菌落邊緣的菌絲塊移至PDA平板,在25 ℃下培養(yǎng),待菌絲長滿培養(yǎng)皿時收集菌絲。將收集到的菌絲放入研缽中,加入液氮研磨成粉狀,待用。

1.3 DNA提取方法

1.3.1 改良的SDS提取法[10]將研磨好的菌絲粉末置于已滅菌的1.5 mL的離心管內(nèi);加入100 μL SDS裂解液(含100 mmol/L Tris、30 mmol/L EDTA、1% SDS, pH 8.0,滅菌30 min);100 ℃水浴15 min;加入100 μL 2.5 mol/L的醋酸鉀,冰上放置30 min;在4 ℃下以12000 r/min離心5 min,將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管內(nèi);加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1),劇烈振蕩后,以12000 r/min離心15 min,將上清液轉(zhuǎn)移至另一滅菌的1.5 mL的離心管內(nèi);加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1),劇烈振蕩后,以12000 r/min離心15 min,將上清液轉(zhuǎn)移至另一滅菌的0.5 mL的離心管內(nèi);加入等體積、冷的異丙醇,在-20 ℃下靜置15 min;在4 ℃下以12000 r/min離心15 min;用100 μL 70%的乙醇洗沉淀;將沉淀自然晾干;加入50 μL已滅菌的ddH2O進(jìn)行溶解;置于-20 ℃冷藏備用。3次重復(fù)。

1.3.2 改良的CTAB提取法[11-12]將研磨好的菌絲粉末置于已滅菌的1.5 mL的離心管內(nèi);加入300 μL 15×CTAB提取緩沖液[含0.7 mol/L NaCl、100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、20 mmol/L EDTA、10 g/L PVP-360、50 g/L CTAB),裝管;65 ℃水浴1 h,每隔15 min振蕩混勻1次；加入100 μL 2.5 mol/L的醋酸鉀,冰上放置30 min;在4 ℃下以12000 r/min離心5 min;其他操作同改良的SDS提取法。3次重復(fù)。

1.3.3 改良的尿素提取法[13]將研磨好的菌絲粉末置于已滅菌的1.5 mL的離心管內(nèi);加入300 μL尿素提取液[含7 mol/L尿素、50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、62.5 mmol/L NaCl、1%SDS],65 ℃水浴1 h,每隔15 min振蕩混勻1次；加入100 μL 2.5 mol/L的醋酸鉀,冰上放置30 min;其他操作同改良的SDS提取法。3次重復(fù)。

1.4 ITS1-5.8S-ITS2區(qū)基因PCR擴(kuò)增

以菌絲總DNA的10倍稀釋液為模板,對ITS區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增,以ITS1(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)[14]和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[15]為引物,這對引物由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。

25 μL PCR反應(yīng)體系: 2.5 μL 10×PCR buffer (2.5 mmol/L,含Mg2+)、2.0 μL dNTPs (2.5 mmol/L)、0.5 μL ITS1 (10.0 μmol/L)、0.5 μL ITS4 (10.0 μmol/L)、0.75 μL或1.00 μL DNA模板、0.25 μL (5.0 U/μL)Taq 酶、17.5 μL或18.5 μL滅菌水。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)在BIO-RAD S1000TM PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件如下:94 ℃ 5 min;94 ℃45 s,51 ℃或53 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。

1.5 DNA凝膠電泳的檢測

對提取的植物病原真菌DNA以及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物各取3 μL，用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測,用Gelstain熒光核酸染料染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取的電泳檢測

由圖1可以看出,改良的SDS法、改良的CTAB法以及改良的尿素法均能提取到大量的DNA。其中改良的SDS法提取的基因組DNA完整性較好,條帶較窄,亮度較大,降解較少;改良的尿素法與改良的CTAB法提取到的基因組DNA完整性較差,條帶較寬,稍有降解。

