水稻胚乳細(xì)胞生物反應(yīng)器研究進(jìn)展

丁一 魏際華 張寧* 舒小麗 吳殿星

（浙江大學(xué)應(yīng)用生物科學(xué)系，杭州310029；第一作者：3110100088@zju.edu.cn；*通訊作者：11216028@zju.edu.cn）

水稻胚乳細(xì)胞生物反應(yīng)器研究進(jìn)展

丁一 魏際華 張寧* 舒小麗 吳殿星

（浙江大學(xué)應(yīng)用生物科學(xué)系，杭州310029；第一作者：3110100088@zju.edu.cn；*通訊作者：11216028@zju.edu.cn）

水稻胚乳細(xì)胞生物反應(yīng)器是一種理想的生物活性物質(zhì)生產(chǎn)工廠，本文綜述了以水稻胚乳細(xì)胞為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物蛋白、疫苗、功能肽及非蛋白類(lèi)生物活性物質(zhì)的研究進(jìn)展。

水稻胚乳生物反應(yīng)器；藥用蛋白；疫苗；功能肽

1 水稻胚乳細(xì)胞生物反應(yīng)器的概念與技術(shù)優(yōu)勢(shì)

生物反應(yīng)器是指通過(guò)基因工程技術(shù)生產(chǎn)諸如疫苗、抗體、藥用蛋白等人類(lèi)疾病治療藥物或相關(guān)保健產(chǎn)品的生物工廠[1-4]。水稻是世界重要的主糧之一，它高度自交、花粉壽命短，是一種生態(tài)安全可控的轉(zhuǎn)基因作物。水稻胚乳細(xì)胞生物反應(yīng)器是利用水稻種子作為生產(chǎn)空間，在胚乳中大量表達(dá)目的蛋白及其他生物活性物質(zhì)。該生產(chǎn)方式較為成熟，具有表達(dá)水平相對(duì)較高、生產(chǎn)成本低、加工步驟簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。

以水稻胚乳為生物反應(yīng)器具有顯著的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，表現(xiàn)在：（1）水稻胚乳可以提供相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境便于蛋白質(zhì)的儲(chǔ)存，且所表達(dá)的蛋白具有較好的親和性、低敏性；（2）水稻產(chǎn)量較高，蛋白質(zhì)含量介于8%～19%，有利于大規(guī)模富集；（3）稻米蛋白主要儲(chǔ)存在蛋白體中，提取較為方便；（4）稻米可存儲(chǔ)多年且蛋白不易因變性降解等導(dǎo)致功能損失，因此下游加工可以獨(dú)立于生長(zhǎng)季節(jié)進(jìn)行；（5）已發(fā)掘闡明了一些表達(dá)能力較強(qiáng)的胚乳啟動(dòng)子，如Gt-1、Gt-2、Gt-3、Gt-13等；（6）由于水稻嚴(yán)格自交，保證了轉(zhuǎn)基因在生態(tài)環(huán)境上的安全性；（7）生產(chǎn)水稻種子疫苗可以成為無(wú)需純化的口服疫苗。

2 水稻胚乳細(xì)胞生物反應(yīng)器在藥用蛋白生產(chǎn)上的研究

2.1 人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子

人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Human granulocyte-macrohage colony-stimulating factor，hGM-CSF）是一種由人體中的成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生的糖蛋白激素，它可以在很低的濃度下擴(kuò)散到全身，并在體內(nèi)或體外刺激造血細(xì)胞的增殖和分化。由于其在免疫系統(tǒng)中扮演著極其重要的角色，hGM-CSF已經(jīng)被廣泛用于癌癥化療和骨髓抑制療法所引起的白細(xì)胞減少癥，以及在骨髓移植之后、艾滋病治療恢復(fù)中的促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖。在酵母、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及植物中已建立了相關(guān)表達(dá)系統(tǒng)，但效率不高。

Ning等[5-6]在水稻胚乳中建立了rhGM-CSF的表達(dá)系統(tǒng)，通過(guò)使用胚乳特異性強(qiáng)啟動(dòng)子和最優(yōu)密碼子顯著提高了重組表達(dá)水平，產(chǎn)物可用于治療白細(xì)胞減少癥。研究者通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)篩選得到轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)一步驗(yàn)證表明，該轉(zhuǎn)基因植株能大量且僅在胚乳中表達(dá)hGM-CSF蛋白，同時(shí)亞細(xì)胞定位表明其主要在蛋白體I中表達(dá)；所得到的OsrhGM-CSF經(jīng)小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，口服未加工的種子可以有效提高小鼠白細(xì)胞的增殖，表明該蛋白與rhGM-CSF具有相同的生物活性。Sardana等[7]也在水稻胚乳中利用Gt1啟動(dòng)子成功表達(dá)了rhGM-CSF，但表達(dá)效率不高。

