芝麻EMS誘變條件優(yōu)化與突變體篩選

王慧麗，張海洋，馬 琴，魏利斌，琚 銘，李 春，段迎輝，苗紅梅

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心，河南鄭州450002）

芝麻EMS誘變條件優(yōu)化與突變體篩選

王慧麗，張海洋，馬 琴，魏利斌，琚 銘，李 春，段迎輝，苗紅梅*

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心，河南鄭州450002）

為明確適于芝麻誘變的最佳甲基磺酸乙酯（EMS）劑量和處理時(shí)間，創(chuàng)制優(yōu)異芝麻突變體，采用0.1%～2.0%EMS浸泡處理芝麻91-0株系種子6～24 h，研究了EMS不同劑量和處理時(shí)間對芝麻突變體創(chuàng)制效率的影響。結(jié)果顯示，0.1%EMS浸種24 h、0.5%EMS浸種24 h、1.0%EMS浸種12 h、1.5%EMS浸種6 h處理芝麻種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率為53.13%～90.17%，根長為0.30～2.00 cm，活力指數(shù)為18.53～131.00，適于芝麻誘變研究。2008—2010年，選用1.0%EMS浸種12 h優(yōu)化條件先后處理芝麻91-0株系成熟種子7萬粒，共獲得M1代植株22 855份，成株率達(dá)到32.65%。對誘變株系及其后代葉型、株型、花器與育性、蒴果及粒型以及其他共5類24個(gè)田間農(nóng)藝性狀的調(diào)查結(jié)果表明，M1、M2代誘變率分別為7.60%、2.78%，M1、M2代株系發(fā)生的主要突變性狀類型均為花器與育性類，比率分別為4.08%、0.93%。對831份突變體后代株系的農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果顯示，后代中可穩(wěn)定遺傳的突變體比率為23.71%，主要突變類型為蒴果及粒型，占總調(diào)查株系的14.80%。研究表明，在1.0%EMS浸泡12 h誘變處理?xiàng)l件下，芝麻91-0株系發(fā)生可遺傳突變的比率為0.80%。

芝麻；甲基磺酸乙酯（EMS）；誘變；突變體庫；頻率

芝麻（Sesamum indicum L.，2n=26）屬胡麻科胡麻屬，是世界上最古老的油料作物之一［1-2］，也是我國重要的特色優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品。我國芝麻年種植面積45萬hm2左右，居世界第4位，平均總產(chǎn)量為62萬t，居世界第3位。2013年我國芝麻平均單產(chǎn)突破1 350 kg/hm2，居世界第1位，在世界芝麻生產(chǎn)和國際貿(mào)易中占有重要地位。但是，相對于糧食及其他油料作物，芝麻仍屬于低產(chǎn)作物。除田間投入不足、管理技術(shù)低等因素外，收獲指數(shù)低、籽粒成熟度不一致、抗病抗逆性差等是限制芝麻生產(chǎn)發(fā)展的主要因素［3-5］。因此，開展高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、適于機(jī)械化生產(chǎn)的新材料創(chuàng)制和新品種選育是當(dāng)前國內(nèi)外芝麻育種工作的重點(diǎn)。

甲基磺酸乙酯（ethyl methanesulfonate，EMS）化學(xué)誘變技術(shù)是當(dāng)前創(chuàng)制作物優(yōu)異新種質(zhì)的一項(xiàng)重要技術(shù)手段。相對于轉(zhuǎn)基因、遠(yuǎn)緣雜交等技術(shù)，EMS化學(xué)誘變技術(shù)操作簡便，易形成點(diǎn)突變，且不易對染色體造成畸變，現(xiàn)已在水稻［6］、玉米［7］、油菜［8］、大豆［9-10］、番茄［11］等作物上廣泛應(yīng)用，對推動(dòng)農(nóng)作物功能基因組學(xué)和新品種選育研究起到了重要作用。近年來，國內(nèi)外學(xué)者先后開展了芝麻EMS誘變研究［12-15］。Begum等［13］比較了0.5%～2.0%MES處理6 h對芝麻M3株系田間表型的影響，結(jié)果表明，0.5%EMS是芝麻最有效的誘變處理劑量。Kumar等［14］采用0.5%EMS處理芝麻，并觀察了芝麻染色體異常和植株發(fā)育影響程度，認(rèn)為0.5%EMS適于誘變芝麻。但目前尚未見有關(guān)大規(guī)模創(chuàng)制芝麻EMS突變體的報(bào)道。為此，以芝麻91-0株系為材料，系統(tǒng)比較了不同EMS劑量和處理時(shí)間對芝麻種子發(fā)育的影響，并對獲得的大批EMS誘變株系進(jìn)行了誘變頻率和突變類型分析，為進(jìn)一步推動(dòng)芝麻種質(zhì)遺傳改良和新品種選育奠定技術(shù)和材料基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料：芝麻91-0株系，為芝麻基因組測序品種豫芝11號(hào)的多代自交純化株系［16-17］，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心保存。該品種為單稈型，株高約165 cm；葉色濃綠，中下部葉片為長橢圓形，有缺刻，上部葉片呈柳葉形；無限花序，每葉腋3花，花期35～40 d，花冠白色，授粉后花冠自然脫落；蒴果二心皮，蒴長3 cm左右，開裂正常；種子長卵圓形，種皮純白色，千粒質(zhì)量2.7～3.0 g，含油量56.38%，生育期80～85 d。EMS誘變劑購自美國Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子萌發(fā)處理與EMS誘變條件優(yōu)化 挑選飽滿健康的91-0株系種子，用清水沖洗種子表面后浸泡2 h。隨后進(jìn)行處理，即0.1%～2.0%EMS溶液（因素A）浸泡6～24 h（因素B），處理后用無菌水沖洗3次，吸水紙吸干種子表面水分后，將種子擺放在鋪有2層濾紙的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，25粒/皿，光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度25℃、光照14 h/d。每日加入適量無菌水，保證芝麻種子正常萌發(fā)。