2.2 ITS1-5.8S-ITS2區(qū)PCR擴(kuò)增的電泳檢測

由圖2可知,所有泳道的條帶均為單一目的條帶,均在500～700 bp之間,說明3種DNA提取方法均能滿足PCR的質(zhì)量要求。圖2中數(shù)字編號為3種不同的DNA提取方法(1為改良的SDS法，2為改良的CTAB法，3為改良的尿素法)以DNA為模板PCR擴(kuò)增所得的目的條帶數(shù),兩次重復(fù)；大寫字母編號表示不同的25 μL PCR反應(yīng)體系和退火溫度。在A編號的所有泳道中雖能得到目的條帶,但條帶亮度最暗,PCR結(jié)果最差。在C編號的所有泳道中雖能得到目的條帶,但條帶亮度參差不齊。在B編號的所有泳道中條帶亮度最高,都很清晰整齊,PCR結(jié)果最好。說明以0.75 μL DNA為模板,退火溫度為51 ℃時PCR效果最佳。

3 討論與結(jié)論

絲狀真菌基因組DNA的提取率和純度對后續(xù)的PCR、酶切等實驗有重要的影響[16-17]。絲狀真菌DNA的提取方法雖已得到了改進(jìn)和簡化,但針對不同植物病原菌DNA的提取效果差異明顯。目前,針對絲狀真菌DNA的提取廣泛采用的傳統(tǒng)CTAB法是借鑒提取植物基因組的方法改進(jìn)而來的[18]。改進(jìn)后的CTAB法獲得的基因組比率以及質(zhì)量也較傳統(tǒng)方法高。本文針對蘋果炭疽病菌采用改良的SDS提取法,提取DNA的質(zhì)量最好。在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌絲的多糖含量高,在DNA提取、純化過程中多糖殘留量較大,若大量去除多糖則會增加DNA的損失[16]。因此本文采用PDA平板培養(yǎng)菌絲，再從這些菌絲中提取DNA,這樣有效地減少了多糖對DNA的污染；此外,提取液中添加的SDS[19]、PVP[20]以及水浴之后用高濃度的醋酸鉀溶液冰上沉淀[10]均能有效地去除多糖。

在PCR反應(yīng)體系中,模板不是越多越好,可以通過倍比稀釋法來確定合適的模板濃度;對于退火溫度,過低時非特異性擴(kuò)增增加,過高時產(chǎn)率會下降。本文將粗提的DNA溶解后再稀釋10倍作為PCR擴(kuò)增的模板,能有效地降低粗提DNA中酚類、多糖等的濃度,減少對PCR擴(kuò)增的影響。此外,本實驗對PCR反應(yīng)體系中模板的添加量以及退火溫度均進(jìn)行了調(diào)整,得出當(dāng)在25 μL PCR體系中添加0.75 μL粗提DNA 10倍稀釋液以及退火溫度設(shè)定為51 ℃時PCR產(chǎn)物的質(zhì)量最高。

[1] 徐成楠,王亞南,胡同樂,等.藍(lán)莓炭疽病病原菌鑒定及致病性測定[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,47(20):3992-3998.

[2] 劉威,葉乃興,陳玉森,等.茶樹炭疽菌Colletotrichumfructicola的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J].茶葉科學(xué),2014,34(1):95-104.

[3] Weir B S, Johnston P R, Damm U. TheColletotrichumgloeosporioidesspecies complex [J]. Studies in Mycology, 2012, 73: 115-180.

[4] Cannon P F, Damm U, Johnston P R, et al.Colletotrichum: current status and future directions [J]. Studies in Mycology, 2012, 73: 181-213.

[5] 周慧杰,郭玲.蘋果炭疽病菌生物學(xué)特性研究[J].北方園藝,2012(22):133-135.

[6] 李娜,檀根甲,李增智.蘋果炭疽菌低毒性菌株生物學(xué)特性的研究[J].激光生物學(xué)報,2008,17(1):64-69.