2.2 人胰島素樣生長(zhǎng)因子1

人胰島素樣生長(zhǎng)因子1（Human insulin-like growth factors 1,hIGF-1）是一個(gè)具有70個(gè)氨基酸的單環(huán)小肽，是調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、生存、代謝的重要生長(zhǎng)因子，在臨床上可用于治療生長(zhǎng)激素（Growth hormone,GH）受體缺陷、GH不敏感綜合征、hIGF-1基因缺失或GH信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的基因缺陷導(dǎo)致的對(duì)GH反應(yīng)性降低等病癥，對(duì)于I型和Ⅱ型糖尿病及嚴(yán)重的胰島素抗性綜合癥也有一定療效。為滿足市場(chǎng)需求，大量的重組人胰島素樣生長(zhǎng)因子1（rhIGF-1）在大腸桿菌、酵母、轉(zhuǎn)基因兔子和植物中的制備工藝已被構(gòu)建。

Xie等[8]成功實(shí)現(xiàn)了在水稻胚乳中積累OsrIGF-1，且每粒種子中含量約為136±10μg，達(dá)種子總蛋白的（6.8±0.5）%；進(jìn)一步功能分析表明，OsrIGF-1的融合可以刺激人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的體外增殖；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，糖尿病小鼠服用未加工的轉(zhuǎn)基因種子，其血漿中的rhIGF-1水平提高，血糖含量降低；葡萄糖及胰島素耐量測(cè)試結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因種子可以通過(guò)增加胰島素的分泌量而非增強(qiáng)胰島素的敏感性而降低血糖；深入組織學(xué)觀察表明，OsrIGF-1可以通過(guò)提高胰島的活性進(jìn)而刺激胰島素的分泌。

2.3 人血清白蛋白

人血清白蛋白（Human scrum albumin，HSA）是一種水溶性的球形非糖基單體蛋白，是人血液中最主要的蛋白質(zhì)，占血漿的30%和血清的70%。HSA是一種重要的載體蛋白，用以運(yùn)輸類(lèi)固醇激素、脂肪酸、甲狀腺激素等，同時(shí)在穩(wěn)定細(xì)胞外液上也具有重要功能。目前，HSA在臨床上被廣泛用于各種失血性休克的治療、燒傷和燙傷的體液補(bǔ)充、腦水腫、腎水腫和肝腹水等的治療，以及癌癥和艾滋病的輔助治療等。包括大腸桿菌、釀酒酵母、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因植物等大量的表達(dá)系統(tǒng)都被用于研究和生產(chǎn)HSA，但都沒(méi)有實(shí)現(xiàn)大規(guī)模、高效、低成本的目標(biāo)。

Yang等[9-11]以水稻胚乳為反應(yīng)器，通過(guò)胚乳特異性表達(dá)、密碼子優(yōu)化及蛋白質(zhì)定向儲(chǔ)藏等技術(shù)實(shí)現(xiàn)了重組人血清蛋白（rHSA）的生產(chǎn)。他們從基因組TP309中擴(kuò)增出1241bp的Gt13a啟動(dòng)子及信號(hào)肽序列與成熟HSA基因融合，通過(guò)農(nóng)桿菌共轉(zhuǎn)化技術(shù)篩選得到25個(gè)轉(zhuǎn)基因植株，其中9株高產(chǎn)，最高可增產(chǎn)10.58%，遺傳穩(wěn)定。細(xì)胞學(xué)分析可知，OsrHSA在胚乳細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中表達(dá)；進(jìn)一步將得到的OsrHSA與從人血漿中提取的血清蛋白（pHSA）進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的對(duì)比，它們?cè)诜肿恿?、氨基酸序列、N-及C-末端序列、熔點(diǎn)上均相同；圓二色譜在近及遠(yuǎn)紫外區(qū)均匹配，光譜分析進(jìn)一步證實(shí)了其二、高級(jí)結(jié)構(gòu)均相同；體外生物活性研究顯示，OsrHSA比小牛胎血清蛋白（FSA）和pHSA能更好地刺激動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)，與pHSA具有相同的酯酶活性。利用這種方法生產(chǎn)OsrHSA具有成本低、效率高的優(yōu)點(diǎn)，表達(dá)量高達(dá)2.75 g/kg糙米，純度可達(dá)99%，目前已經(jīng)具備了單批次生產(chǎn)50～60 g的工藝，并開(kāi)始進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)和藥效試驗(yàn)。