為確定最適的EMS處理劑量及浸種時(shí)間，試驗(yàn)共設(shè)置15個(gè)處理，EMS質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A1—A5）分別為0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%，清水作對照（A6）。誘變時(shí)間（B1—B3）分別為6、12、24 h。每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)共處理籽粒100粒（4個(gè)培養(yǎng)皿）。每日調(diào)查種子發(fā)芽情況和根長至第7天，計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。

發(fā)芽率=（第7天種子總發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)）× 100%；發(fā)芽勢=（第3天種子總發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)）×100%；發(fā)芽指數(shù)=∑t日的發(fā)芽數(shù)/相應(yīng)的發(fā)芽日數(shù)；活力指數(shù)=發(fā)芽指數(shù)×第7天根平均長度。

1.2.2 誘變M1代種植與觀察 為構(gòu)建芝麻EMS突變體庫，2008—2010年，共處理91-0株系種子7萬粒。5月下旬—6月上旬，將1.0%EMS浸泡12 h后的芝麻種子（M1）播于裝有壤土的營養(yǎng)缽（8cm×8 cm）內(nèi)，每缽種植4粒，覆膜確保種子萌發(fā)正常。3～4周后，將M1材料（2～3對真葉）移栽到試驗(yàn)田，常規(guī)田間管理。分別在苗期、現(xiàn)蕾期、初花期、盛花期及成熟期間調(diào)查植株田間性狀變異情況。成熟后，按單株收獲M1代種子。

1.2.3 誘變M2—M3代種植與觀察 2009—2012年，隨機(jī)挑選無性狀變異的M1后代種子7 978份，按家系進(jìn)行單行條播種植，行長5 m；適時(shí)進(jìn)行間苗、定苗及常規(guī)田間管理，行距40 cm、株距20 cm。各生育期間及時(shí)記錄變異表型特征、變異株數(shù)量及比例，并對每個(gè)突變表型特征拍照。成熟后，按株系分別收獲各單株種子。

1.2.4 不育突變性狀雜交保持 對M1或M2代出現(xiàn)的育性突變株，分別用鄰近或同株行正常株進(jìn)行姊妹交，同時(shí)選用91-0自交株系授粉雜交。第2年種植并調(diào)查育性性狀分離比例，判定性狀是否遺傳。

1.3 田間農(nóng)藝性狀指標(biāo)調(diào)查

田間調(diào)查的方法參照文獻(xiàn)［18-19］，調(diào)查時(shí)期及性狀指標(biāo)包括：（1）苗期：葉色、葉型、莖桿顏色及莖桿茸毛量；（2）花期：每葉腋花數(shù)、花器形態(tài)、顏色、雌蕊數(shù)、雄蕊數(shù)及育性；（3）成熟期：株型、株高、節(jié)間長度、蒴果形態(tài)、蒴果長寬度、蒴果茸毛量、蒴果顏色、心皮數(shù)、裂蒴性、生育期長短及發(fā)育進(jìn)程；（4）收獲期：單蒴粒數(shù)、千粒質(zhì)量、種皮色。