[7] Velho A C, Alaniz S, Casanova L, et al. New insights into the characterization ofColletotrichumspecies associated with apple diseases in southern Brazil and Uruguay [J]. Fungal Biology, 2015, 119(4): 229-244.

[8] 吳發(fā)紅,黃東益,黃小龍,等.幾種真菌DNA提取方法的比較[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2009,25(8):62-64.

[9] 孫立夫,張艷華,裴克全.一種高效提取真菌總DNA的方法[J].菌物學(xué)報,2009,28(2):299-302.

[10] Makimura K, Murayama Y S, Yamaguchi H. Detection of a wide range of medically important fungal species by polymerase chain reaction (PCR) [J]. Journal of Medical Microbiology, 1994, 40: 358 -364.

[11] 易潤華,朱西儒,周而勛.簡化CTAB法快速微量提取絲狀真菌DNA[J].湛江海洋大學(xué)學(xué)報,2003,23(6):72-73.

[12] 張穎慧,魏東盛,邢來君,等.一種改進(jìn)的絲狀真菌DNA提取方法[J].微生物學(xué)通報,2008,35(3):466-469.

[13] 劉少華,陸金萍,朱瑞良,等.一種快速簡便的植物病原真菌基因組DNA提取方法[J].植物病理學(xué)報,2005,35(4):362-365.

[14] Gardes M, Bruns T D. ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes: application to the identification of mycorrhizae and rusts [J]. Molecular Ecology, 1993(2): 113-118.

[15] White T J, Bruns T, Lee S, et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics [M]//Innis M A, Gelfand D H, Sninsky J J, et al. PCR protocols: a guide to methods and applications. New York: Academic Press, 1990: 315-322.

[16] 劉麗,張永軍,許長征,等.一種改良的CTAB法提取產(chǎn)多糖真菌DNA[J].中國生物工程雜志,2014,34(5):75-79.

[17] 劉素玲,冉玉平,曾蔚,等.一種適用于PCR反應(yīng)的酵母菌、無綠藻及絲狀真菌DNA提取方法[J].中國真菌學(xué)雜志,2006,1(6):340-342.

[18] 易慶平,羅正榮,張青林.植物總基因組DNA提取純化方法綜述[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(25):7789-7791.

[19] 周禮紅.一種制備富含多糖絲狀真菌基因組DNA的提取方法[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,47(4):379-381.

[20] Shankar K, Chavan L, Shinde S, et al. An improved DNA extraction protocol from four in vitro banana cultivars [J]. Asian J Biotechnol, 2011, 3(1): 84-90.

(責(zé)任編輯:黃榮華)

Comparison of Several Modified DNA Extraction Methods andOptimization of PCR System forColletotrichumgloeosporioidesin Apple

CHEN Ru, WANG Jin-zheng*, XUE Xiao-min, WANG Gui-ping

(Shandong Institute of Pomology, Tai’an 271000, China)

The genomic DNA ofColletotrichumgloeosporioidesin apple was extracted and compared by modified SDS method, modified CTAB method and modified urea method, and the additive amount of template and the annealing temperature in the PCR system for the amplification of ITS1-5.8S-ITS2 gene were adjusted and optimized. The results showed that using the above three methods all could get the target DNA, but the yield of genomic DNA extracted by modified SDS method was the highest and its quality was the best. When 0.75 μL 10-fold dilution of the extracted crude DNA was added into 25 μL PCR system and the annealing temperature was set as 51 ℃, the quality of the PCR product was the highest.

Colletotrichumgloeosporioides; DNA extraction; Optimization of PCR system

2016-11-24

山東省自然科學(xué)基金項目(BS2015NY008);國家自然科學(xué)基金項目(31600021);國家重點研發(fā)計劃(2016YFD0201100); 國家現(xiàn)代蘋果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(CARS-28);“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃課題(2014BAD16B02-2)。

陳汝(1985─),女,助理研究員,博士,從事果園微生物與栽培生理研究。*通訊作者:王金政。

S436.611.12

A

1001-8581(2017)04-0069-03