2.4 人類(lèi)α-1-抗胰蛋白酶

人類(lèi)α-1-抗胰蛋白酶（α-1-antitrypsin，AAT），又稱(chēng)為人類(lèi)α-1-蛋白酶抑制劑，是血漿中最重要的一種蛋白酶抑制劑，用于保護(hù)肌體正常細(xì)胞和器官不受蛋白酶損傷。AAT主要在肝臟中形成，在肺中抑制中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶。AAT缺乏癥是一種遺傳性疾病，常伴隨肺氣腫和肝臟疾病。目前，市場(chǎng)上使用的AAT主要是從人的血漿中獲取，因此具有與HSA一樣的困境。在大腸桿菌、酵母、黑曲霉菌、動(dòng)物、植物中均研究建立了rAAT的表達(dá)系統(tǒng)，但rAAT大規(guī)模生產(chǎn)仍受限制。

Zhang等[12]通過(guò)擴(kuò)增出2832bp的Gt13a啟動(dòng)子及信號(hào)肽序列AAT基因融合，通過(guò)共轉(zhuǎn)化技術(shù)篩選得到了在胚乳中表達(dá)OsrAAT的轉(zhuǎn)基因水稻，其產(chǎn)量可達(dá)2.24 g/kg糙米，純度高達(dá)97%；進(jìn)一步研究表明所得到的OsrAAT與pAAT是因蛋白質(zhì)糖基化的差異而形成的異構(gòu)體，該異構(gòu)體之間在生物活性及次級(jí)結(jié)構(gòu)上無(wú)顯著差異。免疫電鏡結(jié)果表明，OsrAAT表達(dá)在水稻胚乳中，糖鏈分析的結(jié)果表明，主要的聚糖分子為小泡特異性的寡甘露糖型。

2.5 纖維素生長(zhǎng)因子

纖維素生長(zhǎng)因子（Fiber growth factor,FGFs）是一類(lèi)結(jié)構(gòu)相似、具有相同生物活性功能的肝素結(jié)合多肽蛋白家族。目前，已經(jīng)分離出23種不同的FGFs，其中，堿性纖維生長(zhǎng)因子（Basic fibroblastgrowth facto,bFGF）于1978年在牛腦中被分離。bFGF是一個(gè)傳遞發(fā)育信號(hào)、能促進(jìn)中胚層和神經(jīng)外胚層細(xì)胞分裂的多肽，具有強(qiáng)烈的血管生成作用，可用于刺激乳腺上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)及治療哮喘。在臨床上，bFGF廣泛用于傷口和燙傷部位的恢復(fù)治療，以及心血管和神經(jīng)退行性疾病的組織修復(fù)、傷口愈合等方面。在大腸桿菌、甲醇酵母、大豆種子、蠶、枯草桿菌等上均已建立表達(dá)系統(tǒng)，但存在產(chǎn)量低、工藝復(fù)雜、可溶性差等一系列的問(wèn)題。

An等[13]成功利用水稻胚乳來(lái)表達(dá)OsrbFGF，其表達(dá)水平高達(dá)99.11~185.66 mg/kg糙米，純度可達(dá)95%以上。深入研究表明，OsrbFGF與rbFGF具有相同的激發(fā)NIH/3T3細(xì)胞增殖的能力。

2.6 人溶菌酶

人乳中通常含有50~400μg/mL的溶菌酶（Homan iysozyme,Hlys），在眼淚、唾液等其他分泌物中也存在該酶。Hlys是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶，主要通過(guò)破壞細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1,4糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌溶解。母乳中含很多類(lèi)似Hlys的特別蛋白質(zhì)，而市售的嬰兒配方奶粉和嬰兒食品均缺乏這些成分，這是臨床上兒科醫(yī)生建議新生兒采用母乳喂養(yǎng)的原因之一。因此，由于各種原因?qū)е聼o(wú)法進(jìn)行母乳喂養(yǎng)的新生兒，必須要及時(shí)補(bǔ)充包括Hlys在內(nèi)的相關(guān)蛋白質(zhì)。目前，已經(jīng)在釀酒酵母、米曲菌、小鼠、煙草和胡蘿卜中建立了重組人溶菌酶（rHlys）的表達(dá)系統(tǒng)，但表達(dá)水平較低。