EMS誘變農(nóng)藝性狀可遺傳突變率=（成苗株數(shù)/處理種子數(shù)×100）×（M1代發(fā)生誘變率+M2代發(fā)生誘變率）×突變性狀可遺傳比率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和SPSS 22.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同EM S劑量和誘變時(shí)間處理下芝麻種子的萌發(fā)情況

表1顯示，清水處理下，芝麻種子萌發(fā)正常，生長活力較強(qiáng)，發(fā)芽勢為89.63%～94.02%，發(fā)芽率達(dá)到93.56%～98.20%，根長為5.29～6.20 cm，活力指數(shù)為451.13～551.33。當(dāng)EMS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%時(shí)，隨著處理時(shí)間延長，種子萌發(fā)受抑制程度逐漸增大。其中，處理6 h（A1B1），種子萌發(fā)率為97.65%，根長為5.3 cm，活力指數(shù)為506.73；處理12 h（A1B2），雖然種子萌發(fā)率仍較高（98.67%），但根長降低為2.97 cm，活力指數(shù)下降至274.50；處理24 h（A1B3），種子萌發(fā)率顯著降低（為71.09%），根長及活力指數(shù)進(jìn)一步下降，分別為2.00 cm和131.00。當(dāng)EMS質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高至2%時(shí)，種子發(fā)芽勢均為零；種子發(fā)芽率較低，并接近或達(dá)到零（0.00～24.00%）；根長和活力指數(shù)顯著受到抑制。當(dāng)EMS質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.5%、1.0%、1.5%，各處理6、12、24 h時(shí)，9個(gè)處理的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、根長及活力指數(shù)4個(gè)指標(biāo)或部分指標(biāo)也表現(xiàn)出了顯著差異。結(jié)果表明，0.1%/ 24 h（A1B3）、0.5%/24 h（A2B3）、1.0%/12 h（A3B2）和1.5%/6 h（A4B1）處理下，種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率在53.13%～90.17%，根長為0.30～2.00 cm，活力指數(shù)為18.53～131.00，可作為芝麻EMS處理半致死篩選的適宜條件。鑒于芝麻籽粒小、種子萌發(fā)易受大田環(huán)境影響等因素，同時(shí)考慮試驗(yàn)時(shí)間，本試驗(yàn)從A1B3、A2B3、A3B2和A4B1處理?xiàng)l件中優(yōu)先選擇了1.0% EMS浸種12 h，用于后續(xù)的芝麻EMS突變體庫構(gòu)建。

2.2 EM S誘變芝麻M1代農(nóng)藝性狀突變類型及頻率

2008—2010年，采用1.0%EMS/12 h條件，共處理91-0株系芝麻種子7萬粒。通過營養(yǎng)缽播種、大田移栽，共獲得EMS誘變處理材料22 855株，成株率為32.65%。分別在幼苗、現(xiàn)蕾、盛花、成熟及收獲期，系統(tǒng)調(diào)查M1各植株的葉型（葉色、葉形）、株型（成熟莖桿色、莖桿茸毛量、莖稈類型、株高、節(jié)間長度）、花器與育性（每葉腋花數(shù)、花器形態(tài)、顏色、雌蕊數(shù)、雄蕊數(shù)及育性）、蒴果及粒型（蒴果形態(tài)、顏色、大小、茸毛量、心皮數(shù)、裂蒴性、蒴粒數(shù)、千粒質(zhì)量及種皮色）及其他表型（生育期長短、發(fā)育進(jìn)程）等5類24個(gè)田間農(nóng)藝性狀（表2）。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，在22 855個(gè)M1代植株中，共有1 736株表現(xiàn)出了田間性狀變異，變異率為7.60%。在5類突變性狀中，花器與育性為主要突變類型，占總株數(shù)的4. 08%，其次是蒴果及粒型，突變比率為1.59%。

2.3 EM S誘變M2代農(nóng)藝性狀突變類型及頻率

為分析隱性EMS誘變特征，2009—2012年，隨機(jī)選取了M1代表現(xiàn)正常的7 978份植株，按家系單行條播種植，并進(jìn)行了M2株系調(diào)查；共篩選出了突變株系222份，變異頻率為2.78%（表2）。在M2株系中，突變的主要農(nóng)藝性狀類型仍為花器與育性，占總調(diào)查株系的0.93%。如花序有限（DS899）、密蒴短節(jié)（Dw607）、花冠瓣?duì)睿⊿i CP412）等突變類型（圖1d、e）。其次是葉型（0.86%），如杯型葉（Si CC045）、葉片黃化（Si AS31216）等突變類型（圖1b、c）。