Huang等[14]通過(guò)利用Gt-1啟動(dòng)子及其信號(hào)肽區(qū)域構(gòu)建了Hlys基因相應(yīng)的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入水稻中獲得了在胚乳表達(dá)rHlys的轉(zhuǎn)基因植株，產(chǎn)量平均可達(dá)糙米質(zhì)量的0.6%，占總可溶性蛋白的45%。進(jìn)一步研究表明，與Hlys相比較，rHlys表現(xiàn)出同等的殺菌能力。該產(chǎn)品目前已經(jīng)商業(yè)化，名稱(chēng)為L(zhǎng)ysobac?。

2.7 乳鐵蛋白

乳鐵蛋白（Lactoferrin,LF）是乳汁中一種重要的非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，中性粒細(xì)胞顆粒中具有殺菌活性的單體糖蛋白。其分子量約為80 kDa，主要由乳腺上皮細(xì)胞表達(dá)和分泌。LF是一種多功能蛋白質(zhì)，不僅參與鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)，而且具有廣譜抗菌、抗氧化、抗癌、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等生物功能，被認(rèn)為是一種新型抗菌、抗癌藥物和極具開(kāi)發(fā)潛力的食品和飼料添加劑。在微生物、動(dòng)物和植物中，均已建立重組人乳鐵蛋白（rhLF）的表達(dá)體系。

Nandi等[15]利用水稻胚乳作為反應(yīng)器，得到的rhLF表達(dá)水平為4.5~5.5 g/kg糙米，純度可達(dá)94%。深入研究表明，rhLF與普通hLF具有相似的分子質(zhì)量、相同的等電點(diǎn)、相同的鐵釋放能力及抗體免疫反應(yīng)性，氨基酸及N端序列結(jié)果也高度相同。該產(chǎn)品目前已經(jīng)商業(yè)化，名稱(chēng)為L(zhǎng)acromin?。

2.8 人類(lèi)生長(zhǎng)素

人類(lèi)生長(zhǎng)素（Human growth hormone,hGH）又稱(chēng)青春素，是由腦垂體前葉，含有嗜酸性顆粒的生長(zhǎng)激素分泌細(xì)胞所分泌的由191個(gè)氨基酸構(gòu)成的肽類(lèi)激素。hGH擁有廣泛的生物學(xué)功能，能夠促進(jìn)肌體和皮膚細(xì)胞分化、增殖，激活沉睡的休眠細(xì)胞，加快新生細(xì)胞對(duì)衰老細(xì)胞的替換速度，達(dá)到逆轉(zhuǎn)衰老，推遲更年期和改善皮膚色斑、精神倦怠、免疫力低下的功效。目前在大腸桿菌中已建立了hGH的表達(dá)體系，并實(shí)現(xiàn)了部分產(chǎn)業(yè)化。

Kim等[16]通過(guò)基因槍法，將合成的hGH的基因?qū)胨局?，并最終在轉(zhuǎn)基因水稻種子胚乳中獲得了重組hGH，其積累量可達(dá)57mg/L懸浮細(xì)胞液。進(jìn)一步研究表明，其與通過(guò)大腸桿菌得到的重組hGH具有相同的生物活性。

2.9 胰高血糖素樣肽-1

胰高血糖素樣肽-1（Glucagon-like peptide 1,GLP-1）是機(jī)體在響應(yīng)營(yíng)養(yǎng)攝入時(shí)釋放的一類(lèi)腸促胰島素，主要由腸道末端內(nèi)分泌L細(xì)胞分泌，可抑制胃排空，減少腸蠕動(dòng)，在糖尿病治療中具有巨大的應(yīng)用潛力。

為了在水稻胚乳中積累GLP-1，Yasuda等[17]通過(guò)直接合成密碼子優(yōu)化的GLP-1，利用水稻貯藏蛋白谷蛋白GluB-1基因啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因水稻植株中表達(dá)GLP-1，最終未檢測(cè)到目的產(chǎn)物，只存在一些siRNAs。這表明，在轉(zhuǎn)基因水稻種子中，GLP-1被共抑制沉默。

2.10 人類(lèi)白細(xì)胞介素-10和7，小鼠白細(xì)胞介素-4和6

人類(lèi)白細(xì)胞介素-10（human interleukin-10，hIL-10）主要由Th2細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種重要細(xì)胞因子，能夠抑制前炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生并促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖與分化。目前，其已能在胚乳特異的GluB-1啟動(dòng)子誘導(dǎo)下在轉(zhuǎn)基因水稻種子中成功表達(dá)。在提取純化后發(fā)現(xiàn)，所得蛋白活性比來(lái)源于細(xì)菌系統(tǒng)的市售該蛋白活性更高[18]。其表達(dá)水平可以通過(guò)進(jìn)一步降低內(nèi)源儲(chǔ)存蛋白的方式來(lái)提高[19]。

人類(lèi)白細(xì)胞介素-7（human interleukin-7，hIL-7)是由骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌的，可以促進(jìn)B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞不成熟前體擴(kuò)增的一種重要的細(xì)胞因子，對(duì)于維持淋巴系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)有著關(guān)鍵的作用。Kudo等[20]成功在轉(zhuǎn)基因水稻種子胚乳中以分泌蛋白的形式表達(dá)了hIL-7。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，hIL-7以聚合體的形式表達(dá)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，而并非蛋白體中。高濃度的hIL-7的積累會(huì)增強(qiáng)伴侶蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的降解系統(tǒng)（ER-associated degradation，ERAD），因此，隨著hIL-7的表達(dá)，水稻的粒型會(huì)發(fā)生變化。

一些小鼠白細(xì)胞介素（mouse interleukin，m IL）同樣可以在水稻中成功表達(dá)。m IL-4是一種2型T細(xì)胞輔助因子，可以激活T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖、B細(xì)胞的轉(zhuǎn)化等。m IL-6可以刺激B細(xì)胞的增殖及抗體的分泌。Fujiwara等[21]在轉(zhuǎn)基因水稻種子中成功表達(dá)出2種細(xì)胞介素，表達(dá)量分別為0.43 mg/g和0.16 mg/g。提純后的m IL-4及m IL-6均表現(xiàn)出較高的活性以及極低的內(nèi)毒素污染水平。

2.11 人酸性α-葡萄糖苷酶

人酸性α-葡萄糖苷酶（Human Acid alpha glucosidase，hGAA）是一種糖原降解溶酶體酶，可催化降解糖原形成葡萄糖。該酶的缺乏會(huì)導(dǎo)致龐培氏病，即Ⅱ型糖原貯存癥，或稱(chēng)心肌糖厚沉積病，是一種先天性代謝病，會(huì)引起心臟迅速增大。Jung等[22]將來(lái)自于人胎盤(pán)細(xì)胞的hGAA的cDNA片段通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入水稻中，成功在水稻中表達(dá)該酶，表達(dá)水平在11 d后達(dá)37 mg/L。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，在轉(zhuǎn)基因水稻中產(chǎn)生的GAA與在倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中生產(chǎn)的GAA具有相似的酶功能。

3 水稻胚乳細(xì)胞生物反應(yīng)器在疫苗生產(chǎn)上的研究

3.1 雞傳染性氏囊病疫苗

雞傳染性氏囊?。↖nfectious bursal disease,IBD）又稱(chēng)甘波羅病，是傳染性法氏囊病毒（IBDV）引起的一種急性、高度傳染性疾病。由于該病發(fā)病突然、病程短、死亡率高，目前仍然是養(yǎng)雞業(yè)的主要傳染病之一。該病毒的主要保護(hù)性抗原為VP2蛋白，能誘發(fā)雞對(duì)該病的免疫能力。該蛋白在酵母體系中已成功表達(dá)。Wu等[23]利用水稻谷蛋白GluA-2的啟動(dòng)子Gt1構(gòu)建共表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)得到121個(gè)轉(zhuǎn)基因植株，其VP2蛋白表達(dá)水平為0.648%~4.521%。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)基因水稻種子胚乳所產(chǎn)生的IBDV的VP2蛋白具有高效、安全、低廉的特點(diǎn)。