2.4 EM S突變體農(nóng)藝性狀可遺傳概率分析

為進(jìn)一步明確上述突變類型是否具有遺傳性和穩(wěn)定性，從具有表型突變的M1、M2株（系）中隨機(jī)挑選了831個(gè)突變株（系），系統(tǒng)調(diào)查其M2或M3后代的突變性狀（表2）。結(jié)果顯示，在831個(gè)M2、M3突變株系中，共有197個(gè)株系穩(wěn)定遺傳了突變性狀，穩(wěn)定突變的比率為23.71%。主要突變類型為蒴果及粒型，占總調(diào)查株系的14.80%，包括蒴果多棱（心皮數(shù)大于2）、大蒴、小蒴、大粒及小粒等變異類型（圖1h、i）。結(jié)果表明，采用EMS誘變技術(shù)可以創(chuàng)制豐富的芝麻突變體。

根據(jù)上述誘變成株率（32.65%）、M1發(fā)生誘變率（7.60%）、M2代發(fā)生誘變率（2.78%）以及突變性狀可遺傳比率（23.71%）計(jì)算確定，在1.0%EMS浸泡12 h誘變處理?xiàng)l件下，91-0株系籽粒后代發(fā)生可遺傳突變率為0.80%，即從理論上講，每處理1萬粒芝麻種子，獲得可穩(wěn)定遺傳的葉型等性狀突變體的數(shù)量為80份。

3 結(jié)論與討論

EMS誘變技術(shù)是應(yīng)用最為廣泛的農(nóng)作物育種技術(shù)之一。目前育種家們利用EMS誘變已成功創(chuàng)制出了大批具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、早熟、矮桿、抗病、抗逆等優(yōu)良農(nóng)藝性狀的農(nóng)作物新種質(zhì)［20］。本研究在明確適于芝麻的最佳EMS誘變條件基礎(chǔ)上開展大規(guī)模EMS誘變處理，首次構(gòu)建了芝麻EMS突變體庫。在1.0%EMS浸泡12 h誘變處理?xiàng)l件下，91-0株系后代發(fā)生誘變株系的可遺傳突變率為0.80%?？梢哉J(rèn)為，芝麻是較適于采用EMS技術(shù)創(chuàng)制優(yōu)異新種質(zhì)的物種。本研究獲得了22 855個(gè)芝麻誘變株系，初步獲得M1突變體1 736份，M2突變體222份；已確定可穩(wěn)定遺傳的突變體197份，為芝麻種質(zhì)創(chuàng)新、新品種選育以及功能基因組學(xué)研究提供了寶貴材料。目前創(chuàng)制出的花序有限型（DS899）和密蒴短節(jié)型（Dw607）突變體，已成功用于我國首批適于機(jī)械化生產(chǎn)的芝麻新品種選育（新品種權(quán)公告號(hào)：CNA013391E、CNA013392E），為推動(dòng)芝麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)的材料基礎(chǔ)。

大量研究結(jié)果表明，EMS誘變劑量對誘變材料的獲得和篩選具有重要影響。在誘變劑量選擇過程中，一般多以處理后植株存活一半的劑量即半數(shù)致死劑量（LD50）作為誘變敏感性指標(biāo)［21］，但不同作物選用的EMS劑量和處理?xiàng)l件不盡相同。在小麥、擬南芥突變體庫構(gòu)建過程中，通常以降低苗高10%～ 30%的EMS質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為適宜劑量［20］；盧銀等［21］選用0.4%EMS浸泡16 h條件構(gòu)建大白菜突變體庫，M2群體中變異頻率最高達(dá)到了25.65%；在1.0% EMS處理下，甘藍(lán)型油菜的幼苗致死率接近50%［8］，而石從廣等［22］則認(rèn)為，1.2%EMS對誘導(dǎo)油菜發(fā)生大量突變最為有利。芝麻EMS誘變研究中，多選用低質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.5%～1.0%）進(jìn)行EMS誘變處理［23］。采用5 g/L EMS處理8 h后，芝麻91-0的發(fā)芽率高于50%；進(jìn)一步增加處理時(shí)間或者劑量，其發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和種子活力則急劇下降［24］。本研究中，1.0%EMS浸種浸種12 h和1.5%EMS浸種6 h均是導(dǎo)致芝麻致死的臨界條件，在兩處理?xiàng)l件下，芝麻種子活力指數(shù)分別為46.47和18.53，與對照及致死處理的結(jié)果均有顯著差異。大規(guī)模誘變及誘變株農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果顯示，在1.0%EMS浸種12 h處理?xiàng)l件下，芝麻M1和M2代的農(nóng)藝性狀突變率分別為7.60%和2.78%，突變性狀在后代中仍可穩(wěn)定遺傳的比率為23.71%。表明采用1.0%EMS浸種12 h可成功獲得大量穩(wěn)定遺傳的芝麻突變體。同時(shí)也應(yīng)看到，在構(gòu)建的芝麻誘變體庫中，部分株系的突變性狀在后代中未能得到穩(wěn)定遺傳，這可能與EMS生理損傷、調(diào)查群體大小、突變位點(diǎn)特征以及突變性狀調(diào)控的復(fù)雜性等因素有一定關(guān)系［20，25］。