3.2 豬蛔蟲(chóng)病疫苗

豬蛔蟲(chóng)病是由豬蛔蟲(chóng)寄生于豬小腸引起的一種線蟲(chóng)病，呈世界性流行特征，在集約化養(yǎng)豬場(chǎng)和散養(yǎng)豬中均廣泛發(fā)生，是造成養(yǎng)豬業(yè)損失最嚴(yán)重的寄生蟲(chóng)病之一。豬蛔蟲(chóng)是寄生于豬小腸中最大的一種線蟲(chóng)。As16（Ascaris suum 16）是一種豬蛔蟲(chóng)的保護(hù)性抗原。Yasunobu等[24]利用水稻胚乳生產(chǎn)As16，這種抗原以與霍亂毒素（CT）B亞單位CTB的融合體的形式被生產(chǎn)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，將轉(zhuǎn)基因得到的水稻種子喂食小鼠，會(huì)引發(fā)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生As16特異性的血清抗體免疫應(yīng)答，并伴隨與黏膜佐劑霍亂毒素結(jié)合。雖然疫苗的佐劑配方導(dǎo)致未能繼續(xù)提高特異性免疫應(yīng)答，但重組As16能誘導(dǎo)抗體表達(dá)也表明利用水稻胚乳生產(chǎn)該疫苗具有可行性。

3.3 阿爾茨海默病疫苗

阿爾茨海默病是一種起病隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。臨床上以記憶障礙、失語(yǔ)、失用、失認(rèn)、視空間技能損害、執(zhí)行功能障礙以及人格和行為改變等全面性癡呆為表現(xiàn)特征。Yoshida[25]等將經(jīng)水稻偏好密碼子優(yōu)化的β果淀粉樣肽編碼DNA與綠色熒光蛋白基因融合構(gòu)建表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化，并篩選出轉(zhuǎn)基因水稻。通過(guò)口服轉(zhuǎn)基因糙米實(shí)驗(yàn)飼喂小鼠評(píng)價(jià)表達(dá)蛋白的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水稻胚乳所表達(dá)的β果淀粉樣肽可以作為一種有效預(yù)防阿爾茨海默病的疫苗。該研究為提供高效、充足、低價(jià)的醫(yī)用疫苗奠定了良好的基礎(chǔ)。

3.4 房塵螨疫苗

房塵螨是一種世界性分布的最強(qiáng)烈的過(guò)敏原，80%以上的反復(fù)咳嗽、氣喘和塵螨過(guò)敏有關(guān)。塵螨過(guò)敏原Dermatophagoides pteronyssinus（Der p）和Dermatophagoides farinae（Der f）是主要的吸入性過(guò)敏原，會(huì)導(dǎo)致支氣管哮喘、鼻炎、過(guò)敏性皮炎等慢性過(guò)敏性疾病。Yang[26]等采用水稻種子表達(dá)了房塵螨I類(lèi)變應(yīng)原（Dermatophagoides pteronyssinus 1，Der p1），且發(fā)現(xiàn)其在轉(zhuǎn)錄后修飾過(guò)程中具有與動(dòng)物細(xì)胞相似的高甘露糖型糖基化修飾模式。將該表達(dá)體系所生產(chǎn)的Der p1開(kāi)發(fā)成為一種安全、高效治療屋塵螨的口服疫苗有巨大潛力。

Suzuki等[27]通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在轉(zhuǎn)基因水稻中成功表達(dá)了含有小鼠及人T細(xì)胞抗原決定簇的Der p1（Der p的p45-145片段）。將純化后的rDer p 1導(dǎo)入小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，其血清中的Der p特異性抗體水平顯著增加，同時(shí)可以抑制過(guò)敏原誘發(fā)的氣道炎癥。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明，該疫苗不會(huì)導(dǎo)致實(shí)現(xiàn)疫苗口服的一大難題——非特異性的旁路抑制，對(duì)于治療包括支氣管哮喘在內(nèi)的過(guò)敏性疾病有重要意義。

3.5 幽門(mén)螺桿菌疫苗

幽門(mén)螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）是引起慢性胃炎、胃潰瘍及胃惡性腫瘤的主要原因之一。Gu等[28]將幽門(mén)螺桿菌ureB抗原基因克隆到gus的5’-c端，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)將構(gòu)好的載體轉(zhuǎn)入水稻中，共成功得到了30株轉(zhuǎn)基因植株，最后得到了可以產(chǎn)生實(shí)用幽門(mén)螺桿菌疫苗的轉(zhuǎn)基因水稻，該疫苗對(duì)幽門(mén)螺桿菌引發(fā)的疾病的治療有重要意義。