受工作量大等因素限制，本研究僅分析了部分重要農(nóng)藝性狀，調(diào)查指標(biāo)涉及葉型、株型，花器、蒴果及生理等農(nóng)藝性狀，有關(guān)抗?。ㄖヂ榭菸『颓o點(diǎn)枯病）、抗逆（干旱、耐漬等）、品質(zhì)（籽粒含油量、蛋白含量、木酚素含量）等重要性狀的突變比率尚待分析和公布，而這些性狀對全面評價(jià)芝麻EMS誘變體系及突變規(guī)律將具有重要作用。除創(chuàng)制優(yōu)異種質(zhì)外，利用誘變技術(shù)構(gòu)建飽和突變體庫也是開展作物功能基因組研究的重要途徑［25］。目前，芝麻基因組計(jì)劃已全面完成，高質(zhì)量芝麻基因組精細(xì)圖的構(gòu)建為大規(guī)模開展芝麻功能基因研究提供了技術(shù)平臺(tái)［17］，芝麻突變體庫的構(gòu)建則為快速推動(dòng)芝麻功能基因組學(xué)研究提供了材料基礎(chǔ)。因此，今后將繼續(xù)開展芝麻EMS誘變創(chuàng)制，以進(jìn)一步豐富芝麻突變體庫；同時(shí)，將深入開展芝麻突變體庫基因突變位點(diǎn)分布和誘變機(jī)制研究，以加快我國和世界芝麻遺傳育種研究進(jìn)程。

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Optimization of EMSMutagenesis Condition and Screening of Mutants in Sesame

WANG Huili，ZHANG Haiyang，MA Qin，WEI Libin，JU Ming，LIChun，DUAN Yinghui，MIAO Hongmei*
（Sesame Research Center，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China）

In order to clarify the effects of EMS concentration and treat duration on sesame mutation efficiency，seeds of sesame line 91-0 were immersed in EMS solution with various concentrations from 0.1%to 2.0%for 6—24 h.The results showed that the treatments with 0.1%EMS for 24 h，0.5%EMS for 24 h，1.0%EMS for 12 h and 1.5%EMS for 6 h were appropriate for sesame mutagenesis.Under the above treatment conditions，the seed germ ination potential and the germination rate ranged from 53.13%to 90. 17%，the root length varied from 0.30 cm to 2.00 cm，the average vigor index varied from 18.53 to 131. 00.To obtain abundantmutants，70 000 seeds of line 91-0 were treated under the optimal condition of 1. 0%EMS for 12 h during 2008—2010.As a result，22 855 mutated lines were harvested with the p lant generation ratio of 32.65%.During themutagenesis investigation，24 agronomic traits related to five groups of traits，i.e.leaf type，p lant type，flower and fertility，capsule and seed characters and other physical traits for sesame were app lied.Investigation results indicated that the mutation frequencies in M1and M2generation were 7.60%and 2.78%，respectively.For M1and M2populations，flower and fertility were the top mutation trait type with the high ratios of 4.08%and 0.93%，respectively.Further observation of 831 mutants random ly selected from the EMSmutant library reflected that 23.71%mutants stably descented the mutation traits in the progenies.The top mutated trait of the mutation type was capsule and seed characters，occupying for 14.80%of the total investigated lines.Morphological variation results predicted that the mutation frequency of line 91-0 reached 0.80%under 1.0%EMS for 12 h induction condition.

sesame（Sesamum indicum L.）；ethyl methanesulfonate（EMS）；mutagenesis；mutant library；frequency

S335.3；S565.3

A

1004-3268（2017）01-0036-06

2016-08-02

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（芝麻）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-15）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31301653，31471537）；河南省科技創(chuàng)新人才計(jì)劃項(xiàng)目（164200510001）；河南省重大科技專項(xiàng)（151100111200）

王慧麗（1980-），女，河南鄲城人，助理研究員，本科，主要從事芝麻遺傳育種研究。E-mail：273778144@qq.com

*通訊作者：苗紅梅（1974-），女，河南永城人，研究員，博士，主要從事芝麻遺傳育種與病害基礎(chǔ)研究。E-mail：miaohongmeichina@yahoo.com