3.6 輪狀病毒疫苗

輪狀病毒（Rotavirus，簡(jiǎn)稱(chēng)RV）是一種雙鏈核糖核酸病毒，屬于呼腸孤病毒科。RV是引起嬰幼兒腹瀉的主要病原體之一，其主要感染小腸上皮細(xì)胞，從而造成細(xì)胞損傷，引起腹瀉。Tokuhara[24]等在水稻種子中特異表達(dá)了輪狀病毒特異的美洲駝重鏈抗體片段的中性可變結(jié)構(gòu)域（MucoRice-ARP1），通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)系統(tǒng)及RNA干擾技術(shù)抑制主要內(nèi)源蛋白的含量來(lái)提高目的蛋白表達(dá)量。純化后每粒種子平均表達(dá)量為種子可溶蛋白的11.9%，種子質(zhì)量的0.85%；小鼠口服實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)基因水稻來(lái)源的MucoRice-ARP1能有效治療和預(yù)防輪狀病毒。

3.7 霍亂毒素B亞基

霍亂毒素是霍亂弧菌產(chǎn)生的外毒素，能引起腹瀉。在轉(zhuǎn)基因水稻中表達(dá)霍亂毒素B亞基（MucoRice-CTB）是一種很好的無(wú)須純化的口服霍亂疫苗。Yuki等[29]通過(guò)使用RNA干擾技術(shù)抑制主要內(nèi)源儲(chǔ)存蛋白，包括13kDa醇溶蛋白和谷蛋白A，將CTB的表達(dá)量提高到了抑制前的6倍。最新研究顯示，研究者們已在一個(gè)封閉的生產(chǎn)體系中建立了符合GMP標(biāo)準(zhǔn)的生產(chǎn)MucoRice-CTB疫苗流程，且可確保疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量[30]。

3.8 不耐熱腸毒素B

腸毒性大腸桿菌可以在小腸中復(fù)制并產(chǎn)生腸毒素，進(jìn)而導(dǎo)致腹瀉。源自腸毒素性大腸桿菌的不耐熱腸毒素B（heat-labile enterotoxin B,LTB），與CTB在結(jié)構(gòu)上相似。Soh等[31]成功在轉(zhuǎn)基因水稻中合成LTB亞基蛋白，其可以與CTB亞基蛋白一同作為聯(lián)合疫苗來(lái)治療霍亂及腹瀉，但其免疫原性和佐劑功能仍需動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)估。

4 水稻胚乳細(xì)胞生物反應(yīng)器在多功能肽生產(chǎn)上的研究

4.1 柳杉花粉蛋白Cryj1以及Cryj2對(duì)應(yīng)的7-抗原決定簇多肽

日本柳杉（Cryptomeria japanica）過(guò)敏性花粉癥是日本最主要的一種過(guò)敏性疾病，柳杉花粉蛋白Cryj1以及Cryj2是主要過(guò)敏原，其抗原決定簇多肽已在大腸桿菌等系統(tǒng)得到表達(dá)。Takagi等[32]在轉(zhuǎn)基因水稻胚乳中成功積累了高濃度的7-抗原決定簇多肽（7Crp）。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，小鼠通過(guò)口服該轉(zhuǎn)基因種子會(huì)對(duì)Cryj1全蛋白免疫，T細(xì)胞相應(yīng)增加并且伴隨有血清免疫球蛋白lgE水平的上升，證明可通過(guò)口服含該T細(xì)胞抗原決定簇多肽的多肽疫苗有效緩解花粉過(guò)敏病的效果。

4.2 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（Transforming growth factor-βs，TGF-βs）屬于調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的TGF-β超家族，是一種多功能肽，可以通過(guò)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)T細(xì)胞來(lái)進(jìn)一步調(diào)節(jié)和維持膳食蛋白的黏膜免疫耐受性。Takaiwa等[33]在轉(zhuǎn)基因水稻種子胚乳中成功以二聯(lián)體分泌蛋白形式表達(dá)了小鼠TGF-β。

4.3 Novokinin

高血壓是一種常見(jiàn)流行病，會(huì)導(dǎo)致諸多危險(xiǎn)發(fā)生。Novokinin（Arg-Pro-Leu-Lys-Pro-Trp,RPLKPW）是一種源自卵清蛋白抗高血壓的有效多肽，有利于血管舒張。Wakasa等[34]通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)成功在轉(zhuǎn)基因水稻種子胚乳中表達(dá)Novokinin。實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)基因水稻中表達(dá)的串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)的novokinin比融合式結(jié)構(gòu)具有更高的活性，但表達(dá)量略低。

5 水稻胚乳細(xì)胞生物反應(yīng)器在非蛋白類(lèi)活性物質(zhì)生產(chǎn)上的研究

除蛋白類(lèi)物質(zhì)外，一些非蛋白類(lèi)生物活性物質(zhì)也可以采用水稻胚乳細(xì)胞生物反應(yīng)器進(jìn)行生產(chǎn)。類(lèi)黃酮是一種廣泛分布于植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有多種促進(jìn)人體健康的功能。Ogo等[35]成功在轉(zhuǎn)基因水稻種子中成功積累了大量的黃酮醇、異黃酮等。液質(zhì)聯(lián)用色譜分析發(fā)現(xiàn)了共82種類(lèi)黃酮，其中包含37種黃酮醇、11種異黃酮以及34種黃酮類(lèi)化合物。實(shí)驗(yàn)表明，通過(guò)水稻種子作為反應(yīng)器不僅可以用于生產(chǎn)黃酮類(lèi)物質(zhì)，還可以擴(kuò)大黃酮類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)的多樣性[36]。

6 問(wèn)題與展望

雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后成功利用水稻胚乳細(xì)胞作為生物反應(yīng)器純化出多種活性蛋白，但除HIys、LF和HSA已在生產(chǎn)中應(yīng)用外，其余都存在表達(dá)水平低和生產(chǎn)成本高的問(wèn)題，導(dǎo)致產(chǎn)業(yè)化困難。已有研究表明，水稻葉片也可以用于生產(chǎn)癌胚抗原等藥用蛋白。因此，轉(zhuǎn)化不同基因，實(shí)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因水稻中的不同組織器官中同時(shí)表達(dá)特異性蛋白可能是解決該問(wèn)題的突破性技術(shù)方法；其次，對(duì)水稻胚乳中藥用蛋白的制備提取和后續(xù)純化也仍需進(jìn)一步的優(yōu)化。

從分子生物學(xué)的角度來(lái)看，目前提高水稻胚乳生物反應(yīng)器活性蛋白產(chǎn)量主要的方法在于提高特異性啟動(dòng)子的啟動(dòng)效率以及信號(hào)肽介導(dǎo)的蛋白質(zhì)表達(dá)積累特異性的增高。

除傳統(tǒng)蛋白之外，一些非蛋白類(lèi)活性物質(zhì)逐漸成為研究亮點(diǎn)。在水稻胚乳中有目的地產(chǎn)生一些對(duì)人類(lèi)健康有益的生物活性物質(zhì)，無(wú)需提純，直接隨餐口服是另一個(gè)研究新方向。

隨著“毒疫苗”等社會(huì)熱點(diǎn)問(wèn)題的不時(shí)出現(xiàn)，公眾對(duì)藥物蛋白和疫苗的安全關(guān)注度逐漸提高。不合格藥物蛋白之所以會(huì)在市場(chǎng)上出現(xiàn)，其中一個(gè)重要的原因是采用傳統(tǒng)方法生產(chǎn)藥物蛋白的產(chǎn)量低而且價(jià)格高，供不應(yīng)求。鑒于水稻胚乳的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，相信在不久的將來(lái)，以水稻胚乳為反應(yīng)器生產(chǎn)的藥物蛋白和疫苗一定會(huì)占有一席之地。

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Progress on Rice Endosperm Cells as a Bioreactor

DING Yi,WEIJihua,ZHANG Ning*,SHU Xiaoli,WU Dianxing
（Department of Applied Bioscience,Zhejiang University,Hangzhou,310029,China;1st author:3110100088@zju.edu.cn;*Corresponding author: 11216028@zju.edu.cn）

Rice endosperm cell is one of the ideal bioreactor for the production of bio-active substances.Research progresses on production of pharmaceutical protein,vaccine,functional peptide and non-protein bio-active substances using rice endosperm as bioreactorwere reviewed in this paper.

rice endosperm bioreactor;pharmaceutical protein;vaccine;functional peptide

S511

：A

：1006-8082（2017）03-0006-07

2017－03－09

轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ?xiàng)（2014ZX08001006）；浙江省水稻育種（2016C02050-6）